一种利用水杨酸检测和提高植物对死体营养型病原的抗性的方法与流程

2-三硝基苯肼自由基和羟自由基的能力越强，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老和癌症的发生。除此之外，有临床研究表明，怀菊花中的多糖(cmja0s2)对胰腺癌panc-1细胞的生长有显著的抑制作用；怀菊花水提取物对大鼠有降血压的作用，并对冠心病的治疗有显著的效果。正是怀菊花有这样重要且广泛的保健和药用价值，人们经常用它泡茶、做点心、安眠枕等等。所以，怀菊花是一种集观赏、药用、食用和保健等多种功能为一身的稀有菊花。
5.但是，怀菊花主要通过扦插繁殖，对于怀菊花生产，这种方法虽然有效，但怀菊花极其容易受到多种真菌、细菌和病毒的感染。经过实验室前期多年调查发现，在多种病原菌导致的病害中，以黑斑病最为严重，主要危害菊花的叶片，严重的会导致菊花整株枯死，这对怀菊花的生产、销售，尤其出口带来很大的威胁。由病害引起的怀菊花种质退化、产量下降、品质降低，已成为怀菊花生产上的一个突出问题。
6.随着社会的发展和生活水平的提高，人们的需求也要求越来越高，怀菊花是集观赏、药用、保健、食用、茶用等多种功能为一身的名贵品种，其应用之广泛，市场之广阔。但因病害严重而导致其产量下降、品质降低，严重限制了怀菊花的生产、销售等多种问题，因此，解决怀菊花的病害问题迫在眉睫。
7.为了解决怀菊花生产中的病害问题，本发明人经过深入研究发现，sa处理居然能够提高怀菊花对链格孢属(alternaria)的交链孢菌(a.sp.)这种死体营养型病原菌产生显著的抗性，由此完成了本发明。


技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本发明在第一方面提供了一种检测植物对死体营养型病原的抗性的方法，所述方法包括：
9.(1)采用死体营养型病原对植物进行接种；
10.(2)测量水杨酸的含量；
11.(3)测量选自由pod、pal、ppo、apx、glu和cht组成的组的酶的活性；
12.(4)测量该植物的选自由tga1、tga5、pr5、sod、pod、pal、apx、cht和glu组成的组的蛋白的基因相对表达量；
13.(5)根据水杨酸含量、所述酶的活性和所述蛋白的基因相对表达量，判断该植物对死体营养型病原的抗性。
14.优选的是，接种死体营养型病原的植物的水杨酸含量、所述酶的活性和/或所述蛋白的基因表达量出现统计学显著性(例如在p<0.05的水平上，优选在p<0.01的水平上)增加时，认为该植物对该死体营养型病原具有抗性。
15.另外优选的是，在步骤(2)中，测量由pod、pal、ppo、apx、glu和cht组成的组的至少两种酶、优选至少三种酶、更优选至少四种酶、进一步优选至少五种酶、最优选所有的酶的活性变化。
16.另外优选的是，在步骤(2)中，测量由tga1、tga5、pr5、sod、pod、pal、apx、cht和glu组成的组的至少两种蛋白、优选至少三种蛋白、更优选至少四种蛋白、进一步优选至少五种蛋白、最优选所有的蛋白的基因相对表达量。
17.另外优选的是，所述植物为菊科植物，优选为菊花(chrysanthemum)，更优选为怀
菊花(chrysanthemum morifolium ramat.
‘
huaihuang’)。
18.另外优选的是，所述死体营养型病原为链格孢属(alternaria)病原，优选为交链孢菌(alternaria.sp.)。
19.另外优选的是，在步骤(4)中，基因相对表达量采用定量pcr进行。
20.另外优选的是，在步骤(5)中，水杨酸含量变化、所述酶的活性变化和所述蛋白的基因相对表达量在死体营养型病原感染后升高，表明该植物对死体营养型病原具有抗性。
21.本发明在第二方面提供了一种提高植物对死体营养型病原的抗性的方法，其特征在于，所述方法包括采用水杨酸对植物进行处理的步骤。
22.优选的是，水杨酸通过浸根的方式进行处理。
23.另外优选的是，用于处理的水杨酸为水溶液的形式，浓度为1至3mm；所述植物为幼苗植株。
24.另外优选的是，所述植物为菊科植物，优选为菊花(chrysanthemum)，更优选为怀菊花(chrysanthemum morifolium ramat.
‘
huaihuang’)；所述死体营养型病原为链格孢属(alternaria)病原，优选为交链孢菌(alternaria.sp.)。
25.相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：
26.(1)可以通过水杨酸方便地检测植物对死体营养型病原的抗性。
27.(2)可以通过水杨酸处理来提高植物死体营养型病原的系统获得抗性。
28.(3)本发明的结果为植物尤其是怀菊花(chrysanthemum morifolium ramat.
‘
huaihuang’)的抗病性研究包括分子遗传育种提供一系列酶以及一系列蛋白尤其是水杨酸通路相关蛋白的标靶。
附图说明
29.图1显示了
‘
huaihuang’接种无菌蒸馏水或alternaria sp.后发生的变化。其中，图1a表示表型的变化；图1b表示激素含量的变化；图1c表示防御酶活性的变化。右上角插入的白色框里的图像是植株下部白色框部位的放大图像；数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的不同字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。标尺为1厘米。
30.图2显示了
‘
huaihuang’在无菌蒸馏水或sa处理下cmtga1的相对表达量；这些数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用独立性t检验，*表示差异显著(**p<0.01，*p<0.05)。
31.图3显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下sod活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
32.图4显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下pod活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
33.图5显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下pal活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
34.图6显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下ppo活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
35.图7显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下apx活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
36.图8显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cat活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
37.图9显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下gr活力的动态变化，数据是三次生物学重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
38.图10显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmtga1的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
39.图11显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmtga5的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
40.图12显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmpr5的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
41.图13显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmsod的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
42.图14显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmpod的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
43.图15显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmpal的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
44.图16显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmapx的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
45.图17显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmcht的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
46.图18显示了
‘
huaihuang’在alternaria sp.处理下cmglu的相对表达量，数据是三次生物学重复和三次技术重复的平均值；误差线表示ses。采用单因素方差分析，直方图上的字母分别表示在p<0.05水平存在显著性差异。
47.图19显示了处理对接种死体营养性病原菌alternaria sp.的怀黄菊的形态影响。
具体实施方式
48.以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
49.实施例
50.1.怀菊花的培育和alternaria sp.接种
51.1.1怀菊花的培育
52.将在生根培养基(rtm)中继代培养25天的怀菊花组培苗从培养基中取出，然后在水中将根上剩余的培养基轻轻去掉，之后放入苗床内进行水培炼苗，3天后将其移植于营养土和蛭石的混合基质(v:v＝1:1)中，在25℃、湿度40％-60％、16h光照/8h黑暗、60me
·
s-1
·
m-2
光强的条件下培养。
53.1.2 alternaria sp.的活化培养
54.在生物安全柜中，使用已灭菌的钩针从4℃冰箱保存的菌种中挑取孢子，接种在pda固体培养基上，将其倒置放在28℃的培养箱中3天，使其活化；将活化的菌种进行继代培养，扩大菌种量；我们将孢子悬浮液(包含吐温)倒入alternaria sp.病原菌的培养板中，使孢子悬浮起来，制备菌液；在光学显微镜下使用血细胞计数器计数孢子数，不断调整孢子浓度为1
×
107个/ml。
55.1.3无菌蒸馏水或alternaria sp.接种
56.用针刺法接种8-10叶龄的菊花叶片(自上而下第4-6片叶)，每个叶片4个接种点，每个接种点5μl。无菌蒸馏水和alternaria sp.接种方法完全相同。接种后的植株在25℃、100％rh的暗室中培养48小时，随后，植物转入培养室正常生长，培养条件为：14小时光照/10小时暗光周期，20-25℃，90-95％相对湿度,60me
·
s-1
·
m-2
光强。
57.1.4怀菊花对alternaria sp.的抗性分析
58.1.4.1形态观测：在怀菊花接种无菌蒸馏水(mock)或alternaria sp.之后，每天观察各怀菊花株系的发病情况，并在接种后第0、3、5、10和15天进行拍照。
59.1.4.2生理指标的测定：在怀黄菊接种黑斑病原菌0、3、5d后分别进行取样，每次取不同处理植株相同叶位的怀黄菊叶片，迅速用液氮冷冻后，放于-80℃冰箱保存，用于相关酶(pod、pal、ppo、apx、glu和cht)活性的测定。
60.pod活性的测定：将叶片与提取缓冲液(0.1mol
·
l-1
、ph 7.0的磷酸盐缓冲剂)按照1/10(w/v)的比例混合(0.1g/1ml)后置于已预冷的研钵中，充分研磨。至匀浆状后于低温离心机中离心15min(12，000rpm，4℃)，所得上清液即用作酶提取液；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液0.1ml、0.1mol/l的磷酸盐缓冲剂2.9ml、0.04mol
·
l-1
的过氧化氢10μl和0.02mol
·
l-1
的愈创木酚50μl；吸光度变化在波长为470nm条件下进行测定，每间隔30s记数一次，共计3min。pod活性单位u被定义为在测定条件下1min引起a
470nm
的值发生0.01大小的变化所需的酶量，以u
·
g-1
fw表示比活性。
61.pal活性的测定：将叶片与提取缓冲液(0.2mol
·
l-1
、ph 8.8的硼酸盐缓冲剂)按照1/10(w/v)的比例混合(0.1g/1ml)后置于已预冷的研钵中，充分研磨。至匀浆状后于低温离
心机中离心30min(12，000rpm，4℃)，所得上清液即用作酶提取液；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液0.1ml、0.1mol
·
l-1
的硼酸盐缓冲剂2ml、0.02mol
·
l-1
的l-苯丙氨酸0.5ml；40℃水浴15min后在波长为290nm条件下测定吸光值。pal活性单位u被定义为在测定条件下1h引起a
290nm
的值发生0.01大小的变化所需的酶量，以u
·
g-1
fw表示比活性。
62.ppo活性的测定：酶提取液的制备方法同上；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液300μl、0.02mol
·
l-1
磷酸盐缓冲剂2ml、0.02mol
·
l-1
邻苯二酚1ml；按顺序加样完成后将反应体系迅速混匀，吸光度变化在波长为410nm条件下进行测定，每间隔30s记数一次，共计3min。ppo活性单位u被定义为在测定条件下30s引起a
410nm
的值发生0.001大小的变化所需的酶量，以u
·
g-1
fw表示比活性。
63.apx活性的测定：酶提取液制备方法同上；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液0.1ml、2.9ml apx反应液(50mmol
·
l-1
ph 7.0的tris-hcl、0.1mmol
·
l-1
edta、0.1mmol
·
l-1
h2o2、0.5mmol
·
l-1
asa)，立即混匀后开始计时，从1分半开始，每过30s记录一次a290nm的读数，记到3分半停止。以每分钟消耗1μmol的asa所需要的apx活性为一个酶活单位u，以u
·
g-1
fw表示比活性。
64.glu活性的测定：将叶片与提取缓冲液(含有15mmol
·
l-1
β-巯基乙醇的0.1mol
·
l-1
、ph 5.2的醋酸钠缓冲剂)按照1/4(w/v)的比例混合(0.5g/2ml)后置于已预冷的研钵中，充分研磨。至匀浆状后于低温离心机中离心15min(12，000r
·
min-1
，4℃)，所得上清液即用作酶提取液；将100μl的酶液与130μl昆布多糖(4％)混合后于40℃水浴1h，然后再加入300μl dns试剂，进行沸水浴5min以终止反应，冷却一段时间后加入5.4ml去离子水，混匀，测定吸光度值a
540nm
。glu活性单位u定义为样品的glu在l min内催化昆布多糖分解从中释放出的葡萄糖量，以u
·
g-1
fw表示比活性。
65.cht活性的测定：将叶片与提取缓冲液(0.1mol
·
l-1
、ph 5.0的磷酸钾缓冲剂)按照1/15(w/v)的比例混合(0.1g/1.5ml)后置于已预冷的研钵中，充分研磨。至匀浆状后于低温离心机中离心15min(12，000r
·
min-1
，4℃)，所得上清液即用作酶提取液；在酶活性测定之前需将1ml酶提取液与100μl 3mg
·
ml-1
的ca混合，40℃水浴2h后再沸水浴5min终止反应，然后12，000rpm离心5min，取上清液测定吸光度值a
560nm
。cht活性单位u＝a
×
1000
·
min-1
，以u
·
g-1
fw表示比活性。
66.1.4.3在怀菊花未接种之前(0d)和接种alternaria sp.之后不同时间点(3、5、10和15dpi)取其叶片作为样品，测定sod、cat、apx、gr、pal、pod和ppo活力。pod、pal、ppo和apx的测定方法与上述相同；sod、cat和gr的测定方法如下：
67.sod活性的测定：酶提取液制备方法同上；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液0.05ml、0.1mol
·
l-1
的磷酸盐缓冲剂1.5ml、0.3ml met、0.3ml nbt、0.3ml edta-na2、0.25ml蒸馏水、0.3ml核黄素；按顺序依次加样后在4000lx光照下反应20min，吸光度变化在波长为560nm条件下进行测定。抑制nbt光反应50％的sod酶活性被定义为一个酶活性单位u，以u
·
g-1
fw表示比活性。
68.钼酸铵法测定cat的活性。
69.gr活性的测定：酶提取液制备方法同上；酶活性测定时的反应体系为：酶提取液0.1ml、2.9ml gr反应液(50mmol
·
l-1
ph 7.5的tris-hcl、0.1mmol
·
l-1
edta、5mmol
·
l-1
mg cl2·
6h2o、0.2mmol
·
l-1
nadph、0.5mmol
·
l-1
gssg)，立即混匀后开始计时，从1分开始，每过
30s记录一次a340nm的读数，记到3分停止。gr活性单位u被定义为在测定条件下1min引起a
340nm
的值发生1.0大小的变化所需的酶量，以u
·
g-1
fw表示比活性。
70.1.4.4防御基因的表达水平分析：在怀菊花未接种之前(0h)和接种alternaria sp.之后不同时间点(1、3、5和7天)取其叶片作为样品，然后根据rnaiso plus的说明书的步骤进行操作，用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的污染或降解情况；使用超微量紫外分光光度计测定rna的a
260nm
/a
280nm
数值来检测rna纯度，符合要求的rna用于进行下一步实验，并保存于-80℃冰箱。取500ng rna进行反转录获得cdna，通过实时荧光定量pcr(qpcr)检测防御基因的表达水平，拟南芥持家基因actin作为内参基因。反转录的20微升的反应体系，qpcr采用10微升的反应体系，使用lightcycler96实时荧光定量pcr仪(roche，美国)的默认溶解曲线采集程序进行，所有引物如下表所示。
71.表1试验所用引物名称与序列
[0072][0073]
[0074]
1.5 sa处理对怀黄菊cmtga1的相对表达量的影响
[0075]
为了探讨外源激素处理对怀黄菊cmtga1基因表达的诱导作用，分别用2mm的sa和蒸馏水对水培5日的大小一致且健康的怀黄菊幼苗进行浸根，30株/每个处理。取样时间：0、2、4、8、12、24h，样品叶片经液氮速冻后保存于-80℃冰箱。在处理后的24h内进行取样，通过qrt-pcr检测cmtga1的表达情况。
[0076]
1.6 sa处理对怀黄菊表型的影响
[0077]
将在生根培养基里培养25天左右的怀黄菊组培苗取出，水培炼苗，一周后移栽到营养土与蛭石的混合培养基质(v:v＝1:1)中。等到怀黄菊幼苗8-10片叶时，试验组灌根施用2.0mmol/l的sa，对照组根施相同量的清水。每个处理15株，重复3次。在处理3天后用上述同样方法接种怀黄菊黑斑病原菌a.sp.，将接种处理后的植株在温室中培养，20d后拍摄不同处理株系的照片，观测怀黄菊叶片的发病情况。
[0078]
3.结果与分析
[0079]
sar是一种常见的植物抗病机制，它是由信号分子sa的积累和prs基因的协同诱导而激活的。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，pal)和过氧化物酶(peroxidase，pod)是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶，与木质素、植保素等防御物质的合成有重要的作用。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)与醌类物质醌、单宁等物质的合成有重要关系，而醌类参与细胞壁物质的合成及代谢，阻止病原菌的入侵，并与蛋白质等大分子物质形成聚合物，限制病原菌的扩展。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)是一种重要的生物超氧化物自由基清除剂，能有效防止超氧化物自由基对生物的损伤，在机体对各种应激反应的生理生化过程中几乎都是非常活跃的，是机体重要的抗氧化酶。过氧化氢酶(catalase，cat)和抗坏血酸酶(ascorbate peroxidase，apx)可以清除过氧化氢，从而减少h2o2对植物组织可能造成的伤害。谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，gr)保护细胞不受ros及其反应产物积累电位异常的影响方面发挥重要作用。几丁质酶(chitinase，cht)降解真菌细胞壁中的几丁质，β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，glu)降解致病性真菌细胞壁中的葡聚糖，对于植物对真菌的防御具有重要作用；tga1、tga5和cmpr5是sa信号通路的蛋白。
[0080]
图1显示了
‘
huaihuang’接种无菌蒸馏水或alternaria sp.后表型(a)、激素含量(b)和防御酶活性(c)的变化。
[0081]
‘
huaihuang’接种alternaria sp.之后，本发明人观察并记录了
‘
huaihuang’的表型变化，以研究alternaria sp.感染对
‘
huaihuang’生长的的影响。接种10天后，叶片出现了典型的病斑，接种15天后叶片继续长大，形成明显的坏死症状。相反，在用水对照处理的叶上未观察到这种病原性反应(图1a)。为了了解
‘
huaihuang’叶片中的sa是否对alternaria sp.有反应，测量了sa含量的变化。结果发现，接种alternaria sp.的
‘
huaihuang’的sa含量在5天后显著增加(图1b)。同时，完成了6种相关酶即pal，pod，ppo，apx，glu和cht的活性以了解是否对alternaria sp.感染有反应。结果表明，所有这些酶的活性在被alternaria sp.感染的叶片中均显着较高(图1c)。说明alternaria sp.对
‘
huaihuang’的感染会诱导sa的生成，从而启动sar抗病机制。
[0082]
图2显示，cmtga1的表达量在无菌水处理后无明显变化，sa处理后呈现先增高后降低的单峰变化趋势。sa处理2h时，cmtga1的表达量开始显著升高，是对照的4.28倍，在处理
8h后，表达量达到最大(9.21倍)，此后开始下降，但cmtga1的表达量始终极显著的高于对照。由此表明，cmtga1的基因表达对sa的诱导很敏感。
[0083]
在另外的批次中，采用同样的方法利用alternaria sp.对
‘
huaihuang’进行感染。然后测量如下酶的酶活：sod、pod、pal、ppo、apx、cat和gr以及cmtga1、cmtga5、cmpr5、cmsod、cmpod、cmpal、cmapx、cmcht、cmglu的相对表达量。结果发现，这些酶的活性在用alternaria sp.感染后都全部显著增加，相关基因的表达量也显著增加(参见图3至18)，说明alternaria sp.感染后能够诱导sa的生成，启动sa途径，使植物能够产生抗性。
[0084]
为了检测sa处理对怀菊花表型的影响，本发明人还用sa水溶液对怀菊花进行灌根处理。结果发现，不经sa处理的怀黄菊在20d后发病严重，部分叶片已严重枯黄；用2mmol/l的sa处理后，怀菊花叶片上的病斑明显比对照组小很多，其感病情况与对照相比明显好转，表明sa可以有效提高怀黄菊在幼苗期对死体营养性病原菌a.sp.的抗性(参见图19)。
[0085]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。