尿液miR-548y在多发性骨髓瘤疾病中的应用的制作方法

尿液mir-548y在多发性骨髓瘤疾病中的应用
技术领域
1.本发明涉及尿液mir-548y的新用途，具体涉及尿液mir-548y在制备用于多发性骨髓瘤相关检测制剂中的应用。
2.

背景技术：

3.多发性骨髓瘤（multiple myeloma, mm）属于b细胞恶性肿瘤，临床表现与多种因素有关，例如肿瘤压迫脊髓，细胞因子导致贫血，骨损伤引起疼痛，蛋白沉积肾脏导致肾损伤等。尿常规检测出现尿蛋白、红细胞、白细胞、管型，甚至出现慢性肾功能衰竭、高磷酸血症、高钙血症、高尿酸血症等，患者经常首诊于肾内科而贻误了治疗时间。因此寻找更为有效、无创的诊断指标有助于肿瘤的早期诊断和监测。
4.mirna是一类小非编码单链rna，约22个碱基长度。自1990年发现以来，已发现人类存在的mirna约有2500种。mirna参与了多种疾病的生理及病理过程，包括细胞分化、血管生成、凋亡、肿瘤发展、转移、药物抵抗等。识别mirna表达改变具有重要价值，如果将mirna的特定特征与正常生理病理状态相结合，可有望作为疾病早期标志物或疾病严重程度的生物标记物。
5.越来越多的研究证明mirnas参与了mm的发生、发展，它们不仅可用于mm诊断，还可用于疾病分层、预后评估及疗效判断。人类mir-548基因家族成员目前已知有80个。mir58q在肾细胞癌过度表达，通过阻断ilt2，增强nk细胞介导的hla-g依赖性细胞毒性，控制免疫效应细胞活性。本研究中结果显示mir-548y靶基因有24个，分别参与mapk、ras、pi3k-akt、hippo 等信号通路，这些信号通路失调与癌症，包括mm的发生有关。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种尿液mir-548y在制备用于多发性骨髓瘤相关检测制剂中的应用。
7.优选地，所述尿液mir-548y的核苷酸序列如seq id no.1所示（ggcaaaaaca gugauuac）。
8.优选地，所述尿液mir-548y在多发性骨髓瘤患者中低表达。
9.优选地，所述制剂为多发性骨髓瘤患者尿液mir-548y检测试剂盒。
10.优选地，所述试剂盒包括反转录系统、扩增系统和定量内参标准化系统，其中，所述扩增系统由实时荧光定量pcr反应体系组成，所述实时荧光定量pcr反应体系包含能够与mir-548y反转录产物特异性结合的扩增引物、cdna、rnase-free水和sybr green聚合酶链式反应体系。
11.优选地，所述反转录系统由反转录体系试剂组成，其中，所述反转录体系试剂包括逆转录酶缓冲液、逆转录引物、逆转录酶。
12.优选地，所述定量内参标准化系统由内参引物组成。
13.发明人首先收集了正常健康体检组和多发性骨髓瘤患者的尿液标本，离心后取上清，采用mirneasy kit试剂盒提取rna，使用agilent human, release 21.0 (8*60k, design id: 070156)分析mm和正常对照组mirna差异表达， feature extraction software (version10.7.1.1, agilent technologies)获取图像和原始数据，genespring software (version 13.1, agilent technologies)进行分析。采用层次聚类的方法来显示样本间可区分的mirna表达模式，利用mirwalk 3.0和mirdb 6.0数据库，对筛选出的差异mirna进行靶基因预测。用student's t检验计算fold change和p值，筛选差异表达的mirnas。上调和下调基因的阈值设置为fold change >2.0，p<0.05具有统计学意义。
14.本发明通过研究证实与正常对照组相比，尿液mir-548y在多发性骨髓瘤患者的尿液中低表达，并在mm初诊组、复发组、缓解组均较正常对照显著减低。
15.roc曲线分析显示mir-548y产生的auc 0.924 (p=0.000, 95% ci: 0.779-1.000) ，cutoff = 0.824, 灵敏度、特异度可达91.7% 、100%。从而提出检测尿液mir-548y可用于多发性骨髓瘤疾病的检测、监测或辅助诊断。
16.进一步，发明人将mir-548y与临床参数进行相关性分析，包括血红蛋白 (hemoglobin, hb), 血小板 (thrombocytes, plt)、白蛋白(albumin, alb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, ldh)、血肌酐(creatinine, cr)、尿酸、血β2-微球 (β2-microglobulin, β2-mg)、c反应蛋白 (c-reactive protein, crp)、免疫球蛋白igg (immune globulin, igg)、免疫球蛋白 (igg iga igm) 和尿轻链（κ λ）。mm 患者, mir-548y与尿轻链（κ λ）呈负相关(r =
ꢀ-
0.493 p = 0.011)。
17.本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测白蛋白及其多肽片段。
18.为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
19.图1是qrt-pcr分析mir-548y在正常对照组、mm初诊组、复发组、缓解组患者尿液样本之间的差异表达。
20.图2是roc曲线分析mir-548y在mm中的诊断价值。
21.图3是mm患者尿液中mir-548y与尿轻链（κ λ）的相关性分析。
具体实施方式
22.实施例1 尿液标本的收集与处理收集2017-2019年首都医科大学附属北京世纪坛医院住院的多发性骨髓瘤（mm）病例，其诊断分别符合美国国立综合癌症网络（nccn）标准。正常对照组（hc）为健康体检者。尿液收集后，400
×
g离心5min，取上清，rnase-free管分装，-80℃冻存。研究对象的临床特征见表1所示。
23.实施例2 mirna检测及生信分析采用mirneasy kit (qiagen, germany)试剂盒，按照厂家说明进行提取。取微量rna提取液，用nanodrop nd-2000 (thermo scientific)定量，计算rna浓度。rna>100ng方可进行后续芯片检测。使用agilent human, release 21.0 (8*60k, design id: 070156)分析mm和正常对照组mirna表达，样本标记、杂交、水洗步骤根据厂家说明完成。feature extraction software (version10.7.1.1, agilent technologies)获取图像和原始数据，genespring software (version 13.1, agilent technologies)进行分析。采用层次聚类的方法来显示样本间可区分的mirna表达模式。利用mirwalk 3.0和mirdb 6.0数据库，对筛选出的差异mirna进行靶基因预测，最终获取这2个数据库中交集的靶基因进行后续go和kegg分析。
24.用student's t检验计算fold change和p值，筛选差异表达的mirnas。上调和下调基因的阈值设置为fold change >2.0，p<0.05具有统计学意义。在生物信息学分析中，利用fisher精确检验计算go条目的富集显著性，利用超几何分布计算kegg pathway中每个pathway与本次差异基因的关联度。在pcr验证，各组间用unpaired t检验比较单个mirna的表达水平。采用受试者工作曲线（roc）计算曲线下面积（auc）计算差异mirna诊断的灵敏性、特异性。通过spearman双变量t检验，评价mirnas与血清指标的相关性，通过kaplan meier方法计算mm患者pfs。p<0.05具有统计学意义。采用spss 22.0对数据进行统计分析。通过研究发现，与正常对照相比，尿液mir-548y在mm组表达下调，差异具有显著性。
25.实施例3 实时荧光定量pcr (qrt-pcr)检测按照说明书使用trizol试剂(invitrogen, 15596018)从尿液中提取总rna。使用poly (a)聚合酶(neb, m0276l)，将poly (a) tail添加到rna的3 '端。加入引物和逆转录酶
(vazyme r223-01)，用1μg总rna合成循环dna合成第一链，snrna u6做内参。mirna的相对表达量用2-δct.计算，表达倍数用2-δδct.计算。
26.发明人采用qrt-pcr技术，在27例mm（包括初诊12例、复发6例、缓解9例），12例正常对照者中对筛选出的mirna进行验证。与正常对照相比，mir-548y在mm初诊组、复发组、缓解组均较正常对照显著减低（p < 0.05），但是各组间无显著差异（p > 0.05）。
27.进一步，发明人检测了mm和正常对照者尿液中mir-548y的表达，建立roc曲线，曲线下面积为0.778，如图3所示，反应尿液mir-548y的灵敏度和特异度均较好。
28.实施例4 mir-548y与临床参数的相关性分析mir-548y与临床参数进行相关性分析，包括血红蛋白 (hemoglobin, hb), 血小板 (thrombocytes, plt)、白蛋白(albumin, alb)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, ldh)、血肌酐(creatinine, cr)、尿酸、血β2-微球 (β2-microglobulin, β2-mg)、c反应蛋白 (c-reactive protein, crp)、免疫球蛋白igg (immune globulin, igg)、免疫球蛋白 (igg iga igm) 和尿轻链（κ λ）。mm 患者, mir-548y显示与尿轻链（κ λ）呈负相关(r =
ꢀ-
0.493 p = 0.011)。
29.虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。