一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用的制作方法

no.4所示。该多酚氧化酶由基因拼接和酶突变株的高通量筛选后确认，具有耐温域广，高温催化性能强，功能酶由单一肽段构建，易于膜固定化等优点。
8.本发明的第二方面提供了所述多酚氧化酶yhl21在枯草芽孢杆菌菌株168中开展重组表达及分泌生产的方法。
9.具体的，采用芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168生产重组多酚氧化酶时，包括步骤：将枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168作为宿主细胞，进行转化、发酵培养，收集细胞培养上清，并分离获得游离的多酚氧化酶。
10.进一步地，将质粒pmk
‑
yhl21转化至枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168的细胞中，获得含有质粒的重组枯草芽孢杆菌，将该重组枯草芽孢杆菌用于表达多酚氧化酶。
11.进一步地，将含有表达质粒pmk
‑
yhl21的枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168质粒进行摇瓶或发酵罐培养，在培养结束时，收集上清分泌物，获得游离的多酚氧化酶。
12.进一步地，将分离的含有多酚氧化酶的上清用于含苯酚及对氯苯酚的污染物的降解，重组表达生产的yhl21可高效地降解相应的有机污染物。
13.所述质粒pmk
‑
yhl21的序列如seq id no.7所示。
14.本发明的第三方面提供了一种利用聚偏氟乙烯（以下简称为pvdf）膜进行膜表面固定化重组多酚氧化酶的方法，该膜酶复合体系可稳定高效地降解水溶液中的苯酚、对氯苯酚等有机物。
15.所述的重组多酚氧化酶为表达于枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168的yhl21。
16.进一步地，所述方法包括：测定重组表达的yhl21的浓度后，以10毫克重组蛋白yhl21每平方分米的pvdf膜的比例进行酶
‑
膜的固定化，常温下完成酶
‑
膜的结合与固定化。
17.进一步地，所述方法包括：将结合了10毫克重组蛋白yhl21的pvdf膜置于含有有机污染物的水体中，开展污染物的降解、固定化酶的降解性能及稳定的测定。
18.进一步地，所述的污染物种类包括苯酚、对氯苯酚。
19.进一步地，所述的测定溶液的反应温度为30℃
‑
80℃。
20.进一步地，所述的苯酚或对氯苯酚的浓度为5 mg/l
‑
200 mg/l。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过基因拼接开展酶工程优化，得到了一种高效的酚类污染物降解的多酚氧化酶，利用枯草芽孢杆菌进行了重组分泌表达，并利用pvdf进行了酶的固定化，提升了酶的催化效率。为水体酚类化合物的降解进行了提供了酶来源的生产方法，也提供了多酚氧化酶的催化应用方法。
22.本发明中所用的枯草芽孢杆菌菌种bacillu subtilis 168的来源信息如下：菌株名称：bacillu subtilis 168原始来源： atcc
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catalog no. 23857
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。
附图说明
23.图1为质粒pmk
‑
yhl21的结构示意图。
24.图2为酶工程操作后发现的5株具有酶活的突变体的活性测定结果。
25.图3为多酚氧化酶重组表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
26.图4为膜固定化及游离yhl21对苯酚及对氯苯酚的降解。
具体实施方式
27.本发明具体实施方式有以下理解，即，本发明的保护范围不局限于下列所述特定的具体实施方案；本发明实施例中所用术语是为了描述特定的具体实施方案，而非为了限制本发明的保护范围；下列所述实施例中未注明的其它试验方法或实验条件，按照各制造商所建议的实施方法。
28.实施例中给出相应的数值范围时，应理解为，除非另有所述的说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。进一步，除非另有定义，本发明中使用的相应的技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。此外，除了实施例中公开的具体方法、设备、材料及使用条件外，根据本技术领域的技术人员对相应技术的掌握及本发明公开的记载，还可以使用与以下发明实施例中所述的方法、设备、材料及使用条件类同或等同的涉及本技术的其它方法、设备和材料来实现本发明。
29.除非另有说明，本发明中所公开的实验方法、条件、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学、蛋白质研究、发酵培养、重组表达等技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；methodsinenzymo
‑
logy，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
30.实施例1多酚氧化酶的拼接突变及多酚氧化酶突变株的筛选1）多酚氧化酶基因的拼接以来自环境土壤样品宏基因组为dna模板，利用设计的多酚氧化酶引物进行扩增，所述引物分别为seqidno.1以及seqidno.2，pcr扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳，将条带大小为1200
‑
2000bp之间的dna产物切胶，并利用试剂盒进行dna回收，再利用分子生物学技术将截取的pcr产物池（dnapool）连接到thermofisherpet101topo质粒系统中，然后转化到大肠杆菌bl21
‑
de3中，涂板，过夜生长，得到具有抗性的阳性克隆；挑取20个左右的大肠杆菌单克隆，接种到3毫升液体培养基中，利用过夜培养的大肠杆菌细胞进行质粒提取。提取的质粒通过xmai酶切鉴定出阳性克隆。再将得到的阳性克隆混合，加入xmai和bamhi进行dna酶切，同时加入0.01u的tsp509i(neb内切酶)，37℃酶切约1小时，然后65℃灭活20min，再加入t4dna连接酶，常温处理1小时，将连接液转化到大肠杆菌bl21
‑
de3中，涂板，过夜生长，得到具有抗性的阳性克隆。
31.2）多酚氧化酶拼接基因的表达及酶活测定挑取288个得到的阳性克隆，分别接种到lb液体培养基（每升含有10克nacl，10克胰蛋白胨，5克酵母提取物）中，细胞密度在1.0左右时，加入１mmiptg进行蛋白表达的诱
导，16℃,24小时，细胞破碎取上清进行多酚氧化酶性能的鉴定。活性的测定以abts为底物，多酚氧化酶和2,2
′‑
连氮
‑
双（3
‑
乙基苯并噻唑
‑6‑
磺酸）发生反应时生成的阳性自由基在420nm处有最大吸收峰，利用酶标仪检测多酚氧化酶与底物反应3min前后的吸光度来计算多酚氧化酶酶活。以下2,2
′‑
连氮
‑
双（3
‑
乙基苯并噻唑
‑6‑
磺酸）取其英文简称，即abts，取100μl含酶的裂解上清，100μl1.0mol/labts以及200μl0.1m磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲液；酶活（u/l)计算公式为：酶活=106×
v
总
×
δ
od
/(ε
×
v
酶
×
δt
×
d），ε为abts吸光系数36000l/(mol
·
cm)，v总代表多酚氧化酶酶活测定反应体系的总体积，v酶代表添加酶液的体积，d为检测液体光径，t为反应时间，将每分钟催化1.0μmol/l底物氧化所需的酶量定义为一个酶活力单位。从挑取的30个克隆中，约有5株阳性克隆菌中产生的多酚氧化酶突变体具有明显的多酚氧化酶活性，由图2可见，其中1株的产生的多酚氧化酶突变体的酶学活性为其余4株的酶的催化活性的10倍以上，来自该株的多酚氧化酶突变体被定义为yhl21。
[0032] ３）yhl21的dna序列鉴定提取表达质粒，对插入的dna片断进行序列测定，拼接完成后的序列如seqidno.3所示。
[0033]
其所编码的多肽序列如seqidno.4所示，具体为：mkkllvgtilagvvaigaacsnstshssmqghdmsnmniekenttkysskqlplatktkvlsgkefyltakeallqindkvklpvytyngsvpgpqirvkqgdrviihfkndlpepttihwhgypvpnsqdgypeawfskdfeqtgpyfkrevyhypnqqrgailwyhdhamaltrlnvyaglvgayiihdpkekrlklpsdeydvpllitdrainedgslfypsapenpspslpnpsivpafcgetiltingkaypdtaplfvrygervrirlgnvsmdshpmhfhghdfivtavdgnpipmmarlkrntinvapgetwnieflannpgnwvfhchkphhttnahamggmggmltviryarlfs。
[0034] 实施例2多酚氧化酶的枯草芽孢杆菌的重组表达为了降低多酚氧化酶的表达和纯化成本，通常可以将外源蛋白导入微生物宿主细胞进行分泌表达，常用的分泌型细菌表达宿主主要有枯草芽孢杆菌。为此，对编码多酚氧化酶yhl21的dna序列seqidno.3进行密码子优化，得到优化后的yhl21基因序列如seqidno.5所示。该dna片段与用于枯草芽孢杆菌重组表达的pxyla启动子片段进行融合，得到完整的表达阅读框（seqidno.6）。seqidno.6所示的序列经基因合成，再通过ecori酶切后插入质粒pmk4中，得到表达质粒pmk
‑
yhl21，其序列seqidno.7。构建的重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168中，筛选得到重组菌株168/pmk
‑
yhl21。质粒pmk
‑
yhl21示意图如图1所示。
[0035] 实施例3重组多酚氧化酶的重组生产、固定化及人工含酚废水的降解以重组菌株168/pmk
‑
yhl21，开展摇瓶培养：用接种环挑取枯草芽孢杆菌菌株168/pmk
‑
yhl21，接种到装3mllb的试管，37℃，200r/min摇床过夜培养。将过夜培养的生产菌以1%的接种量接种到装有100ml液体lb培养基的500ml摇瓶中，培养基中加1g/l的木糖、50ul的100μg/ml的氨苄抗生素以及终浓度为0.1mm的cuso4溶液，保持微耗氧过程220r/min振荡培养72h进行发酵培养。培养后期补加10g/l(nh4)2po4以及10g/l甘油。发酵后离心分离细胞和上清，发酵过程中每12h取样进行酶活测定，测定方法见实施例1。发酵上清取5μl作为样品开展聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3中（a）所示，相比没有木糖诱导的发酵培养，木糖高效地诱导表达了多酚氧化酶的合成，并分泌到胞外，而由于
yhl21的肽段缺乏明显的分泌信号肽，因此可能是枯草芽孢杆菌的非经典分泌方式介导了重组蛋白的分泌生产。
[0036]
为了有效地将yhl21固定到pvdf膜表面，并用于污染物的降解，首先将膜内置于聚丙烯四通组件中，该组件内置约1平方分米的pvdf膜，连接蠕动泵后，将10 mg左右的含有yhl21的液体样品（约50毫升）以10毫升/分钟的速度循环通过自制组件，如图3中（b）所示，约20分钟后，检测流出液中的蛋白浓度和酶活，确认绝大多数的多酚氧化酶已结合至组件内的膜上。利用完成的膜
‑
酶组件和含有10毫克的游离的重组酶组份，对1升分别含有或对氯苯酚的模拟污水进行降解性能检测，检测中以20毫升/分钟的速度循环通过自制组件，结果如图4所示， 膜结合的四通组件能够在4小时内持续稳定的降解苯酚，如图4所示，在4 h左右，固定化的酶可以将50 mg/l的苯酚经循环处理，降解至8.4 mg/l；而50 mg/l的对氯苯酚经循环处理，降解至4.4 mg/l，降解率超过90%；相比之下，游离酶只在初始的1.0
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1.5小时内可以有效地催化，之后便基本失去降解功能。因此，pvdf膜对多酚氧化酶的固定化可以大大提高酶的稳定性和降解效率。
[0037]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。