一种抑制脂肪酶活性的红藻-乳杆菌发酵液的制备方法与流程

一种抑制脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法
技术领域
1.本发明涉及食品发酵技术领域，具体涉及一种抑制胰脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法。


背景技术：

2.研究发现，食物中的脂肪在肠道中被胰脂肪酶分解成甘油单酯和脂肪酸后才能被小肠吸收利用，或重新组成人体脂肪。因此，胰脂肪酶是影响脂肪分解、吸收和代谢的关键酶之一。抑制肠道中胰脂肪酶的酶活性有助于控制食物脂肪的分解、吸收和利用，从而起到减肥降脂的功效。近年来，半合成的胰脂肪酶抑制剂orlistat虽然已经在临床中广泛使用，但患者服用后容易产生头痛、腹泻、胀气等副作用，并且其他现有的减肥降脂药物或方法大都存在毒副作用大、易反弹等缺点。因此，研究一种天然的胰脂肪酶抑制剂在辅助降血脂和控制肥胖方面具有重要意义。
3.目前，红毛藻加工行业存在原料昂贵、产品种类单一、附加值低和竞争力弱的问题，开发利用程度较低，影响红毛藻增养殖产业的发展。
4.目前，我国紫菜加工业整体处于加工品种单一，开发利用程度较低，市售主要为干制品，产品附加值低等问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提出一种抑制胰脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法，该方法提高海洋红藻原有的生物活性与营养价值，明确加工技术，探明具有最佳的脂肪酶抑制效果的海洋红藻
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乳杆菌组合，开发具有辅助降血脂活性的海藻健康食品，促进海藻深加工产品的多元化和加工技术的多层次化，推动我国海藻精深产业的快速发展。
6.为了实现上述目的，本发明的实施例在一方面提出了一种抑制胰脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法，其包括：
7.(1)挑选新鲜红毛藻和紫菜洗净，干燥至恒重；
8.(2)将所述红毛藻和所述紫菜分别与纯净水以1：100～3：100的比例混合得到红毛藻溶液和紫菜溶液；
9.(3)在所述红毛藻溶液和所述紫菜溶液中加入2％～5％的葡萄糖，于60℃～65℃下灭菌30min后，降温至37℃以下；
10.(4)向步骤(3)处理后的红毛藻溶液和紫菜溶液中分别添加2％～5％的德氏乳杆菌菌液或植物乳杆菌菌液作为发酵剂，发酵24～72h后，得到红毛藻
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徳氏乳杆菌发酵液、紫菜
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徳氏乳杆菌发酵液、红毛藻
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植物乳杆菌发酵液和紫菜
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植物乳杆菌发酵液；
11.(5)将步骤(4)的四种发酵液离心、过滤，去除藻渣和乳杆菌菌体，得到四种发酵上清液，分析四种发酵上清液对脂肪酶酶活力的抑制率。
12.根据本发明实施例的一种抑制胰脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法，该方法获得的四种红藻
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乳杆菌发酵液均对胰脂肪酶酶活具有较高的抑制活性，其中徳氏
乳杆菌发酵红毛藻后获得的发酵液对胰脂肪酶的抑制效果最好，对胰脂肪酶的抑制率高达93.6％，最具有降脂活性；从而可提高海洋红藻原有的生物活性与营养价值，明确加工技术，探明具有最佳的脂肪酶抑制效果的海洋红藻
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乳杆菌组合，开发具有辅助降血脂活性的海藻健康食品，促进海藻深加工产品的多元化和加工技术的多层次化，推动我国海藻精深产业的快速发展。
13.根据本发明实施例提出的一种抑制胰脂肪酶活性的红藻
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乳杆菌发酵液的制备方法，还包括以下特征：
14.可选地，步骤(4)中，德氏乳杆菌菌液和植物乳杆菌菌液的活菌数为1
×
106～3
×
10
10
cfu/g。
15.可选地，步骤(5)中，四种红藻
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乳杆菌发酵上清液组合中对脂肪酶酶活力抑制效果最好的是红毛藻
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德氏乳杆菌发酵液，其次为紫菜
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植物乳杆菌发酵液。
16.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
17.图1为根据本发明实施例的红毛藻
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乳杆菌发酵期间多酚含量的变化；
18.图2为根据本发明实施例的紫菜
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乳杆菌发酵期间多酚含量的变化；
19.图3为根据本发明实施例的红毛藻
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乳杆菌发酵期间黄酮含量的变化；
20.图4为根据本发明实施例的紫菜
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乳杆菌发酵期间黄酮含量的变化；
21.图5为根据本发明实施例的红藻
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乳杆菌发酵液对胰脂肪酶的抑制率；
22.图6为根据本发明实施例的两种红藻自然发酵作为对照组在不同浓度情况下对脂肪酶的抑制率；
23.图7为根据本发明实施例的德氏乳杆菌发酵两种红藻作为对照在不同浓度情况下对脂肪酶的抑制率；
24.图8为根据本发明实施例的植物乳杆菌发酵两种红藻作为对照在不同浓度情况下对脂肪酶的抑制率。
具体实施方式
25.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
26.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
27.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
28.胰脂肪酶(20000u/mg，源于猪胰腺，西格玛奥德里奇(上海)有限公司)；对硝基苯酚(pnp，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；4
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硝基苯棕榈酸酯(pnpp，br，西格玛奥德里奇(上海)有限公司)；其余化学试剂均为分析纯。
29.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
30.实施例1
31.挑选新鲜红毛藻和紫菜将其洗净后分别放入烘箱，60℃下干燥至恒重；将处理好的红毛藻和紫菜分别与纯净水以1：100的料液比(g/ml)混合得到红毛藻溶液和紫菜溶液。
32.分别在红毛藻溶液和紫菜溶液中加入2％(葡萄糖与水的比例为2：100)的葡萄糖，然后升温到65℃保持30min进行灭菌；之后，将红藻悬浊溶液和紫菜溶液降温至37℃以下，再向红毛藻溶液和紫菜溶液中分别添加5％的德氏乳杆菌菌液或植物乳杆菌菌液作为发酵剂，在37℃下静止发酵72h；得到四种红藻
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乳杆菌发酵溶液：红毛藻
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徳氏乳杆菌发酵溶液、紫菜
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徳氏乳杆菌发酵溶液、红毛藻
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植物乳杆菌发酵溶液和紫菜
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植物乳杆菌发酵溶液。
33.将四种红藻
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乳杆菌发酵溶液在4000rpm转速下离心20min后，去除藻渣和乳杆菌菌体，经2μm膜过滤，获得四种红藻
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乳杆菌发酵上清液。
34.实施例2
35.挑选新鲜红毛藻和紫菜将其洗净后分别放入烘箱，60℃下干燥至恒重；将处理好的红毛藻和紫菜分别与纯净水以2：100的料液比(g/ml)混合得到红毛藻溶液和紫菜溶液。
36.分别在红毛藻溶液和紫菜溶液中加入4％的葡萄糖，然后升温到60℃保持30min进行灭菌；之后，将红藻悬浊溶液和紫菜溶液降温至37℃以下，再向红毛藻溶液和紫菜溶液中分别添加3％的德氏乳杆菌菌液或植物乳杆菌菌液作为发酵剂，在37℃下静止发酵48h；得到四种红藻
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乳杆菌发酵溶液：红毛藻
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徳氏乳杆菌发酵溶液、紫菜
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徳氏乳杆菌发酵溶液、红毛藻
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植物乳杆菌发酵溶液和紫菜
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植物乳杆菌发酵溶液。
37.将四种红藻
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乳杆菌发酵溶液在4000rpm转速下离心20min后，去除藻渣和乳杆菌菌体，经2μm膜过滤，获得四种红藻
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乳杆菌发酵上清液。
38.实施例3
39.挑选新鲜红毛藻和紫菜将其洗净后分别放入烘箱，60℃下干燥至恒重；将处理好的红毛藻和紫菜分别与纯净水以3：100的料液比(g/ml)混合得到红毛藻溶液和紫菜溶液。
40.分别在红毛藻溶液和紫菜溶液中加入5％的葡萄糖，然后升温到65℃保持30min进行灭菌；之后，将红藻悬浊溶液和紫菜溶液降温至37℃以下，再向红毛藻溶液和紫菜溶液中分别添加5％的德氏乳杆菌菌液或植物乳杆菌菌液作为发酵剂，在37℃下静止发酵48h；得到四种红藻
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乳杆菌发酵溶液：红毛藻
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徳氏乳杆菌发酵溶液、紫菜
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徳氏乳杆菌发酵溶液、红毛藻
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植物乳杆菌发酵溶液和紫菜
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植物乳杆菌发酵溶液。
41.将四种红藻
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乳杆菌发酵溶液在4000rpm转速下离心20min后，去除藻渣和乳杆菌菌体，经2μm膜过滤，获得四种红藻
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乳杆菌发酵上清液。
42.实施例4
43.挑选新鲜红毛藻和紫菜将其洗净后分别放入烘箱，60℃下干燥至恒重；将处理好的红毛藻和紫菜分别与纯净水以1：100的料液比(g/ml)混合得到红毛藻溶液和紫菜溶液。
44.分别在红毛藻溶液和紫菜溶液中加入2％的葡萄糖，然后升温到60℃保持30min进
行灭菌；之后，将红藻悬浊溶液和紫菜溶液降温至37℃以下，再向红毛藻溶液和紫菜溶液中分别添加5％的德氏乳杆菌菌液或植物乳杆菌菌液作为发酵剂，在37℃下静止发酵48h；得到四种红藻
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乳杆菌发酵溶液：红毛藻
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徳氏乳杆菌发酵溶液、紫菜
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徳氏乳杆菌发酵溶液、红毛藻
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植物乳杆菌发酵溶液和紫菜
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植物乳杆菌发酵溶液。
45.将四种红藻
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乳杆菌发酵溶液在4000rpm转速下离心20min后，去除藻渣和乳杆菌菌体，经2μm膜过滤，获得四种红藻
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乳杆菌发酵上清液。
46.试验例
47.为了使实验结果更具有说服力，该试验例还使用两种红藻的未发酵溶液(unfer)、德氏乳杆菌菌液(ld)及植物乳杆菌菌液(lp)进行实验，排除藻本身及菌本身的影响。
48.1、多酚含量测定
49.采用folin－ciocalteu测定样品中的总多酚含量。将准确称取的0.1g没食子酸用蒸馏水定容至100ml，得浓度1000μg/ml的没食子母液，分别取母液0、1、2、3、4、5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度为0、10、20、30、40、50μg/ml的系列标准溶液。取1ml标准液于10ml容量瓶，加入福林酚显色剂1ml及7.5％na2co33ml后，用蒸馏水定至10ml，混匀，避光反应2h，波长765nm处测定吸光度。分别以没食子酸质量浓度和吸光度为横纵坐标，制作标准曲线:y＝0.1042x 0.0589，r2＝0.9998，其中y值为吸光度，x值为没食子酸标准溶液浓度(μg/ml)。每个样品平行测定3次，总多酚含量表示为每毫升发酵上清液相当于没食子酸的毫克数。
50.结果如图1和图2所示，其中，unfer表示未发酵组，ldfer表示德氏乳杆菌发酵组，lpfer表示植物乳杆菌发酵组。实施例1中四种红藻
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乳杆菌组合发酵后多酚含量显著提升。其中红毛藻
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徳氏乳杆菌上清液中多酚含量最为丰富。多酚不仅有强抗氧化能力，还可以有效地预防高脂食物在人体内产生的衍生物对人体产生不利的影响，所以富含多酚的四种红藻
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乳杆菌发酵上清液可供患有肥胖症、高血脂或高血糖以及脂质代谢障碍等人群服用。也为后续开发红藻功能性食品提供参考。
51.2、黄酮含量测定
52.采用亚硝酸钠－硝酸铝法测定样品中的总黄酮含量。称取芦丁10.0mg，用无乙醇定容至50ml，获得0.1mg/ml芦丁母液，分别取0、1、2、3、4、5ml芦丁母液依次加入25ml比色管中，用蒸馏水稀释体积至10ml，摇匀加入1ml 5％的亚硝酸钠，摇匀后静置6min；加入1ml 10％的硝酸铝，摇匀后静置6min，再加入5ml1 mol/ml的氢氧化钠，无水乙醇定容至25ml，振荡摇匀于510nm下测定吸光值。分别以芦丁溶液浓度和吸光度为横纵坐标，吸光为纵坐标，制作标准曲线:y＝0.0056x 0.0483，r2＝0.9996，其中y值为吸光度，x值为芦丁标准溶液浓度(μg/ml)。所有样品都平行测定3次，黄酮含量表示为每毫升发酵上清液相当于芦丁的毫克数。
53.结果如图3和图4所示，四种红藻
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乳杆菌组合发酵后黄酮含量显著提升。黄酮可以改善血液循环，降胆固醇、降血糖等功效，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状。四种红藻
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乳杆菌组合中黄酮的提高更有利于患有高血脂或高血糖以及脂质代谢障碍等人群服用。
54.3、胰脂肪酶抑制活性
55.红藻
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乳杆菌发酵产物上清液：从实施例2四种红藻
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乳杆菌发酵上清液中，精密吸
取1ml的发酵液在tris
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hcl缓冲液中进行对半稀释，反应体系中乳杆菌发酵红藻溶液的终浓度为0％、0.125％、0.25％、0.5％、1％。
56.各取50μl样品和胰脂肪酶液混合，置于37℃水浴锅中温育10min，再向其中添加100μl底物溶液起始反应，在37℃下反应10min后，于405nm波长下测定其吸光度值。以奥利司他(orlistat)作为阳性对照，以同样体积tris
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hcl代替发酵液作为空白对照，每组实验体系设定3个平行实验。实验体系如下表1：
[0057][0058]
结果如图5所示，实施例2中四种红藻
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乳杆菌组合均对胰脂肪酶有抑制活性。其中抑制效果最好的是红毛藻
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徳氏乳杆菌组合，对胰脂肪酶的抑制率高达95.3％，其次是紫菜
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植物乳杆菌组合，对胰脂肪酶的抑制率高达90.8％。阳性对照组奥利司他半抑制浓度ic50为1.31ug/ml。
[0059]
结合图6
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图8，随着样品浓度的增大，实施例2中四种红藻
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乳杆菌(组合对胰脂肪酶抑制率逐渐增大，呈现出明显的剂量依赖性。胰脂肪酶被认为是脂肪分解代谢关键酶，能够催化甘油三酯水解为2
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单酰甘油和脂肪酸。食物中的脂肪通常只有被胰脂酶水解后才能进一步被机体吸收。适当抑制胰脂肪酶活性，可以阻碍脂肪的消化吸收，从而达到预防或辅助治疗高血脂、高血糖或肥胖症的目的。
[0060]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
[0061]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。