一种沙门氏菌的CPA检测引物及检测试剂盒和检测方法与流程

一种沙门氏菌的cpa检测引物及检测试剂盒和检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种沙门氏菌的cpa检测引物及检测试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.沙门氏菌是一种常见的食物传播性的人畜共患病病原菌，可通过被污染的食品、饲料或粪便感染人和动物，可在人和动物的肠道中寄生生存，临床表现为败血症、胃肠炎及其他组织的局部炎症和食物中毒，对人类和动物生命健康造成很大危害。沙门氏菌的主要传播媒介是通过家禽、蛋、奶、肉类等营养丰富的禽畜产品进行传播，容易污染水源及食品等。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列于榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。在我国每年有3亿人作呕因感染沙门氏菌而患病，占食源性致病菌总致病的70％
‑
80％，严重危害人类身体的健康安全。沙门氏菌鉴定的传统方法主要是根据形态学特征、培养特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌体特征等
3.目前微生物的检测鉴定方法主要分为传统培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法的操作繁琐、实验周期长，而免疫检测法对实验人员专业水平要求高，成本较高。而核酸扩增方法主要分为聚合酶链式反应和恒温扩增技术。交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification,cpa)技术与其他核酸扩增技术相比，可以通过不同的酶和特异性引物在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，设备简单，成本较低，且扩增时间大大缩短，因此在科学检验检疫技术中脱颖而出，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于弥补现有沙门氏菌检测方法的缺点和不足，提供一种沙门氏菌的cpa检测引物。
5.本发明的另一目的在于提供一种沙门氏菌的cpa检测试剂盒。
6.本发明的再一目的在于提供一种沙门氏菌的cpa检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种沙门氏菌的cpa检测引物，是针对其靶点inva设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
9.靶点inva剥离引物4s：5
’‑
ctgagcgataacagcatt
‑3’
(seq id no.1)；
10.靶点inva剥离引物5a：5
’‑
tgcgttacccagaaatac
‑3’
(seq id no.2)；
11.靶点inva交叉引物2a1s：5
’‑
tgatgataggtcgttggatgcgt ggtaaat tattcgg
‑3’
(seq id no.3)；
12.靶点inva特异引物2a：5
’‑
tgatgataggtcgttggat
‑3’
(seq id no.4)；
13.靶点inva特异引物3a：5
’‑
gccaaaggaagcgacttc
‑3’
(seq id no.5)。
14.一种沙门氏菌的cpa检测试剂盒，包括上述的沙门氏菌的cpa检测引物。
15.所述试剂盒中，各cpa检测引物的浓度优选10μm。
16.所述的试剂盒还包括如下组分：
17.a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris
‑
hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；
18.b、bst dna聚合酶；
19.c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
20.组分b中所述的bst dna聚合酶优选浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。
21.组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
22.(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；
23.(ii)取25μl 50μm的钙黄绿素溶液与10μl 1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
24.一种沙门氏菌的cpa检测方法，包括如下步骤：
25.(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od
260
/od
280
值为1.8～2.0；
26.(2)分别建立检测inva的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；
27.其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
28.(3)针对靶点inva的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有沙门氏菌；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有沙门氏菌。
29.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
30.(1)本发明中所提供的针对沙门氏菌特异性靶序列inva所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列inva的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统沙门氏菌检测的周期。
31.(2)目前，有文献报道采用交叉引物恒温扩增反应技术检测食源性致病菌，但是检测灵敏度不高，相较于普通pcr没有体现交叉引物恒温扩增技术灵敏度方面显著的优越性。而本发明确保检测的可靠性、特异性和高灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率，早期的疾病诊断具有非常重要的意义。
32.(3)本发明在恒温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单
位及现场检测。
附图说明
33.图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测沙门氏菌的引物电泳结果图；其中，1：inva
‑
1对应的引物特异性分析；2：inva
‑
2对应的引物特异性分析；3：inva
‑
3对应的引物特异性分析。
34.图2为交叉引物恒温扩增反应技术检测沙门氏菌的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，图a为交叉引物恒温扩增检测沙门氏菌的凝胶电泳结果(泳道1为沙门氏菌atcc14028，ng为空白对照)；图b为交叉引物恒温扩增反应技术检测沙门氏菌的显色结果(1为沙门氏菌atcc14028，ng为空白对照)。
35.图3为检测靶点inva特异性的实验结果图；其中，泳道1：沙门氏菌atcc14028；泳道2：大肠杆菌o157:h7atcc43895；泳道3：大肠杆菌o157:h7atcc43894；泳道4：大肠杆菌o157:h7e019；泳道5：大肠杆菌o157:h7e043；泳道6：大肠杆菌o157:h7e044；泳道7：单增李斯特菌atcc19116；泳道8：单增李斯特菌atcc19114，泳道9：单增李斯特菌atcc19115；泳道10：单增李斯特菌atcc15313；泳道11：单增李斯特菌atcc19113；泳道12：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道13：金黄色葡萄球菌atcc27664；泳道14：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nctc10442；泳道15：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315；泳道16：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌85/2082；泳道17：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ca05；泳道18：副溶血性弧菌atcc17802；泳道19：副溶血性弧菌atcc27969；泳道20：干酪乳杆菌bm
‑
lc14617，ng
‑
阴性对照。
36.图4为检测靶点inva灵敏度实验结果图；其中，泳道1为6.14ng/μl，泳道2为614pg/μl，泳道3为61.4pg/μl，泳道4为6.14pg/μl，泳道5为614fg/μl，泳道6为61.4fg/μl，泳道7为6.14fg/μl，泳道8为614ag/μl，ng
‑
阴性对照。
具体实施方式
37.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
38.实施例1
39.交叉恒温扩增反应检测沙门氏菌的引物筛选试验，包括以下步骤：
40.根据inva基因序列，利用ncbi primer
‑
blast设计后，综合比较选择评分较高的3套检测引物，并先以每组引物的4s和5a引物作为上游检测引物和下游检测引物，进行pcr扩增，从而确定该引物对应区域能否实现扩增以及4s和5a剥离引物的特异性。当反应出现单一且与对应产物大小符合时，即上下游剥离引物具有较好的特异性，若剥离引物出现非特异性扩增时会出现梯状条带，可能导致后续的假阳性结果；
41.3套检测引物设计如下：
42.inva
‑
1:
43.靶点inva剥离引物4s：5
’‑
gcgatggtgagggtctga
‑3’
(seq id no.6)；
44.靶点inva剥离引物5a：5
’‑
tgatgataggtcgttggat
‑3’
(seq id no.7)；
45.靶点inva交叉引物2a1s：5
’‑
atgccaaaggaagcgacttaatg agatcc gtgttgaa
‑3’
(seq id no.8)；
46.靶点inva特异引物2a：5
’‑
atgccaaaggaagcgacttaatg
‑3’
(seq id no.9)；
47.靶点inva特异引物3a：5
’‑
caaatcaaagtagaccgt
‑3’
(seq id no.10)。
48.inva
‑
2:
49.靶点inva剥离引物4s：5
’‑
gtattggttgttacggctat
‑3’
(seq id no.11)；
50.靶点inva剥离引物5a：5
’‑
aacgacgacccttctttt
‑3’
(seq id no.12)；
51.靶点inva交叉引物2a1s：5
’‑
ccaccgataaaataacaatttca atggga actctgc
‑3’
(seq id no.13)；
52.靶点inva特异引物2a：5
’‑
ccaccgataaaataacaatttca
‑3’
(seq id no.14)；
53.靶点inva特异引物3a：5
’‑
aaccggcagtgggaatccc
‑3’
(seq id no.15)。
54.inva
‑
3:
55.靶点inva剥离引物4s：5
’‑
ctgagcgataacagcatt
‑3’
(seq id no.1)；
56.靶点inva剥离引物5a：5
’‑
tgcgttacccagaaatac
‑3’
(seq id no.2)；
57.靶点inva交叉引物2a1s：5
’‑
tgatgataggtcgttggatgcgt ggtaaat tattcgg
‑3’
(seq id no.3)；
58.靶点inva特异引物2a：5
’‑
tgatgataggtcgttggat
‑3’
(seq id no.4)；
59.靶点inva特异引物3a：5
’‑
gccaaaggaagcgacttc
‑3’
(seq id no.5)。
60.pcr扩增的条件为：63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
61.pcr扩增的体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，去核酸水补足2.5μl，最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。
62.图1为inva
‑
1，inva
‑
2和inva
‑
3对应的引物特异性分析结果，结果表明实验设计inva
‑
1和inva
‑
2的检测沙门氏菌的inva引物无法实现特异性扩增，后续会导致cpa反应特异性检测的结果，可能将非特异性扩增产生的梯状条带判读为假阳性的反应结果。因此选用inva
‑
3检测引物进行后续实验验证。
63.实施例2
64.基于交叉引物恒温扩增反应技术检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
65.1、基于交叉引物恒温扩增反应技术检测病原微生物的方法，本实施例以沙门氏菌为例，其使用试剂如下：
66.a.浓度各为10μm的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文seq id no.1
‑
seq id no.5所示；
67.b.2
×
反应储液：由浓度为40.0mm的tris
‑
hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)组成；
68.c.浓度为8u/μl的bst dna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；
69.d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl 50μm的钙黄绿素溶液，与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
70.2、使用上述试剂利用交叉引物恒温扩增反应技术检测沙门氏菌，包括如下步骤：
71.(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：
72.本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为一株沙门氏菌atcc14028，由公开途径获得；
73.采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od
260
/od
280
的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
74.(2)建立检测inva的交叉引物恒温扩增反应：
75.在反应管中配制总体积为26μl的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2
×
反应储液12.5μl，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μl，交叉引物2a1s 2.5μl，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μl，bst dna聚合酶1μl，dna模板1.0μl，用去核酸水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris
‑
hcl 20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bst dna聚合酶8u，剥离引物4s、5a各0.6μm，交叉引物2a1s 1.0μm，特异引物2a及3a各0.5μm。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
76.(3)显色检测：
77.待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。
78.结果如图2所示，结果显示：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有沙门氏菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有沙门氏菌，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
79.实施例3
80.交叉恒温扩增反应检测沙门氏菌特异性试验，包括以下步骤：
81.将沙门氏菌与非沙门氏菌的基因组dna按照实施例1中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；其中，非沙门氏菌为：大肠杆菌o157:h7atcc43895；大肠杆菌o157:h7atcc43894；大肠杆菌o157:h7e019；大肠杆菌o157:h7e043；大肠杆菌o157:h7e044；单增李斯特菌atcc19116；单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特菌atcc19115；单增李斯特菌atcc15313；单增李斯特菌atcc19113；铜绿假单胞菌atcc27853；金黄色葡萄球菌atcc27664；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nctc10442；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌85/2082；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ca05；副溶血性弧菌atcc17802；副溶血性弧菌atcc27969；干酪乳杆菌bm
‑
lc14617。
82.设置沙门氏菌基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，加入沙门氏菌基因组的反应体系呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
83.如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测沙门氏菌的引物具有较高的特异性。
84.实施例4
85.交叉恒温扩增反应检测沙门氏菌的灵敏度对比试验，包括以下步骤：
86.交叉恒温扩增反应检测沙门氏菌的灵敏度试验：
87.将沙门氏菌的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为6.14ng/μl，614pg/μl，61.4pg/μl，6.14pg/μl，614fg/μl，61.4fg/μl，6.14fg/μl，614ag/μl ng
‑
阴性对照；
88.同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例2中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。
89.结果如图4所示，样品中沙门氏菌dna的浓度高于6.14pg/μl的均出现了梯形条带，呈现阳性结果。结果表明：建立的沙门氏菌交叉恒温扩增反应方法可检测样品中6.14pg/μl反应的沙门氏菌dna。
90.结论：从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr相比具有如下优点：
91.操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要2～3小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。
92.特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。
93.灵敏度高:针对沙门氏菌的检测限为6.14pg/μl，是常规pcr反应10
‑
100倍左右，具有较高的灵敏度。
94.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。