一种产胞外多糖培养基及其应用的制作方法

一种产胞外多糖培养基及其应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种高产胞外多糖的大肠杆菌培养基，以及培养该细菌产糖的方法。
(二)

背景技术：

2.胞外多糖是分泌到细胞外的一类糖类化合物，自从1972年把海洋细菌产生的高分子碳水化合物命名为胞外多糖开始，动物、植物和微生物来源的胞外多糖就受到了广泛的关注、研究和开发。胞外多糖不仅有利于宿主自身的生存，而且具有结构和功能多样化的特性以及天然的生物相容性和无毒性，因而受到了各个研究领域的青睐，在食品工业、农业领域、纺织工业、制药业、化妆品工业、民用工业和石油工业有广泛的应用前景。多糖的开发应用始于几十年前特别是植物和海藻来源的多糖，包括植物来源的纤维素、淀粉和果胶质以及海藻来源的琼脂糖、海藻盐和角叉胶等；细菌胞外多糖因其易分离纯化，而且具备结构新颖和性能特殊的优点，因而具有巨大的开发潜能。此外，细菌胞外多糖的结构多样性、功能多样化也使得胞外多糖的相关研究也越来越受到关注。据研究报道，细菌胞外多糖在保护宿主细胞免受干燥、抵抗抗菌化合物、抵御噬菌体侵染、渗透胁迫及吞噬细胞吞噬，以及表面粘附和生物被膜形成等方面起着非常重要的作用。目前，细菌胞外多糖被广泛用于食品、医药、石化和化妆品等领域。
3.过表达基因簇ycjd
‑
fabi
‑
yciw
‑
rnb的重组大肠杆菌ec100在特定培养基中能稳定产生一种胞外多糖，经鉴定其为一种新型的胞外多糖，并且命名为rb多糖。研究发现rb多糖不仅可以被肠道微生物降解而且还影响短链脂肪酸的产生，具有潜在的益生元功效和商业应用价值。
4.重组大肠杆菌ec100在常规的实验室培养基如lb上能正常生长但是不能产生rb多糖，在商品化的pia培养基(假单胞菌分离琼脂培养基)(bd,sparks,md)上能稳定产生rb多糖，缺点是pia培养基成本太高，产量低，不利于其大规模的生产。为了商业化应用rb多糖，前提需要进行大量的生产，因此探索一种廉价和高产rb多糖的培养基是大规模应用的前提。因此，本发明基于生产的需要，探索和优化高产rb多糖的培养基。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种产胞外多糖培养基及其产胞外多糖的应用，在pia培养基的基础上，寻找能够提高胞外多糖产量的无机盐以及碳氮源。同时，为了减少能耗、降低后续纯化的成本和效率，采用固态发酵技术(平板培养法或者固体培养基培养法)，通过生物转化生产rb多糖，从而最终找出廉价、稳定、高产rb多糖的培养基及其培养方法。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种产胞外多糖培养基，所述产胞外多糖培养基组成为：5
‑
15g/l蛋白胨，1
‑
10g/l酵母提取物，1.6
‑
20g/l nacl，2
‑
24g/l mgcl2，2
‑
20g/l k2so4，6
‑
18ml/l甘油，12
‑
18g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
8.进一步，优选所述产胞外多糖培养基组成：8
‑
12g/l胰蛋白胨，3
‑
6g/l酵母提取物，15
‑
20g/l nacl，15
‑
20g/l mgcl2，15
‑
20g/l k2so4，10
‑
14ml/l甘油，14
‑
16g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
9.更进一步，优选所述培养基组成为：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，18g/lnacl，18g/l mgcl2，18g/l k2so4，12g/l甘油，15g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
10.本发明还提供一种所述产胞外多糖培养基在产胞外多糖中的应用，所述应用为：将重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线接种至所述产胞外多糖培养基中，30
‑
40℃培养10
‑
30h(优选37℃培养24h)，用涂布棒或者刮铲将固体培养基上的菌体和胞外多糖的混合物全部挂下来，用pbs进行重悬；加入3倍体积的无水乙醇(可重复利用)充分混匀，于4℃冰箱沉淀过夜；沉淀后的溶液6000rpm，离心20min；最后将沉淀冷冻干燥成粉末状即为胞外多糖。重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100是按照专利申请cn106978430 a实施例1方法构建。
11.所述重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100接种前先进行活化培养，所述活化培养为：从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素lb液体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5，再划线接种至产胞外多糖培养基。
12.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
13.本发明的产胞外多糖培养基在保证菌株正常生长的同时，还可以让其稳定高产胞外多糖，效率高、可重复性好，优化后的产胞外多糖培养基产糖量提高了2.25倍(优化前为1.093g/l，优化后产糖量为2.46g/l)；操作性强，使用简单，只需要按照培养基的培养比例进行配制固体培养基，然后在固体平板上接种产糖突变株进行培养即可；能耗低，成本低，该发明使用的试剂是常规试剂，易于购买和运送，关键使用比较廉价的原材料。
(四)附图说明
14.图1为比较lb培养基和pia培养基上rb多糖产糖情况。a，lb培养基上菌落图；b，pia培养基上的菌落图；c，lb培养基和pia培养基上产糖的定量分析。
15.图2为pia培养基各组分对产糖的影响。
16.图3为无机盐和甘油对产糖的影响。
17.图4为不同浓度氯化钙对rb多糖产生的影响。
(五)具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
19.lb液体培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l，溶剂为水，ph值自然。lb平板为向lb液体培养基添加15g/l琼脂。
20.pia固体培养基终浓度组成为：蛋白胨20g/l，氯化镁1.4g/l，硫酸钾10g/l，三氯生25mg/l，13.6g/l琼脂，甘油20ml/l，溶剂为水，ph值自然。
21.本发明实施例所用重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100是按照专利申请cn106978430a实施例1方法构建。
22.实施例1、lb培养基和pia培养基产rb多糖的比较
23.1、培养基的制备：
24.分别准备50ml lb固体培养基和50ml pia固体培养基，各自按照体积比1:1000比例加入终浓度50μg/ml卡那霉素抗生素后倒入平板。
25.2、菌株的活化及菌液制备：
26.从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素lb液体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5，获得lb培养液。
27.3、接种培养(平板培养法)：
28.取100μl步骤2的lb培养液于lb固体培养基平板划线，在恒温培养箱中37℃培养24h。
29.取100μl步骤2的lb培养液于pia平板培养基划线，在恒温培养箱中37℃培养24h。
30.4、菌落形态观察：
31.观察步骤3的pia和lb平板培养基上菌落形态，对其产糖量进行初步观察(图1中a、b)。结果发现pia平板上的菌落更为透明和粘稠。
32.5、硫酸咔唑法测定rb多糖含量(od
530nm
/od
600nm
)：
33.用1ml pbs缓冲液，同时借用涂布棒将步骤3的pia平板和lb平板上所有的菌体和rb多糖的混合物一起洗脱下来，并且转移至2ml ep管中；吹打或使用漩涡震荡混匀仪进行混匀；用pbs稀释上述混合菌液(od
600nm
小于1)，记录od
600nm
数值，作为样品，每个样品2个重复；以蒸馏水为对照组。
34.取5支10ml试管放置在冰上，分别加入6ml四硼酸钠
‑
硫酸溶液，再加入700μl样品或蒸馏水，轻柔混匀，每管加入200μl 0.1％咔唑试剂；55℃水浴30min，室温静置5min；沸水浴10min，分光光度计测od
530nm
吸光值；最后计算od
530nm
/od
600nm
比值，进而确定糖的浓度，结果见图1中c所示。
35.实验结果发现pia平板上的产糖量明显高于lb，lb培养基中的产糖量可以忽略不计(图1中c)。
36.四硼酸钠
‑
硫酸溶液：称取0.956g四硼酸钠溶解于200ml质量浓度36％浓盐酸中，超声溶解。
37.0.1％咔唑试剂：称取100mg咔唑，溶解于100ml无水乙醇中。
38.实施例2、pia培养基中各组分对rb多糖产生的影响
39.实施例1实验结果发现pia培养基中rb产糖更多，相比较不产糖的lb培养基，pia培养基的组分有明显的差异，所以后续将分析pia培养基中各组分对rb多糖产糖的影响。
40.1、培养基的准备：
41.pia培养基：蛋白胨20g/l，氯化镁1.4g/l，硫酸钾10g/l，13.6g/l琼脂，三氯生(5
‑
氯
‑2‑
(2',4'
‑
二氯苯氧基)苯酚)25mg/l，甘油20ml/l，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
42.pia培养基1(无硫酸钾)：蛋白胨20g/l，氯化镁1.4g/l，三氯生25mg/l，13.6g/l琼脂，甘油20ml/l，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
43.pia培养基2(无氯化镁)：蛋白胨20g/l，硫酸钾10g/l，三氯生25mg/l，13.6g/l琼
脂，甘油20ml/l，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
44.pia培养基3(无甘油)：蛋白胨20g/l，氯化镁1.4g/l，硫酸钾10g/l，三氯生25mg/l，13.6g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
45.pia培养基4(替换碳源)：胰蛋白胨20g/l，酵母提取物5g/l，氯化镁1.4g/l，硫酸钾10g/l，三氯生25mg/l，13.6g/l琼脂，甘油20ml/l，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
46.分别配置上述含完全组分的pia培养基和分别缺少硫酸钾、氯化镁、甘油的pia培养基1～pia培养基3，以及替换碳氮源的pia培养基4，各50ml，120℃灭菌15min，为了防止杂菌污染和保持重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100的稳定，在培养基中均添加终浓度50μg/ml卡那霉素。
47.2、菌株的活化：
48.从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的lb体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5。
49.3、接种培养(平板培养法)：
50.将步骤2菌液分别接种于步骤1配制好的凝固平板培养基中，恒温培养箱37℃下培养24h。
51.4、硫酸咔唑法测定rb多糖含量(od
530nm
/od
600nm
)：
52.测定方法和步骤同实施例1，结果见图2。
53.实验结果发现，硫酸钾、氯化镁、甘油的缺失都会减少rb多糖的产生，用胰蛋白胨和酵母提取物替换单一的蛋白胨可以得到更高的rb多糖(图2)。
54.实施例3、单因素实验分析钠、镁、钾离子和甘油对rb多糖产生的影响
55.前期实验已经发现，无机盐和甘油对rb多糖的产生影响很明显，为了进一步验证这些无机盐和甘油是如何影响rb多糖的产生，后续通过实验验证不同浓度下rb多糖的产量。
56.1、培养基的准备：
57.以rba固体培养基1为基础培养基，在该培养基的基础上分别添加不同浓度的无机盐：nacl(0.16％、0.30％、0.44％、0.60％、1.00％、1.30％、1.60％)，mgcl2(0.2％、0.4％、0.6％、0.9％、1.2％、1.5％、1.6％)和k2so4(0.2％、0.5％、0.8％、1.1％、1.4％、1.6％)。为了分析甘油对rb多糖产生的影响(培养基中没有无机盐和甘油的情况下菌株生长明显被抑制)，以参考pia培养基组成的基础上，配缺少甘油的基础培养基mm，在该培养基的基础上分别加入不同浓度的甘油(0.6％、0.8％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％)。
58.rba固体培养基1：蛋白胨20g/l，甘油20ml/l，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
59.rba固体培养基2：蛋白胨20g/l，甘油20ml/l，nacl(1.6g/l、3.0g/l、4.4g/l、6.0g/l、10.0g/l、13.0g/l、16.0g/l)，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
60.rba固体培养基3：蛋白胨20g/l，甘油20ml/l，mgcl2(2.0g/l、4.0g/l、6.0g/l、9.0g/l、12.0g/l、15.0g/l、16.0g/l)，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
61.rba固体培养基4：蛋白胨20g/l，甘油20ml/l，cacl2(2.0g/l、5.0g/l、8.0g/l、11.0g/l、14.0g/l、16.0g/l)，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
62.rba固体培养基5：蛋白胨20g/l，甘油20ml/l，k2so4(2.0g/l、5.0g/l、8.0g/l、11.0g/l、14.0g/l、16.0g/l)，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
63.基础培养基mm：蛋白胨20g/l，硫酸钾10g/l，氯化镁1.4g/l，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
64.基础培养基mm1：蛋白胨20g/l，硫酸钾10g/l，氯化镁1.4g/l，甘油(6.0ml/l、8.0ml/l、12.0ml/l、14.0ml/l、16.0ml/l、18.0ml/l)，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2。
65.2、菌株的活化：
66.从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5。
67.3、接种培养(平板培养法)：
68.将步骤2菌液分别接种于步骤1配制的rba固体培养基2～rba固体培养基5、基础培养基mm1凝固平板中，恒温培养箱37℃下培养24h。
69.4、硫酸咔唑法测定rb多糖含量(od
530nm
/od
600nm
)：
70.测定方法和步骤同实施例1。
71.5、数据的处理和结果分析：
72.将上述得到的结果，利用sigmaplot软件进行汇总分析，将图3和图4。结果发现，随着硫酸钾、氯化镁、氯化钠和甘油的浓度变化rb多糖的产量也随着改变，但是都有一个产量最高值，超过该浓度其产量反而会降低。
73.氯化钠作为pia培养基中之外的无机盐也可以明显促进rb多糖的产生，但实验结果发现同等浓度的氯化钙添加并不能明显促进rb多糖的产生，如图4所示，随着氯化钙浓度的增加，rb多糖的产量(od
530nm
/od
600nm
数值)并没有提高，而且一直处于极地浓度(od
530nm
/od
600nm
<0.1)，这说明rb多糖的产生与无机盐的种类密切相关。
74.实施例4、正交实验优化高产rb多糖的培养基组分
75.上述实验已经证实不同的无机盐和甘油对rb多糖的产生都有很明显的影响，而且在特定浓度下可以达到产量最大值，超过这个浓度反而会降低，上述实验是单因素的分析，为了验证无机盐和甘油相互之间组合对rb多糖产量的影响，后续通过设计正交实验验证无机盐和甘油组合下rb多糖的产量。
76.1、正交实验设计和培养基的配制：
77.利用正交设计助手，以nacl，mgcl2，k2so4和甘油为因素，其不同的浓度为水平，设置正交实验，具体参数设置见表1。在基础培养基(蛋白胨20g/l，琼脂13.6g/l，ph6.8
‑
7.2)的基础上，分别加上正交表1中各无机盐和甘油组合，从而配制成实验组培养基(表1，组合1
‑
21)。同时，以实施例1的pia培养基为阳性对照，分析其产糖量结果。
78.2、菌株的活化：
79.从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素lb液体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5。
80.3、接种培养：
81.将步骤2的菌液分别接种于步骤1配制好的凝固平板培养基中，恒温培养箱37℃下培养24h。
82.4、硫酸咔唑法测定rb多糖含量(od
530nm
/od
600nm
)：
83.测定方法和步骤同实施例1。
84.5、数据的处理和结果分析：
85.由表1实验结果可以发现，氯化钠对rb多糖产量的影响最大，组号1
‑
9的rb多糖产量(od
530nm
/od
600nm
＝0.389
‑
0.695)要明显高于pia平板的产量(od
530nm
/od
600nm
＝0.22
±
0.02)，也明显高于缺少其中任何一个因素的组合(表1)，因此，在nacl，mgcl2，k2so4和甘油四个组分同时存在时，rb多糖的产量才能达到最大值。基于k值大小可以确定产胞外多糖培养基中最优的无机盐和甘油组合为18g/l nacl，18g/lmgcl2，18g/l k2so4，12ml/l甘油。此外，基于图2中的实验结果，胰蛋白胨和酵母提取物替换也可以显著提高rb多糖的产量。因此，基于上述的实验结果可以得出最优产胞外多糖培养基组成为：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，18g/l nacl，18g/l mgcl2，18g/l k2so4，12ml/l甘油，15g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。
86.表1.正交设计实验验证无机盐和甘油对rb多糖产量的影响。
[0087][0088]
实施例5、利用产胞外多糖培养基固态发酵产胞外多糖
[0089]
1、菌株的活化：
[0090]
从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌rbatcc3
‑
ec100划线在含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml lb液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素lb液体培养基中继续培养至od
600nm
＝0.5。
[0091]
2、接种培养：
[0092]
将步骤2的菌液分别接种于产胞外多糖培养基中，恒温培养箱37℃下培养24h。用1ml pbs缓冲液，同时借用涂布棒将平板上所有的菌体和rb多糖的混合物一起洗脱下来，取样采用实施例1方法测试rb多糖含量(od
530nm
/od
600nm
)，其余加入3倍体积的无水乙醇充分混匀，于4℃冰箱沉淀过夜，沉淀后的溶液6000rpm，离心20min，最后将沉淀冷冻干燥至粉末状并且称重，计算产糖量。
[0093]
产胞外多糖培养基组成为：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，18g/l nacl，18g/l mgcl2，18g/l k2so4，12ml/l甘油，15g/l琼脂，溶剂为水，ph6.8
‑
7.2。同时，以实施例1的pia
培养基为对照。
[0094]
结果发现rb多糖的od
530nm
/od
600nm
为0.720
±
0.02(明显高于pia中的rb多糖产量)，由此可知产胞外多糖培养基可获得大量的rb多糖。
[0095]
结果发现pia培养基上产糖量为1.093g/l，产胞外多糖培养基的产糖量为2.46g/l，产糖量提高了2.25倍。