一株黄曲霉拮抗菌的应用的制作方法

1.本发明涉及一种株黄曲霉拮抗菌的应用，属于农产品贮藏技术领域。


背景技术：

2.黄曲霉会侵染一些重要粮食和经济作物，例如玉米、花生、豆类等，并且在储藏、运输等过程中，产生大量的致癌性剧毒化合物
‑
黄曲霉毒素，造成大量粮食和饲料等损失。
3.黄曲霉毒素对畜禽和人类的健康存在巨大威胁。黄曲霉毒素(aflatoxin，aft)是一种真菌毒素，由黄曲霉产生。黄曲霉毒素为剧毒物质，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的作用，被国际癌症研究机构评定为ι类致癌物质，是肝癌的主要致癌物质。研究表明全球有5亿以上的发展中国家的人口长期受到黄曲霉毒素的威胁。畜禽采食黄曲霉毒素污染的饲料会导致中毒、疾病甚至死亡，给畜牧业造成巨大的经济损失，而奶牛采食被黄曲霉污染的饲料，不但产奶性能降低，肝功能受损，免疫力下降，而且毒素还会转移到牛奶中，对人类健康造成严重威胁。黄曲霉毒素主要分为b1，b2，g1， g2，m1和m26亚型，其中b1(aflatoxin，afb1)毒性最强。研究表明我国饲料中afb1 的污染很普遍；其中，饼粕类中的afb1超标率最高，为13.2％，其含量超过国家规定的限量标准1倍以上，存在较高的安全隐患。此外，黄曲霉毒素具有非常稳定的理化性质，工业加工、日常烹饪及巴氏消毒均不能有效地去除黄曲霉毒素，这使得黄曲霉毒素在食物链中持续存在而长期威胁公众的身体健康。因此，为了保护动物和人类健康，需要采取措施降低饲料黄曲霉毒素污染。
4.现有的黄曲霉毒素防控手段主要包括化学防控和生物防控。化学防控是通过采用化学试剂控制黄曲霉菌生长或破坏黄曲霉毒素。但利用自然界天然存在的拮抗微生物的生物防控手段被认为是很有潜力、吸引力、有很好的可控效果的。同时，生物防控技术得到了广泛的认可，特别是在环境保护上，可以替代很多人工合成的化学试剂的使用，减少了环境污染。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株黄曲霉拮抗菌的应用。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株黄曲霉拮抗菌的应用，将含有生防菌pantoea vagans bwl1的微生物制剂与饲料混合均匀；所述生防菌pantoeavagans bwl1，已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国武汉，武汉大学。保藏编号为cctcc no：m2021001。
7.优选的技术方案为：所述微生物制剂的生防菌pantoea vagans bwl1的活菌数大于或等于108cfu/ml。
8.优选的技术方案为：微生物制剂与饲料的质量比例为1:500
‑
1000。
9.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
10.1、本发明筛选得到一株生防菌pantoea vagans bwl1，能够高效拮抗青霉菌和灰
霉菌。
11.2、经过发明方法处理饲料，黄曲霉病受到显著抑制，afb1产生量降低约90％。
附图说明
12.图1为pantoea vagans bwl1形态。标尺＝50μm。
13.图2为pantoea vagans bwl1对黄曲霉生长的抑制作用。通过平板对峙法可见pantoeavagans bwl1能有效抑制黄曲霉菌丝生长。
14.图3为pantoea vagans对黄曲霉菌的孢子萌发、芽管伸长的抑制作用。标尺＝20μm。
15.图4为pantoea vagans bwl1对花生黄曲霉病的抑制效果。
16.图5为pantoea vagans bwl1对花生黄曲霉素afb1产生量的抑制效果。
17.图6为pantoea vagans bwl1对玉米黄曲霉病的抑制效果。
18.图7为pantoea vagans bwl1对玉米黄曲霉素afb1产生量的抑制效果。
具体实施方式
19.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
20.实施例1：一株黄曲霉拮抗菌的应用
21.一株高效拮抗黄曲霉菌的生防菌pantoea vagans bwl1，已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021001。生防菌pantoea vagans bwl1，分离自健康柑橘果实表面，是果实习居菌，采用平板对峙法，发现生防菌pantoea vagans bwl1 对黄曲霉菌具有显著抑制作用。生防菌pantoea vagans bwl1分离、筛选、鉴定方法如下。
22.(1)拮抗菌的分离
23.取市售健康柑橘，放入已灭菌的500ml烧杯中，加入灭菌水200ml，150r/min振荡1h。取悬浮培养液稀释成10
‑1、10
‑2、10
‑3后，取100μl涂布到lb固体平板上，25℃倒置静止培养24h。挑取单菌落到新的lb固体平板进行划线培养，对获得的单克隆菌株第二次划线培养，获得纯种菌株。
24.获得的菌株保藏于30％的甘油中，置于
‑
80℃低温环境中。
25.所述的lb培养基，其制作方法为：在950ml的去离子水中加入酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，溶解后以5n的naoh调节ph至7.0，定容至1l，121℃高压蒸汽灭菌 20min后备用。
26.(2)拮抗菌的筛选
27.菌株的抑菌效果测试采用平板对峙法。将黄曲霉菌菌丝块接种于pda平板上，25℃培养 7天，此时黄曲霉菌大约长到2/3
‑
3/4盘，以打孔器从平板上靠近菌丝边缘位置取直径0.5cm 的黄曲霉菌菌饼，接种到新的pda平板上，25℃培养3
‑
5天；将已纯化的细菌接种于液体 lb培养基中，25℃培养过夜，以接种环蘸取菌液在黄曲霉菌平板上划线，25℃培养3天后观察抑菌效果。
28.所述的pda培养基，即常用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
29.(3)拮抗菌的鉴定
30.选取有抑制效果的菌株，通过对16s rdna、atp synthase(atpd)和recombinase(reca)基因进行扩增并测序，在ncbi(美国国家生物技术信息中心)数据库中进行比对，将菌株鉴定为 pantoea vagans，并将菌株编号为bwl1。16s rdna、atpd和reca基因扩增片段已提交至ncbi 数据库，序列号依次为mw133037、mw221267和mw221265。
31.鉴定所用引物、pcr反应条件以及扩增片段序列如下：
32.16srdna基因扩增片段测序结果：
[0033]5’‑
gcagtcggacggtagcacagagagcttgctcttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaat gtctggggatctgcccgatagagggggataaccactggaaacggtggctaataccgcataacgtcgc aagaccaaagagggggaccttcgggcctctcactatcggatgaacccagatgggattagctagtagg cggggtaatggcccacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaac tgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctga tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcg atgcggttaataaccgcgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagca gccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtc tgttaagtcagatgtgaaatccccgggcttaacctgggaactgcatttgaaactggcaggcttgagtc ttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtgg cgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattag ataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccgg agctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgg gggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttg acatccacggaatttggcagagatgccttagtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggct gtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgc cagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgt caagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcaa cctcgcgagagcaagcggacctcacaaagtgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactcc gtgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtaca caccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaacctcggaggcgct
‑3’
。
[0034]
atpd基因扩增片段测序结果：
[0035]5’‑
agtatgaatggtgatgcgcgtctggtgctggaagttcagcaacagctcggcggcggcgtagta cgtaccatcgcaatgggtacgtctgacggcctgaagcgtggtctgagcgtcaacgacctgcagaaac cgattcaggtacccgtcggtaaagcgaccctgggccgtatcatgaacgttctcggcgagccaatcgat atgaaaggcgagctgaaagaagaagatggcagcgcagtagagatcgcctctattcaccgcgcagccc cttcttatgaagatcagtctaactcgcaggaactgctggaaaccggcatcaaggttatcgacctgatg tgtccgtttgctaaaggcggtaaagtcggtctgttcggtggtgcgggtgtaggtaaaaccgtcaaca tgatggaactgatccgtaacatcgcggctgaacactcaggttactcagtgtttgccggtgtgggtgag cgtactcgtgagggtaacgacttctaccacgaaatgactgactctaacgttatcgataaagttgcact ggtctatggccagatgaacgagccgccgggtaaccgtctgcgcgtagcactgaccggtctgaccatg gcggaaaaattccgtgatgaaggccgcgacgttctgctgttcatcgataacatctaccgttataccctg gccggtacagaagtttctgcactgctgggtcgtatgccatctgcggtaggttaccagccaacgctggc agaagagatgggtgtgttgcaggagcgtattacctccaccaagaccggttcaatcacctccgtacag gccgtttacgtccctgcggatgacctgactgacccatcaccagcaactacctttgcgcacttagactc aacggtaacgctgag
ccgtcagatcgcctctctgggtatctacccggccgttgacccgctggactcta ccagccgtcagctggatccgctggttgtcggtcaggagcactatgatgttgcacgtggcgttcagtca ctgctgcagcgttatcaggaactgaaagacatcatcgccatcctcggtatggatgagctgtctgaaga agacaaactgctggtggcacgtgcgcgtaagattcagcgcttcctgtctcagccgttcttcgttgcag aagtattcaccggttcaccgggcaaatacgtgacgctgaaagacactatccgtggctttaaaggcatc atggaaggtgagtttgaccacctgccaagagc
‑3’
。
[0036]
reca基因扩增片段测序结果：
[0037]5’‑
gcgtaaggtaaacctgtgcctttatcgatgccgagcatgcgcttgatccggtttacgccaaga aactcggcgtagacattgataacctgctctgctctcagccagacactggtgagcaggcgctggaaat ttgtgatgcgctggcgcgctctggtgccgttgacgtgatcatcgtcgactccgtcgcggcgctgacgc ctaaagcggaaatcgaaggtgaaatcggtgactcacacatgggcctcgcggcacgtatgatgagcca ggcgatgcgtaaactggccggtaacctgaagcagtccaataccctgctgattttcatcaaccagatcc gtatgaaaattggtgtgatgtttggtaacccggaaaccaccactggtggtaacgcgctgaagttctac gcctctgtccgtcttgatatccgccgtatcggtgcaatcaaagagggcgataacgtggtcggcagtga gacccgcgttaaagtggtgaaaaacaaaatcgccgcgccattcaaacaggctgagttccagatcatg tacggcgaaggtatcaatacctttggtgagctggtcgacctgggcgtgaagcacaagctgattgaaa aagcgggtgcatggtacagctacaatggcgacaag
‑3’
。
[0038]
pcr扩增体系：
[0039]
组分名称添加量10
×
la taq buffer ii(mg
2
plus)5μldntps(2.5mm)9μl引物f(1μm)2μl引物r(1μm)2μldna模板0.5μl高保真taq酶0.5μlddh2o31μl
[0040]
表中所列为扩增生防菌pantoea vagans bwl1菌株16s rdna、atp synthase(atpd)和 recombinase(reca)基因序列所用的pcr体系。
[0041]
基因引物和pcr条件：
[0042][0043]
表中所列为扩增生防菌pantoea vagans bwl1菌株16s rdna、atp synthase(atpd)和 recombinase(reca)基因序列所用的引物以及pcr扩增时的退火温度和延伸时
间。pcr具体条件为：预变性95℃
×
4min、[95℃
×
20s、退火温度
×
20s、72℃
×
1延伸时间]
×
35循环、 72℃
×
10min。pcr结束后，凝胶电泳验证片段大小无误后，将pcr产物送测序公司进行测序。
[0044]
一株高效拮抗黄曲霉菌的生防菌及其在动物饲料中的应用，包括以下技术步骤。
[0045]
(1)制作生防菌pantoea vagans bwl1的微生物制剂
[0046]
生防菌pantoea vagans bwl1的微生物制剂，pantoea vagans bwl1活菌数不少于10
8 cfu/ml。该菌制剂由以下方法配制：
[0047]
(1.1)采用lb培养基，以接种环蘸取少量pantoea vagans bwl1接种于lb培养基后于25℃摇床中培养12
‑
18h；
[0048]
(1.2)取(1)中菌液，按5
‑
10％(v/v)接种于新鲜lb培养基进行扩大培养；
[0049]
(1.3)6000
×
g离心5min，弃上清，加入1/5体积磷酸盐缓冲液(0.5m，ph7.0)重悬浮；
[0050]
(1.4)加入10％(w/v)羧甲基纤维素钠、0.5％(w/v)糊精、0.2％(w/v)海藻酸钠，搅拌均匀，真空低温干燥(真空表压
‑
0.05～
‑
0.100mpa、温度20～30℃)，粉碎并且过300目筛。所制得菌剂2
‑
20℃保存。
[0051]
(2)拮抗菌制剂的使用方法
[0052]
(2.1)制得的生物抗菌剂按1:500
‑
1000比例，拌于饲料中，100g菌剂可处理50
‑
100kg 饲料；
[0053]
(2)饲料经处理后，按常规方法保存。
[0054]
经过发明方法处理饲料，黄曲霉病受到显著抑制，afb1产生量降低约90％。
[0055]
(一)拮抗菌对青霉菌和灰霉菌的孢子萌发和芽管伸长的影响
[0056]
黄曲霉菌孢子悬浮液的制备。采用pda培养基(平板或斜面)分别对黄曲霉菌菌株进行活化培养，25℃培养7天，刮下菌丝，加入含20ml无菌水的三角瓶中，震荡1min，双层灭菌纱布过滤去除菌丝，通过血球计数板检测孢子浓度，即得到黄曲霉菌孢子悬浮液。
[0057]
将pantoea vagans bwl1接种于lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5 g/l，ph7.0)中，25℃培养过夜，10000
×
g离心10min，取上清液，按10％加入pda培养基(购自杭州百思生物科技有限公司)中，倒平板，每皿含10ml培养基。将100μl黄曲霉菌孢子悬浮液涂布于该平板上，25℃培养12h后，检测孢子萌发率和芽管长度。每个重复包含9个平行，每个平行包含100个孢子。同时设置不作任何处理的pda以及添加10％lb培养基的pda对照。
[0058]
由图3可知，pantoea vagans bwl1发酵液对黄曲霉孢子萌发率及芽管长度有显著抑制作用。添加发酵液后，孢子萌发率降低17.0％(p<0.05)，芽管长度下降71.0％(p<0.05)。这表明，pantoea vagans bwl1处理可显著抑制黄曲霉菌孢子的萌发。
[0059]
(二)拮抗菌对花生黄曲霉病和afb1产生量的抑制作用
[0060]
将pantoea vagans bwl1接种于lb培养基中，25℃培养过夜，6000g离心10min，去上清，加入50mm磷酸盐缓冲液(ph 7.0)重悬，使菌浓度达到108cfu/ml，选择无损伤、无病害的花生，剥去花生衣，去除胚芽，用清水清洗后，以1％次氯酸钠表面消毒3min后以无菌水冲洗干净，置于pantoea vagans bwl1菌悬液中浸泡1min，对照组中以10μl磷酸盐缓冲液代替bwl1菌悬液。取出花生粒，置于超净台中晾干，在花生表面均匀喷洒黄曲霉菌孢子悬浮液(105个/ml)，在超净台中晾干后，在灭菌培养皿中放置一张灭菌圆片滤纸，加灭菌水使滤纸
vagansbwl1处理后，花生中afb1含量相比对照降低88％。
[0073]
图6为pantoea vagans bwl1对玉米黄曲霉病的抑制效果。经pantoea vagans bwl1处理后，玉米发病程度显著减轻。
[0074]
图7为pantoea vagans bwl1对玉米黄曲霉素afb1产生量的抑制效果。经pantoea vagansbwl1处理后，玉米中afb1含量相比对照降低91％。
[0075]
实施例2：一株黄曲霉拮抗菌的应用
[0076]
一株黄曲霉拮抗菌的应用，将含有生防菌pantoea vagans bwl1的微生物制剂与饲料混合均匀；所述生防菌pantoea vagans bwl1，已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m2021001。
[0077]
所述微生物制剂的生防菌pantoea vagans bwl1的活菌数大于或等于108cfu/ml。
[0078]
微生物制剂与饲料的质量比例为1:500。
[0079]
实施例3：一株黄曲霉拮抗菌的应用
[0080]
一株黄曲霉拮抗菌的应用，将含有生防菌pantoea vagans bwl1的微生物制剂与饲料混合均匀；所述生防菌pantoea vagans bwl1，已于2021年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m2021001。
[0081]
所述微生物制剂的生防菌pantoea vagans bwl1的活菌数大于或等于108cfu/ml。
[0082]
微生物制剂与饲料的质量比例为1:1000。
[0083]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。