一种EZH2的原核表达载体及其构建方法与流程

一种ezh2的原核表达载体及其构建方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种ezh2的原核表达载体及其构建方法。


背景技术：

2.作为养禽行业的领导者，我国的家禽数量和禽产品产量一直远超其他国家，这之中尤其以养鸡业最为突出；但是在我国养鸡业飞速发展的同时，也仍然存在一些问题，比如禽产品质量仍有待提高，疾病控制力度仍有待加强、饲养管理环境仍有待完善；在这之中，如何有效的控制疾病仍然是养殖业的首要解决问题，虽然我们已经在免疫程序、疫苗生产和其他一些疾病预防方面取得了突出的研究进展，但疾病带来的危害仍不容忽视，疾病的治疗依然刻不容缓；
3.随着科学研究的发展，一些传染性疾病和普通疾病相继得到了控制，因此，作为严重危害养鸡业的重要疾病之一—肿瘤性疾病，显得越发重要；由于肿瘤的发病机制在基因水平上得到了阐明，肿瘤的基因治疗方法得到了迅速发展；通过对肿瘤性疾病的基因治疗方法，可以进一步了解肿瘤性疾病，我们也能够更好的控制肿瘤性疾病的发生、发展以及传播，促进养禽业的健康发展；ezh2(enhancer ofzeste homolog 2)是聚硫蛋白复合物基因家族(pcg)重要成员之一，通过对核小体的修饰、染色体的重塑及干扰其他转录因子的转录调节，在胚胎的发育、细胞增殖及周期调节中起着重要作用，因此ezh2基因的发现给抗肿瘤的基因治疗带来了新的转机；
4.而在实际治疗过程中，如很能够快速且准确的获得能够表达ezh2的原核表达载体变成了本领域的一个技术难点，目前尚无成形的ezh2的原核表达载体的构建方法。


技术实现要素：

5.针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种ezh2的原核表达载体及其构建方法，通过本方法成功构建了重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，为下一步获得ezh2原核表达蛋白奠定基础，也可为探究ezh2基因在鸡肿瘤性疾病中的作用机制提供材料。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种ezh2的原核表达载体的构建方法，包括步骤
8.s1.获取目的基因，并对目的基因的rna进行反转录和pcr反应，回收2300bp左右的目的片段；
9.s2.利用回收的2300bp左右的目的片段重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2；
10.s3.对克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行pcr扩增与鉴定；
11.s4.对克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行酶切鉴定；
12.s5.获取目的片段，并回收2200～5900bp之间的目的片段；
13.s6.利用回收2300bp左右的目的片段和5900bp左右的片段进行连接，构建原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2；
14.s7.原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr扩增鉴定；
15.s8.原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定。
16.优选的，步骤s1所述的获取目的基因的获取过程包括：
17.s101.采用试剂盒从鸡脾脏中提取总rna；
18.s102.对提取到的总rna进行template rna变性及反转录反应；
19.s103.配制反应液，对反转录结束后的dna片段进行pcr反应；
20.s104.将pcr后的产物，进行凝胶电泳；
21.s105.回收2300bp左右的目的片段。
22.优选的，步骤s2所述的克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2的重组过程包括：
23.s201.将回收所得的2300bp左右的目的片段与pmd18
‑
t进行连接；
24.s202.利用感受态细胞对重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行转化；
25.s203.提取重组质粒pmd18
‑
t
‑
ezh2。
26.优选的，步骤s3所述的克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2的pcr的扩增与鉴定过程和步骤和步骤s7所述的pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr扩增鉴定过程均包括：
27.(1)配制pcr扩增鉴定酶反应体系，进行pcr扩增鉴定酶反应过程，并在加完样品后，用旋涡混合器混匀、瞬离；
28.(2)根据pcr反应条件，在梯度pcr仪上进行pcr反应。
29.优选的，在步骤(1)所述的pcr扩增鉴定酶反应体系中，所使用的引物为：
30.forward pimer:gggatatcatgggtcaaacaggaaa
31.reverse primer:ctcgagttactgtcgacaagggatttccatttctc。
32.优选的，(1)步骤s4所述的对克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行酶切鉴定的过程需要用限制性内切酶ecor
ꢀⅴ
和xho i对pmd18
‑
t
‑
ezh2进行酶切鉴定；
33.(2)步骤s8所述的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定的过程需要用ecor
ꢀⅴ
和sal i对pet
‑
32a
‑
ezh2进行双酶切。
34.优选的，步骤s5所述的目的片段的获取过程包括：
35.s501.用限制性内切酶ecor
ꢀⅴ
和sai i分别对pmd18
‑
t
‑
ezh2和pet
‑
32a进行双酶切，37℃水浴1h；
36.s502.凝胶电泳，回收2300bp左右和5900bp左右的目的片段。
37.优选的，步骤s6所述的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的构建过程包括：
38.s601.目的片段的连接：将回收所得的5900bp左右的片段与2300bp左右的片段进行连接；
39.s602.混匀后，12～16℃，16h过夜；
40.s603.第二天在连接管内加入2ul solution
ꢀⅲ
，混匀后取10ul转化至rosetta感受态细胞中，得到原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2。
41.一种ezh2的原核表达载体，所述ezh2的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2与ezh2的核苷酸序列一致，同源性为100％，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
42.本发明的有益效果是：本发明公开了一种ezh2的原核表达载体及其构建方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
43.针对现有技术存在的问题，本发明提出了一种ezh2的原核表达载体及其构建方
法，本方法通过在体外培养和构建，成功构建了ezh2的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，经测序得到原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2与ezh2的核苷酸序列相同，为下一步获得ezh2原核表达蛋白奠定基础；同时可利用得到的ezh2的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2来制备抗鸡肿瘤性疾病相关的药物，为探究ezh2基因在鸡肿瘤性疾病中的作用机制提供材料，为鸡肿瘤性疾病的生物治疗提供了可能。
附图说明
44.图1为本发明实施例1pet
‑
32a
‑
ezh2构建策略图。
45.图2为本发明实施例1ezh2的扩增鉴定结果图。
46.图3为本发明实施例1pmd18
‑
t
‑
ezh2的pcr鉴定结果图。
47.图4为本发明实施例1pmd18
‑
t
‑
ezh2的酶切鉴定结果图。
48.图5为本发明实施例1pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr鉴定结果图。
49.图6为本发明实施例1pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定图。
50.其中：在图2中：m代表1kb dna ladder(dye plus)；1，2，3，4分别代表肝，法，胸，脾中ezh2的扩增鉴定结果；
51.在图3中：m代表1kb dna ladder(dye plus)；1，2，3，4，5，6，7分别代表pmd18
‑
t
‑
ezh2的pcr鉴定结果；
52.在图4中：m代表1kb dna ladder(dye plus)；1，2，3，4，5分别代表pmd18
‑
t
‑
ezh2的酶切鉴定结果；
53.在图5中：m代表1kb dna ladder(dye plus)；1，2，3，4，5分别代表pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr鉴定结果；
54.在图6中：m代表1kb dna ladder(dye plus)；1，2，3，4，5分别代表pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定结果。
具体实施方式
55.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
56.实施例1：
57.参照附图1
‑
6所示的一种ezh2的原核表达载体及其构建方法，其中所述ezh2的原核表达载体的构建方法具体包括材料的准备和制备过程：
58.(一)材料准备：
59.1.材料
60.1.1菌株与质粒
61.由河南科技大学提供所需菌株和质粒，见表1：
62.表1：实验中所用的菌株与质粒
[0063][0064]
1.2主要实验器材，如表2所示：
[0065]
表2：实验仪器及其来源
[0066][0067][0068]
1.3主要试剂，本实验所用试剂及其来源，见表3：
[0069]
表3：主要试剂及其来源
[0070][0071][0072]
1.4主要培养基及试剂配制，主要培养基及试剂配制方法，见表4：
[0073]
表4：主要培养基及试剂配制
[0074]
[0075]
1.5引物
[0076]
primers for ezh2
[0077]
forward pimer:gggatatcatgggtcaaacaggaaa
[0078]
ecor v
[0079]
reverse primer:
[0080]
ctcgagttactgtcgacaagggatttccatttctc
[0081]
xho i sal i
[0082]
1.6原核表达质粒pet
‑
32a
‑
ezh2的构建策略图
[0083]
构建策略：(1)首先扩增基因ezh2，并克隆至pmd18
‑
t载体中，构建重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2；(2)然后用ecor
ꢀⅴ
和sal i对pmd18
‑
t
‑
ezh2和pet
‑
32a进行双酶切，获得目的片段；(3)将获得的目的片段进行连接，得到pet
‑
32a
‑
ezh2；(4)最后提取重组质粒对pet
‑
32a
‑
ezh2进行pcr和酶切鉴定，其具体流程图如图1所示。
[0084]
(二)方法
[0085]
1.感受态细胞的制备
[0086]
在构建克隆载体和原核表达载体的过程中均需要用到感受态细胞，应提前制备好，制备过程如下：
[0087]
①
无菌环蘸取所保存菌液，在lb固体平板上划线，37℃温箱培养过夜，然后挑单菌落接种到3ml lb液体中37℃培养过夜；
[0088]
②
过夜培养物以1:100的比例转接到100ml lb液体的锥形瓶中，37℃250r/min振摇培养2h左右到对数生长期(约2
‑
3h)；
[0089]
③
将培养物转移至无菌冰预冷的2个50ml聚丙烯管中，在冰浴上10min，使之冷却至0℃；
[0090]
④
4℃4000r/min离心10min，倒出培养液弃上清，将试管倒置60s，以使弃液完全流出；
[0091]
⑤
用50/25/12.5ml预冷的0.1mol/l cacl2重悬菌体3次，4℃4000r/min离心10min，弃去上清倒置60s；
[0092]
⑥
每50ml初始培养物用2ml无菌冰预冷的混合物(1.8ml 0.1mol/l cacl2和0.2ml甘油)重悬，分装为0.2ml/管，于
‑
70℃保存备用。
[0093]
2.ezh2的原核表达载体的构建，包括步骤
[0094]
s1.获取目的基因：
[0095]
s101.从鸡脾脏、肝脏、法氏囊和胸腺中提取总rna，采用试剂盒提取，具体操作如下：
[0096]
①
取3日龄雏鸡脾脏脾脏、肝脏、法氏囊和胸腺，加0.2ml buffer r
‑ⅰ
研磨，8000
×
g离心3min；
②
取0.15ml上清于1.5ml ep管，加0.25ml buffer r
‑ⅰ
，反复抽吸；
③
加0.15ml buffer r
‑ⅱ
，振荡，12000
×
g离心5min；
④
取上清，加0.25ml异丙醇，混合均匀；
⑤
将制备管置于2ml ep管中，转移步骤
④
中混合液于制备管中，6000
×
g离心1min；
⑥
弃滤液，加0.5ml bufferw1a，12000
×
g离心1min；
⑦
弃滤液，加0.7ml bufferw2，12000
×
g离心1min，重复步骤
⑦
一次；
⑧
弃滤液，空离，12000
×
g离心60s；
⑨
将制备管放入新的1.5ml ep管中，在制备膜中央加20～30ul buffer te(dnase&rnase
‑
free)或rnase
‑
free水；
⑩
室温静置1min，
12000
×
g离心1min，洗脱得rna。
[0097]
s102.对提取到的总rna进行template rna变性及反转录反应，具体操作如下：
[0098]
(1)按表5配制反应混合液
[0099]
表5：反应混合液
[0100][0101]
(2)在pcr仪上设置温度：
[0102]
65℃
ꢀꢀ
5min；
[0103]
4℃
ꢀꢀꢀ
∞
[0104]
(3)按表6配制下列反转录反应液：
[0105]
表6：反转录反应液
[0106][0107]
(4)在pcr仪上设置温度：
[0108]
42℃
ꢀꢀ
15～30min；
[0109]
95℃
ꢀꢀ
5min；
[0110]
4℃
ꢀꢀꢀ
∞；反应条件如表7所示
[0111]
表7：反转录反应条件
[0112][0113][0114]
s103.对反转录结束后的dna片段进行pcr反应，具体操作如下：
[0115]
(1)按表8配制pcr反应液，
[0116]
表8：pcr反应液
[0117][0118]
(2)在pcr仪上执行如下程序：70℃，15min；95℃，5min；95℃，1min；55℃，1min；72℃，2min 30s；返回第三步循环30次；72℃，10min；4℃，保存；反应条件如表9所示；
[0119]
表9：反应条件
[0120][0121][0122]
s104.将pcr后的产物，进行凝胶电泳，具体操作如下：
[0123]
①
将有机玻璃内槽置于底托中，水平放置，插上梳子；
②
将琼脂糖凝胶于微波炉中加热1分30秒，取出后倒胶约至梳子的1/3～2/3处；
③
待胶凝固后，拔出梳子，内槽放入电泳槽，向电泳槽中加tbe缓冲液至没过胶面；
④
把5ul loading buffer与20ul样品混匀，加样；
⑤
加marker，起标尺的作用；
⑥
打开开关，按run，进行电泳；
⑦
跑20～30分钟，关闭开关；
⑧
取出凝胶，观察是否出现目的条带。
[0124]
s105.回收2300bp左右的目的片段(回收过程中离心转速均为12000
×
g，时间均为1min)：
[0125]
①
切胶，在切胶仪上尽可能小的切下含有目的dna的凝胶，称凝胶重量，以该重量作为一个凝胶单位(0.1g＝0.1ml体积)；
②
加入3倍凝胶单位的bufferde
‑
a，混合均匀后于
75℃加热，间断混合至凝胶完全融化；
[0126]
③
加入1.5倍凝胶单位的bufferde
‑
b，混合均匀，若目的片段<400bp，则需要加入1个凝胶体积的异丙醇；
④
将步骤
③
中的液体转移至dna制备管中，离心后弃滤液；
⑤
加0.5ml bufferw1缓冲液，离心后弃滤液；
⑥
加0.7ml bufferw2缓冲液，离心后弃滤液，重复步骤
⑥
一次；
⑦
空离，离心后弃滤液；
⑧
将制备管置入新的1.5ml的ep管中，向制备膜中央加25～30ul eluent或去离子水(eluent用前放65℃烘箱，以提高dna的洗脱效率)，室温静置1min，离心，洗脱dna。
[0127]
s2.利用回收的2300bp左右的目的片段构建重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2，其具体包括：
[0128]
s201.t载体连接：将回收所得的2300bp之间的片段与pmd18
‑
t进行连接，10ul连接反应体系如表10：
[0129]
表10：pmd18
‑
t载体片段与ezh2的连接反应体系
[0130][0131]
混匀后于16℃反应1h；
[0132]
s202.利用如上述步骤1得到的感受态细胞对重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行转化，具体包括：
①
将感受态细胞dh5α在冰水混合物中融化；
②
将连接产物pmd18
‑
t
‑
ezh2加入dh5α中，冰浴30min；
③
将上述产物置于42℃热应激90s；
④
将上述产物在冰水混合物上2min；
⑤
在试管中加入0.5ml的lb液体，放置于摇床上，37℃培养1h；
⑥
取0.15ml凃板，板为lb amp固体平板，37℃过夜培养，第二日观察长菌情况。
[0133]
s203.提取重组质粒pmd18
‑
t
‑
ezh2(提质粒过程中离心转速均为12000
×
g，时间未特殊标明均为1min)：
①
取1～4ml在lb液体中过夜的菌液置于ep管中，离心弃上清；
②
加0.25ml buffer s1将沉淀悬浮混匀，不应留有小的菌块；
③
加0.25ml buffer s2，温和并充分地上下翻转7～8次，混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不应超过5min；
④
加0.35ml buffer s3，温和并充分地上下翻转9～10次，离心10min；
⑤
吸取离心之后的上清液并转移到制备管中，离心后弃滤液；
⑥
加0.5ml的bufferw1，离心后弃滤液；
⑦
加0.7ml的bufferw2，离心后弃滤液；以同样的方法再用0.7ml bufferw2洗涤一次，弃滤液；
⑧
空离；
⑨
将制备管置入新的1.5ml ep管中，在制备膜中央加60～80ul eluent或去离子水，室温静置60s，离心，洗脱得质粒。
[0134]
s3.对克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行pcr扩增与鉴定，其具体包括：
[0135]
s301.pcr反应体系如表11所示：
[0136]
表11：pcr扩增鉴定酶反应体系
[0137][0138]
s302.加完样品后，用旋涡混合器混匀，瞬离后，在pcr仪上执行如下程序：95℃，5min；95℃，1min；55℃，1min；72℃，2min30s；返回第二步循环30次；72℃，10min；4℃，保存。然后将扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下进行观察和拍照，见表12：
[0139]
表12：pcr反应条件
[0140][0141]
s4.对克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2进行酶切鉴定，其具体过程包括：
[0142]
用限制性内切酶ecor
ꢀⅴ
和xho i对pmd18
‑
t
‑
ezh2进行酶切鉴定。20ul酶切反应体系如表13：
[0143]
表13：pmd18
‑
t
‑
ezh2酶切反应体系
[0144][0145]
样品加完后，混匀，37℃水浴1h，产物跑电泳观察存图。
[0146]
s5.获取目的片段，具体包括：
[0147]
s501.用限制性内切酶ecor
ꢀⅴ
和sal i分别对pmd18
‑
t
‑
ezh2和pet
‑
32a进行双酶切，37℃水浴1h；20ul酶切反应体系如表14所示：
[0148]
表14：pmd18
‑
t
‑
ezh2双酶切反应体系
[0149][0150]
s502.凝胶电泳，回收2300bp左右和5900bp左右的片段，电泳及回收步骤如s105所示。
[0151]
利用回收的2300bp和5900bp左右的片段构建原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，具体包括：
[0152]
s601.目的片段的连接：将回收所得的5900bp左右的片段与2300bp左右的片段进行连接，20ul连接反应体系如表15：
[0153]
表15：pet
‑
32a载体片段与ezh2的连接反应体系
[0154][0155]
s602.混匀后，12～16℃，16h过夜；
[0156]
s603.第二天在连接管内加入2ul solution
ꢀⅲ
混匀后取10ul转化至rosetta感受
态细胞中，转化过程如步骤s202所示，得到原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2。
[0157]
s7.原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr扩增鉴定，其过程包括与步骤s3相同。
[0158]
s8.原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定，其具体过程包括：
[0159]
s801.pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定：用ecor
ꢀⅴ
和sal i对pet
‑
32a
‑
ezh2进行双酶切，20ul酶切反应体系如表16：
[0160]
表16：酶切反应体系
[0161][0162]
s802.样品加完后，混匀，37℃水浴1h；
[0163]
s803.酶切产物跑电泳观察存图，看是否出现5900bp左右和2300bp左右的两个条带。
[0164]
(三)电泳及扩增结果
[0165]
1.ezh2的扩增鉴定结果
[0166]
提取雏鸡肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺总rna，然后利用rt
‑
pcr扩增鸡ezh2后经琼脂糖凝胶电泳出现约2300bp的目的片段符合预期片段大小，如图2所示；
[0167]
2.pmd18
‑
t
‑
ezh2的鉴定结果
[0168]
2.1pmd18
‑
t
‑
ezh2的pcr鉴定结果：挑取转化后的单个菌落进行pcr鉴定，产物跑电泳后，出现2300bp左右的目的片段，符合预期片段大小，如图3所示；
[0169]
2.2pmd18
‑
t
‑
ezh2的酶切鉴定结果：pcr鉴定正确的菌落摇菌培养提质粒，用ecor
ꢀⅴ
、xho i进行双酶切后出现2300bp和2600bp左右的片段，用bamh i酶切后出现4000bp和400bp大小的片段，符合预期片段大小，见图4所示；
[0170]
2.3pmd18
‑
t
‑
ezh2的测序结果：从鸡脾脏中扩增并构建的pmd18
‑
t
‑
ezh2的测序结果与ezh2基因序列一致，同源性为100％，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0171]
3.pet
‑
32a
‑
ezh2的鉴定结果：
[0172]
3.1pet
‑
32a
‑
ezh2的pcr鉴定结果
[0173]
挑转化后的单个菌落进行菌落pcr鉴定，pcr产物跑电泳后，出现2300bp左右的片段，如图5所示；
[0174]
3.2pet
‑
32a
‑
ezh2的酶切鉴定结果
[0175]
pcr鉴定正确的菌落接菌培养提质粒，用ecor
ꢀⅴ
和sal i进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果出现位于2300bp左右的条带和5900bp左右的质粒条带，见图6所示；
[0176]
3.3pet
‑
32a
‑
ezh2的测序结果
[0177]
测序结果表明ezh2基因核苷酸序列完全正确，说明克隆片段为ezh2基因序列。
[0178]
通过上述结果表明：提取雏鸡肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺总rna，然后利用rt
‑
pcr扩增约2300bp的目的片段，与ezh2基因大小一致；将其克隆入pmd18
‑
t载体，构建克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2，pcr和酶切均可见2300bp左右的目的条带，进一步测序结果显示鸡脾脏中扩增并克隆构建的重组质粒中ezh2基因核苷酸序列完全正确；对构建好的重组质粒pmd18
‑
t
‑
ezh2和原核表达载体pet
‑
32a分别进行双酶切，将所得目的片段进行连接，构建重组原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，用eocr v和sal i酶切可见2300bp左右的目的带和5900bp左右的质粒条带，进一步测序结果显示重组质粒中ezh2基因核苷酸序列完全正确；以上结果证实，本实验成功构建了ezh2原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，为下一步获得ezh2原核表达蛋白奠定基础，也可为探究ezh2基因在鸡肿瘤性疾病中的作用机制提供材料。ezh2是聚硫蛋白复合物基因家族的重要成员之一，通过对核小体的修饰、染色体的重塑及干扰其他转录因子的转录调节，在胚胎的发育、细胞增殖及周期调节中起着重要作用，因此，通过本发明所述方法构建的ezh2的原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2能够应用于鸡肿瘤性疾病药物的制备。
[0179]
(四)通过上述ezh2的原核表达载体的构建方法，可以得出：
[0180]
1.在本实验中，我们首先获取鸡脾脏、肝脏、法氏囊和胸腺总rna，以不同组织cdna为模板开始扩增ezh2片段，pcr扩增出大小约2300bp产物，克隆至pmd18
‑
t载体后，将8个阳性克隆分别送去测序确认，其中脾脏中获取的dna序列完全正确，得到了预期大小的dna序列；
[0181]
2.本实验成功扩增出鸡ezh2基因，然后成功构建出重组克隆载体pmd18
‑
t
‑
ezh2，然后利用ecor
ꢀⅴ
和sal i分别对pmd18
‑
t
‑
ezh2和pet
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32a进行双酶切，获得目的片段，最后对目的片段进行连接，并将重组质粒转化入rosetta感受态，成功构建出了原核表达载体pet
‑
32a
‑
ezh2，为下一步获得ezh2原核表达蛋白奠定基础，便于后续实验和研究；
[0182]
3.本实验包括提rna、反转录、提质粒、酶切、回收、连接、转化等一系列步骤，每一步操作不当都会对最终结果产生一定的影响。
[0183]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。