乙酰胆碱酯化酶抑制剂的制作方法

本发明涉及含有木杂酚油的乙酰胆碱酯化酶抑制剂及其各种用途。先前技术乙酰胆碱为从副交感神经或运动神经末端释出，传达神经刺激的神经传达物质。乙酰胆碱通过胆碱乙酰转移酶(ChAT)合成，通过乙酰胆碱酯化酶(AChE)分解，于体内维持一定的浓度。于生体局部，若乙酰胆碱浓度低，则胆碱作动性神经传达不充分。例如于脑发生这些状态，认为是导致学习功能降低或阿尔茨海默症失智症发症的原因之一。为胆碱酯化酶抑制剂的多奈哌齐(Donepezil)(商品名：安理申(Aricept))被使用作为阿尔茨海默症失智症的治疗药。其它以治疗为目的，例如对于排尿障碍使用溴地斯的明(distigminebromide)、对于重症肌无力症使用溴地斯的明或安贝氯铵(Ambenoniumchloride)、对于作为全身麻醉时肌肉松弛药的拮抗药使用新斯的明(Neostigmine)或艾卓酚(Edrophonium)。这些都通过乙酰胆碱酯化酶阻碍作用，提升神经末端的乙酰胆碱浓度，为以改善病态效果为目标的药剂。但，这些乙酰胆碱酯化酶抑制剂共通的副作用有呕吐、恶心、腹泻等消化器症状，进行探讨副作用更少的药剂(例如专利文献1)。[现有技术文献][专利文献][专利文献1]日本特开2016-204274。技术实现要素：(发明欲解决的课题)本发明以探索、提供新颖的乙酰胆碱酯化酶抑制剂为课题。(解决课题的手段)本发明人等经过深入研究的结果意外的发现己知具有止泻药效果的木杂酚油具有乙酰胆碱酯化酶抑制作用，因而完成本发明。也就是，本发明涉及将木杂酚油作为有效成分的乙酰胆碱酯化酶抑制剂。本发明的一实施方式为含有将木杂酚油作为有效成分的乙酰胆碱酯化酶抑制剂的医药组合物或食品组合物。本发明的一实施方式为调制成经口投予用或直肠内投予用，有效成分的木杂酚油每1日对体重1kg的投予量为0.1至500mg的组合物。本发明的一实施方式为调制成非经口投予用，有效成分的木杂酚油每1日对体重1kg的投予量为0.2至300mg的组合物。本发明的其它实施方式涉及乙酰胆碱活性降低相关的疾患或状态的治疗、改善或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的重症肌无力症的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的青光眼的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的阿尔茨海默症型失智症的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的路易氏体型失智症的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的帕金森综合征的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的排尿困难的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的排便困难的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的功能性消化不良的治疗用或进展抑制用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的抗胆碱药中毒的解毒用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的非去极化肌肉松弛药的抑制(除去残存肌肉松弛作用)用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的明晰梦的发生率增加(快速动眼期睡眠比例增加)用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的精神分裂症(schizophrenia)患者的认知障碍的治疗用的医药组合物或食品组合物。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的除草剂。本发明的其它实施方式涉及将木杂酚油作为有效成分的杀虫剂(昆虫或线虫的杀虫剂)。本发明的其它实施方式涉及木杂酚油的使用，用于乙酰胆碱活性降低相关的疾患或状态的治疗、改善或进展抑制用的医药的制造。本发明的其它实施态样涉及为于对象的乙酰胆碱活性降低相关的疾患或状态的治疗方法或进展抑制方法、包含于所述对象应用有效量木杂酚油的步骤的方法。本发明的一实施态样中，所述乙酰胆碱活性降低相关的疾患或状态为由下述所成組选择的一种或多种的疾患或状态-重症肌无力症、-青光眼、-阿尔茨海默症型失智症、-路易氏体型失智症、-帕金森综合征、-排尿困难、-排便困难、-功能性消化不良、-抗胆碱药中毒、-通过非去极化肌肉松弛药的残存肌肉松弛、-明晰梦的发生率降低及-精神分裂症患者的认知障碍。本发明的一实施态样中，于对象应用木杂酚油为经口投予或直肠内投予，木杂酚油的投予量每1日对体重1kg为0.1至500mg。本发明的一实施态样中，于所述对象应用木杂酚油为非经口投予，木杂酚油的投予量每1日对体重1kg为0.2至300mg。将上述列举的本发明的一或多个特征任意组合的发明也包含于本发明的范围。(发明的效果)本发明的乙酰胆碱酯化酶抑制剂不仅有乙酰胆碱酯化酶抑制活性为基础的药效，通过木杂酚油的止泻作用，也可减低既有的乙酰胆碱酯化酶抑制剂的副作用(消化器症状)。附图说明图1表示于各浓度作图，木杂酚油的乙酰胆碱酯化酶抑制活性的图。图2表示于各浓度作图，愈创木酚的乙酰胆碱酯化酶抑制活性的图。具体实施方式本发明涉及将木杂酚油作为有效成分的乙酰胆碱酯化酶抑制剂及其各种用途。木杂酚油为本发明有效成分的木杂酚油本身从以往即为公知，收载于日本药典、美国国民处方集(NationalFormulary)等。为本发明有效成分的木杂酚油为将从山毛榉、樫、枫、松等树木，尤其是阔叶树获得的木焦油蒸馏，通过分馏，收集约200至230℃(760mmHg)的馏分获得的木杂酚油(woodcreosote)，与从煤焦油获得的杂酚油有明确的区别(N.OgataandT.Baba,Res.Commun.Chem.Pahthol.Pharmacol,66,411-423,1989))。为本发明有效成分的木杂酚油包含愈创木酚(guaiacol)、木焦油醇(creosol)、苯酚(phenol)、对甲酚(p-cresol)、4-乙基愈创木酚(4-ethylguaiacol)、邻甲酚(o-cresol)等的无色至淡黄色液体。制剂(形态)于本发明，所述木杂酚油以通常的医药组合物(例如医疗用药剂)或食品组合物(例如营养补充品)形态使用。也就是，可使用药学上容许的通常使用的赋形剂或稀释剂，依照常法调制，对应治疗目的作成各种形态。其代表物可列举锭剂、丸剂、散剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、内服液剂等应用于经口投予的剂型，注射剂等应用于血管内投予、肌肉内投予、皮下或皮内投予等剂型及栓剂等应用于直肠内投予的剂型等。于调制锭剂、颗粒剂、散剂形态时可广泛使用公知的载体，可使用例如乳糖、白糖、葡萄糖、淀粉、结晶纤维素等赋形剂，例如羟丙基纤维素、甲基纤维素、明胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、海藻酸钠等结合剂，例如淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等崩解剂，例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸等润滑剂。于锭剂，必要时可实施通常的剂皮，可作成例如糖衣锭、膜衣锭等，另外也可作成双层锭、多层锭。另外，颗粒剂或散剂也可实施通常的剂皮。于调制丸剂形态时也相同，可使用于该领域以往以来公知的各种载体，可使用例如甘草末、葡萄糖、小麦粉等赋形剂，例如甘油、水糖浆、阿拉伯树胶、黄蓍胶、明胶等结合剂，药用酵母、葛根、海带粉等崩解剂等。于调制胶囊剂形态时可使用于该领域以往以来公知的各种载体，例如乳糖、橄榄油、大豆油等赋形剂。内用液剂也可为水性或油性悬浊液、溶液、糖浆或其它形态。这些液体制剂可使用通常使用的添加剂，例如悬浊化剂、例如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、明胶、羧甲基纤维素，乳化剂、例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单烯烃酸酯、阿拉伯树胶等。于调制注射剂形态时组合物也可为如悬浊液、溶液、油性或水性媒液中的乳液的形态，可含有如悬浊化剂、稳定化剂及分散剂的处方剂。于调制栓剂形态时可广泛使用公知的载体。可使用例如可可脂、甘油明胶、聚乙二醇等基剂。栓剂必要时可使用乳化剂、悬浊化剂。另外，于本发明的药剂，必要时可添加着色剂、香味剂等。本发明的医药组合物或食品组合物中含有作为有效成分的木杂酚油的量并无特别限制，只要对应制剂的形态等适当选择即可，通常优选为制剂全重量的约0.2至60％。本发明的医药组合物或食品组合物的投予量依患者的性别、年龄、体重、症状程度等适当选择，通常于经口投予及直肠内投予时，对于成人，为有效成分的木杂酚油每1日对体重1kg为约0.1至500mg，优选为约2至100mg，更优选为约2至25mg。于作为注射剂的非经口投予时，相同的，对于成人，为有效成分的木杂酚油每1日对体重1kg为约0.2至300mg，优选为约0.2至50mg，更优选为约0.5至5mg。另外，这些可1日分成约2至4次投予。具体的用途本发明的乙酰胆碱酯化酶抑制剂可利用于种种具体的用途。例如本發明的乙醯膽鹼酯化酶抑制剂可用于治疗其它己确认有通过乙醯膽鹼酯化酶抑制劑治療效果的重症肌無力症、青光眼、阿尔茨海默症型失智症、路易氏體型失智症、帕金森综合征、排尿·排便困難、功能性消化不良等。另外，本发明的乙酰胆碱酯化酶抑制剂也可用于抗胆碱药中毒的解毒、非去极化肌肉松弛药的抑制、明晰梦的发生率增加、精神分裂症患者的认知障碍的治疗等。另外，本发明的乙酰胆碱酯化酶抑制剂从其作用机制，也可作为除草剂或杀虫剂(例如用于驱除虫的杀虫剂)使用。本说明书中使用的用语是用于说明特定实施态样，本发明不限于此。另外，本说明书中使用的“包含”的用语除去在文字上有明显不同理解的情况，意图所记载的事项(零件、步骤、要素或数字等)存在，不排除这些以外的事项(零件、步骤、要素或数字等)存在。除非有不同的定义，此处使用的所有用语(包含技术用语及科学用语)与本发明所属技术人员充分理解的用语具有相同的意思。此处使用的用语若无明示不同的定义，可解释为整合本说明书与于相关
技术领域：
的意味，于经理想化或过度形式意味不加以解释。本发明的实施态样有边参照模式图边加以说明的情况，但，于模式图时，为了明确的加以说明，有夸张表现的情况。于本说明书，例如以“1至10w/w％”表现时，技术人员可理解该表现是个别具体指出1、2、3、4、5、6、7、8、9或10w/w％。于本说明书，为了表示成分含量或数值范围使用的数值若无特别说明，解释为包含用语“约”的意思。例如“10倍”若无特别说明，理解为“约10倍”的意思。于本说明书中引用的文献，这些所有的揭示都援用于本说明书中，该技术人员依照本说明书的文字，在不偏离本发明的精神及范围内可将于这些现有技术文献中相关的揭示内容援用作为本说明书的一部分，理解之。[实施例]实施例1：测定木杂酚油的乙酰胆碱酯化酶活性＜实验材料＞1.被验物质1.1被验物质1名称：木杂酚油(以下，记载为WC)分子量：由于为混合物，未表记分子量购入商：大幸药品株式会社保存条件：冷藏(4℃)，遮光1.2被验物质2(阳性对照组(positivecontrol))名称：加兰他敏氢溴酸盐(GalantamineHydrobromide)(以下，记载为GAL)分子量：368.3制品编号：G1660-2MG购入商：Sigma-Aldrich保存条件：冷冻(-20℃)＊加兰他敏(galantamine)己知为具有乙酰胆碱酯化酶抑制作用的物质，用于轻-中度阿尔茨海默症型失智症或记忆障碍的治疗。2.试药2.1AchE酵素名称：源自电鳗的乙酰胆碱酯化酶(AcetylcholinesterasefromElectrophoruselectricus(electriceel))TypeVI-S制品编号：C3389-500UN购入商：Sigma-Aldrich保存条件：冷冻(-20℃)2.2AchE活性测定套组名称：乙酰胆碱酯化酶活性分析套组(AcetylcholinesteraseActivityAssayKit)制品编号：MAK119购入商：Sigma-Aldrich保存条件：室温2.3溶剂名称：UltraPure1MTris-HClpH7.5制品编号：15567-027购入商：Invitrogen保存条件：冷藏(4℃)2.4水使用以超纯水制造装置UL-Pure精制的水(以下，简称为超纯水)3.使用機器·器具3.1電子天秤型式：AUX120制造商：SHIMADZU3.2吸管型式：pipetmanP系列制造商：GILSON3.2连续分注器(多通道吸管)型式：pipetmanNeo系列制造商：GILSON3.3恒温水槽型式：BF400制造商：大和科学公司(YamatoScientificCo.,Ltd)3.4冷冻冷藏库型式：GR-38ND制造商：TOSHIBA3.5微量盘式分析仪(MicroplateReader)型式：SH-9000Lab制造商：CORONAELECTRIC3.696孔微量盘型式：353072制造商：FALCON＜试验方法＞1.调制被验物质1溶液秤量WC，溶解于超纯水，调制成5mg/mL的浓度，作为被验物质1溶液。2.调制被验物质2溶液秤量GAL，溶解于超纯水使浓度成为1mg/mL。之后再以超纯水稀释1.25倍，调制成800μg/mL的浓度，作为被验物质2溶液。3.调制AchE酵素溶液将AchE酵素(冻结干燥粉末品)2mg(500单位)溶解于调制成20mM浓度的Tris-HCl缓冲液pH7.52mL。之后再以超纯水稀释30倍，调制成33.3μg/mL的浓度。4.调制AchE活性测定用使用溶液(WorkingSolution)秤量AchE活性测定套组中含有的试剂2mg，溶解于分析缓冲液(AssayBuffer)200mL，作为使用溶液。5.测定步骤5.1测定被验物质1(WC)的AchE活性依照以下的顺序实施测定。1)将AchE酵素溶液(33.3μg/mL)与被验物质1溶液(5mg/mL)、超纯水依照以下的表1进行混合。【表1】表1反应溶液的组成2)于恒温水槽，于37℃进行反应10分钟。3)于96孔微量盘的4个孔(n＝4)各加入超纯水200μL。(空白孔)4)于步骤3)其它的4个孔(n＝4)各加入AchE活性测定套组中含有的校准器(Calibrator)各200μL。(校准器孔)5)再于其它的24孔(6样品×4)中各加入使用溶液190μL。(样品孔)6)于加入使用溶液的孔中，于各4孔(n＝4)各加入于步骤2)获得的No.1至6的反应后溶液10μL。7)轻拍盘使混合，于室温进行反应2分钟后以微量盘式分析仪测定于412nm的吸光度。8)再于室温进行反应8分钟(合计10分钟)后测定于412nm的吸光度。5.2测定被验物质2(GAL)的AchE活性依照以下的顺序实施测定。1)将AchE酵素溶液(33.3μg/mL)与被验物质2溶液(800μg/mL)、超纯水依照以下的表2进行混合。【表2】表2反应溶液的组成2)于恒温水槽，于37℃进行反应10分钟。3)于96孔微量盘的4个孔(n＝4)各加入超纯水200μL。(空白孔)4)于步骤3)其它的4个孔(n＝4)各加入AchE活性测定套组中含有的校准器各200μL。(校准器孔)5)再于其它的24孔(6样品×4)中各加入使用溶液190μL。(样品孔)6)于加入使用溶液的孔中，于各4孔(n＝4)各加入于步骤2)获得的No.1至6的反应后溶液10μL。7)轻拍盘使混合，于室温进行反应2分钟后以微量盘式分析仪测定于412nm的吸光度。8)再于室温进行反应8分钟(合计10分钟)后测定于412nm的吸光度。6.数据处理使用获得的吸光度值，通过下述式算出AchE活性(units/mL)，算出于各被验物质的各浓度中AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差。【数1】(A412)final：进行反应10分钟后于412nm的吸光度值(A412)initial：进行反应2分钟后于412nm的吸光度值n：稀释系数(n＝120)0.2：通过校准器的系数另外，使用于被验物质各浓度的AchE活性，通过GraphPadPrism寻求单相指数衰变(Onephaseexponentialdecay)曲线，算出IC50值(mg/mL)。<试验结果>1.木杂酚油(WC)的乙酰胆碱酯化酶活性以下表示于被验物质1(WC)、被验物质2(GAL)各孔获得的AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差的值。【表3】表3AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差(WC)(n＝4)【表4】表4AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差(GAL)(n＝4)2.算出IC50使用获得的被验物质1于各浓度的AchE活性值求得的非线性回归曲线及IC50值示于图1。如图1所示，IC50值为0.27mg/mL。另外，木杂酚油中含有的成分的平均分子量为129，单位转换为mM时，IC50值成为2.1mM。从以上的结果确认木杂酚油(WC)的乙酰胆碱酯化酶的抑制作用。另外，木杂酚油显示具有可与己知的作为乙酰胆碱酯化酶抑制剂实用的加兰他敏(GAL)相比的乙酰胆碱酯化酶抑制活性。＜考察＞从本研究的结果显示木杂酚油具有优越的乙酰胆碱酯化酶抑制作用。该结果暗示木杂酚油可用于治疗或改善乙酰胆碱酯化酶引起的种种疾病或状态。另外，木杂酚油已知为作为止泻药被广泛使用的物质，本发明的乙酰胆碱酯化酶抑制剂可期待可降低已有的乙酰胆碱酯化酶抑制剂共通副作用的消化器症状。实施例2：比较木杂酚油与愈创木酚的乙酰胆碱酯化酶活性＜实验材料＞1.被验物质被验物质3名称：愈创木酚(Guaiacol)(以下，记载为GUA)分子量：124.14购入商：东京化成工业株式会社保存条件：室温，遮光2.试药2.1AchE酵素名称：源自电鳗(electriceel)的乙酰胆碱酯化酶TypeVI-S制品编号：C3389-500UN购入商：Sigma-Aldrich保存条件：冷冻(-20℃)2.2AchE活性测定套组名称：乙酰胆碱酯化酶活性分析套组制品编号：MAK119购入商：Sigma-Aldrich保存条件：室温2.3水使用以超纯水制造装置UL-Pure精制的水(以下，称为超纯水)3.使用機器·器具3.1電子天秤型式：AUX120制造商：SHIMADZU3.2吸管型式：pipetmanP系列制造商：GILSON3.2连续分注器(多通道吸管)型式：pipetmanNeo系列制造商：GILSON3.3恒温水槽型式：BF400制造商：大和科学公司3.4冷冻冷藏库型式：GR-38ND制造商：TOSHIBA3.5微量盘式分析仪型式：SH-9000Lab制造商：CORONAELECTRIC3.696孔微量盘型式：353072制造商：FALCON＜试验方法＞1.调制被验物质3溶液秤量GUA，溶解于超纯水，调制成40mM的浓度，作为被验物质3溶液。2.调制AchE酵素溶液将AchE酵素(冻结干燥粉末品)2mg(500单位)溶解于调制成20mM浓度的Tris-HCl缓冲液pH7.52mL。之后再以超纯水稀释30倍，调制成33.3μg/mL的浓度。3.调制AchE活性测定用使用溶液秤量AchE活性测定套组中含有的试剂2mg，溶解于分析缓冲液200mL，作为使用溶液。4.测定步骤4.1测定被验物质3的AchE活性依照以下的顺序实施测定。1)将AchE酵素溶液(33.3μg/mL)与被验物质3溶液(40mM)、超纯水依照以下的表5进行混合。【表5】表5反应溶液的组成样品GUA1GUA2GUA3GUA4GUA5GUA6AchE酵素溶液(33.3μg/mL)25μL25μL25μL25μL25μL25μL超纯水75μL74.5μL73.3μL70μL57.5μL25μL被验物质3溶液(40mM)0μL0.5μL1.75μL5μL17.5μL50μL总量100μL100μL100μL100μL100μL100μLGUA浓度0mM0.2mM0.7mM2mM7mM20mM2)于恒温水槽，于37℃进行反应10分钟。3)于96孔微量盘的3个孔(n＝3)各加入超纯水200μL。(空白孔)4)于步骤3)其它的3个孔(n＝3)各加入AchE活性测定套组中含有的校准器各200μL。(校准器孔)5)再于其它的18孔(6样品×3)中各加入使用溶液190μL。(样品孔)6)于加入使用溶液的孔中，于各3孔(n＝3)各加入于步骤2)获得的No.1至6的反应后溶液10μL。7)轻拍盘使混合，于室温进行反应2分钟后以微量盘式分析仪测定于412nm的吸光度。8)再于室温进行反应8分钟(合计10分钟)后测定于412nm的吸光度。5.数据处理使用获得的吸光度值，通过下述式算出AchE活性(units/mL)，算出于各被验物质的各浓度中AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差。【数2】(A412)final：进行反应10分钟后于412nm的吸光度值(A412)initia1：进行反应2分钟后于412nm的吸光度值n：稀释系数(n＝120)0.2：通过校准器的系数另外，使用于被验物质各浓度获得的AchE活性，通过GraphPadPrism寻求回归曲线，算出IC50值(mM)。<试验结果>1.被验物质3的试验结果以下表示于被验物质3(GUA)各孔获得的AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差的值。【表6】表6AchE活性(units/mL)的平均值及标准偏差2.算出IC50使用获得的被验物质3各浓度的AchE活性值求得的非线性回归曲线及IC50值示于图2。如图2所示，IC50值为17mg/mL。＜考察＞于实施例1的乙酰胆碱酯化酶抑制试验，木杂酚油的IC50为2.1mM。于实施例2，在与实施例1相同的条件下进行愈创木酚的乙酰胆碱酯化酶抑制试验时IC50为17mM。也就是显示木杂酚油比为单一成分的愈创木酚具有约8至9倍高的乙酰胆碱酯化酶抑制活性。当前第1页12