一种EZH2的原核表达载体及其构建方法与流程

技术特征：
1.一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：包括步骤s1.获取目的基因，并对目的基因的rna进行反转录和pcr反应，回收2300bp左右的目的片段；s2.利用回收的2300bp左右的目的片段重组克隆载体pmd18
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ezh2；s3.对克隆载体pmd18
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ezh2进行pcr扩增与鉴定；s4.对克隆载体pmd18
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ezh2进行酶切鉴定；s5.获取目的片段，并回收2200～5900bp之间的目的片段；s6.利用回收2300bp左右的目的片段和5900bp左右的片段进行连接，构建原核表达载体pet
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ezh2；s7.原核表达载体pet
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ezh2的pcr扩增鉴定；s8.原核表达载体pet
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ezh2的酶切鉴定。2.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤s1所述的获取目的基因的获取过程包括：s101.采用试剂盒从鸡脾脏中提取总rna；s102.对提取到的总rna进行template rna变性及反转录反应；s103.配制反应液，对反转录结束后的dna片段进行pcr反应；s104.将pcr后的产物，进行凝胶电泳；s105.回收2300bp左右的目的片段。3.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤s2所述的克隆载体pmd18
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ezh2的重组过程包括：s201.将回收所得的2300bp左右的目的片段与pmd18
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t进行连接；s202.利用感受态细胞对重组克隆载体pmd18
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ezh2进行转化；s203.提取重组质粒pmd18
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ezh2。4.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤s3所述的克隆载体pmd18
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ezh2的pcr的扩增与鉴定过程和步骤和步骤s7所述的pet
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ezh2的pcr扩增鉴定过程均包括：(1)配制pcr扩增鉴定酶反应体系，进行pcr扩增鉴定酶反应过程，并在加完样品后，用旋涡混合器混匀、瞬离；(2)根据pcr反应条件，在梯度pcr仪上进行pcr反应。5.根据权利要求4所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：在步骤(1)所述的pcr扩增鉴定酶反应体系中，所使用的引物为：forwardpimer:gggatatcatgggtcaaacaggaaareverse primer:ctcgagttactgtcgacaagggatttccatttctc。6.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：(1)步骤s4所述的对克隆载体pmd18
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ezh2进行酶切鉴定的过程需要用限制性内切酶ecor
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和xho i对pmd18
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ezh2进行酶切鉴定；(2)步骤s8所述的原核表达载体pet
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ezh2的酶切鉴定的过程需要用ecor
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和sal i对pet
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ezh2进行双酶切。7.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤s5所
述的目的片段的获取过程包括：s501.用限制性内切酶ecor
ꢀⅴ
和sai i分别对pmd18
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ezh2和pet
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32a进行双酶切，37℃水浴1h；s502.凝胶电泳，回收2300bp左右和5900bp左右的目的片段。8.根据权利要求1所述的一种ezh2的原核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤s6所述的原核表达载体pet
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ezh2的构建过程包括：s601.目的片段的连接：将回收所得的5900bp左右的片段与2300bp左右的片段进行连接；s602.混匀后，12～16℃，16h过夜；s603.第二天在连接管内加入2ul solution
ꢀⅲ
，混匀后取10ul转化至rosetta感受态细胞中，得到原核表达载体pet
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ezh2。9.利用如权利要求1所述构建方法得到的一种ezh2的原核表达载体，其特征在于：所述ezh2的原核表达载体pet
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ezh2与ezh2的核苷酸序列一致，同源性为100％，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

技术总结
本发明公开了一种EZH2的原核表达载体及其构建方法，所述构建方法通过提取鸡脾脏、肝脏、法氏囊和胸腺总RNA，利用RT


技术研发人员：郁川 张贺伟 朱文文 程相朝 田文静 宋敏杰 王聪慧
受保护的技术使用者：洛阳职业技术学院
技术研发日：2021.06.29
技术公布日：2021/10/8