一种电子束辐射根茎诱变选育炭用丛生竹新种质的方法与流程

1.本发明涉及一种电子束辐射根茎诱变选育炭用竹新种质的方法，属于植物育种技术领域。


背景技术：

2.竹炭产业是发展低碳经济的优势产业。竹炭作为“黑钻石”，以其多孔性与具有吸附、去湿能力、产生负氧离子、释放红外线、阻隔电磁辐射等诸多功效，在当前大环保与大键康时代，其应用价值越来越突显出来。比如，竹炭在环保气相与液相处理领域作为生物填料的应用、竹炭在土壤修复与改良领域应用、在农业炭基缓释肥上应用等均有广阔的市场前景；另外，竹炭作为业界的新兴材料被称之为第4类活性炭的原材料，通过深加工成竹质活性炭，市场需求旺盛，前景十分广阔。竹炭产业化可实现竹材增值与循环利用，拓展竹产业链符合“资源消耗减量、循环产出增量”的低碳经济发展目标。发展竹炭经济，实践低碳生活，也是应对全球气候变化最经济、最直接的途径。
3.因此，培育生物量大、壁厚、纤维素与木质素比值低的新型竹品种对提高竹炭产业的可持续发展有重要意义。
4.中国是利用竹材造纸最早的国家，已有1700多年的历史。全球约有1200 余种竹，中国约有39属600余种。常用制浆竹材仅是30多种原生乡土丛生混合竹种。中国的竹子研究历史和现状相对领先于世界其它国家，但由于竹子遗传背景的复杂性和生物学的特殊性，即竹类植物开花具有不确定性，且开花后即死亡等特点，很难通过传统的育种方法对其进行品种改良。现有炭用竹良种选育主要是从自然突变选育或从异地引种驯化进行无性繁殖，而且品种类型比较单一。此外，竹类遗传转化体系尚不成熟，很难通过基因工程的手段对其进行遗传改良。迄今为止，还没有建立一套炭用竹新种质资源创
5.制和筛选的现代生物技术体系。随着竹材工业化利用的快速发展以及人们生活水平的不断提高，对定向培育适合不同用途的炭用竹新品种的创制和选育提出了更新更高的要求。
6.竹根茎处可以萌发出芽，并长出植株，因此竹根茎是电子束辐射诱变并获得突变植株的良好供体材料。采用电子束进行辐射诱变获得炭用竹新种质，操作简单，选育材料广泛，后代性状稳定快，选育时间短，突变植株筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种，可为定向培育不同用途的优质速生炭用竹材并加工出优质竹炭提供了新种质或新品种。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
8.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种电子束辐射根茎诱变选育炭用丛生竹新种质的方法，包括以下步骤：
9.步骤一、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，所述复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
10.步骤二、配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，所述有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、 6
‑
苄基腺嘌呤0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
10
10
cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
10
cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
1010cfu.kg
‑
1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
11.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡6～48小时，浸泡温度为30℃；
12.步骤四、采用辐照剂量为50～600gy的电子束辐照步骤三浸泡后的竹根茎，电子束能量8～12mev，功率15～25kw，频率80～120hz。
13.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡6～12小时，浸泡温度为30℃；
14.步骤六、将步骤五浸泡后的竹根茎移栽到培养基质中培养，30
‑
40天后长出新笋，40
‑
50天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。
15.优选的是，所述竹根茎为选取茎秆壁厚0.7～1.6cm、茎秆横切面维管束密度6～13个/mm2、导管直径35～50μm、维管束高90～110μm、维管束宽 120～210μm的梁上慈竹、硬头黄竹、佯黄竹、甜龙竹、慈竹中的一种带有笋芽的根茎。
16.优选的是，所述步骤六中，培养基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质。
17.优选的是，所述步骤六中，est
‑
ssr分子标记技术中所用引物选自seqid no.1～2、seq id no.3～4、seq id no.5～6、seq id no.7～8中任意一对。
18.优选的是，所述步骤一中，复合溶液各组分浓度还包括：0.1mol/l氨基酸锌、0.05mol/l油菜素甾醇、0.03mol/l壳聚糖和0.05mol/l茶皂素。
19.优选的是，所述步骤三中，在浸泡的中间时间段施加双频超声 60～120min；所述双频超声的交替频率为35～65khz和125～135khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w。
20.优选的是，所述步骤二中，有机复合溶液各组分浓度还包括：0.1mol/l 氨基酸锌、0.1mol/l油菜素甾醇、0.02mol/l虾青素和0.06mol/l酵母硒。
21.优选的是，所述步骤五中，在浸泡的中间时间段施加双频超声45～90min；所述双频超声的交替频率为35～65khz和125～135khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w。
22.本发明至少包括以下有益效果：本发明通过浸竹根茎促芽破眠的复合溶液泡竹根茎，然后采用辐照剂量为50～600gy的电子束辐照竹根茎，再采用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，最后在培养基质中培养，形成植株后用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术对植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种；该方法实现了电子束辐射根茎诱变选育炭用丛生竹新种质的目的，获得炭用丛生竹新种质，操作简单，选育材料广泛，选育时间短，突变植株筛选得到具有优良性状的炭用丛生竹新种质。
23.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
24.图1为实施例1引物bm1扩增结果；
25.图2为实施例2～5引物bm3扩增结果；
26.图3为实施例6引物bm4扩增结果；
27.图4为实施例7引物bm2扩增结果；
28.图5为实施例8引物bm1扩增结果；
具体实施方式：
29.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
30.梁上慈竹、硬头黄竹、佯黄竹、甜龙竹、慈竹来源于四川成都望江楼公园(四川成都)，获取时间为2016年04月。直接来源的提供者为王道云；联系方式：四川成都；e
‑
mail：656096032@qq.com；邮编：610000。
31.实施例1：
32.步骤一、选取茎秆壁厚0.7cm、茎秆横切面维管束密度6个/mm2、导管直径35μm、维管束高90μm、维管束宽210μm的梁上慈竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
33.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
34.配制浸竹根茎促芽生长有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟 0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
10
10
cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
10
cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×
10
10
cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
35.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡6小时，浸泡温度为30℃；
36.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为50gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
37.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡8小时，浸泡温度为30℃；
38.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；35天后长出新笋，46天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm1 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种；图1为引物bm1扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t1
‑
t4：为突变植株；与对照株相比突变株有新条带出
现。
39.实施例2：
40.步骤一、选取茎秆壁厚0.9cm、茎秆横切面维管束密度10个/mm2、导管直径42μm、维管束高102μm、维管束宽150μm的硬头黄竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
41.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
42.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
10
10
cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
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cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
10
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cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
43.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡32小时，浸泡温度为30℃；
44.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为250gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
45.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡6小时，浸泡温度为30℃；
46.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；30天后长出新笋，40天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm3 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种；图2为引物bm3扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t1为实施例2突变植株；与对照株相比突变株有新条带出现。
47.实施例3：
48.步骤一、选取茎秆壁厚0.9cm、茎秆横切面维管束密度10个/mm2、导管直径42μm、维管束高102μm、维管束宽150μm的硬头黄竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
49.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l、 0.1mol/l氨基酸锌、0.05mol/l油菜素甾醇、0.03mol/l壳聚糖和0.05mol/l 茶皂素；溶液ph6.5；
50.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
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cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
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cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
10
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cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
51.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡32小时，浸泡温度为30℃；在浸泡的中间时间段施加双频超声120min(即浸泡至15小时时开始施加双频超声120min至17小时停止施加超声，并继续浸泡15小时)；所述双频超声的交替频率为35khz和125khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w；
52.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为
250gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
53.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡6小时，浸泡温度为30℃；
54.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；30天后长出新笋，40天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm3 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图2为引物bm3扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t2为实施例3突变植株；与对照株相比突变株有较多新条带出现。
55.实施例4：
56.步骤一、选取茎秆壁厚0.9cm、茎秆横切面维管束密度10个/mm2、导管直径42μm、维管束高102μm、维管束宽150μm的硬头黄竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
57.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
58.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、0.1mol/l氨基酸锌、0.1mol/l油菜素甾醇、0.02mol/l虾青素、 0.06mol/l酵母硒、接种活菌量浓度为1.5
×
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‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
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‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
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‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
59.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡32小时，浸泡温度为30℃；
60.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为250gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
61.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡6小时，浸泡温度为30℃；在浸泡的中间时间段施加双频超声60min(即浸泡至2.5小时时开始施加双频超声60min至2.5小时停止施加超声，并继续浸泡15小时)；所述双频超声的交替频率为35khz和125khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w；
62.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；30天后长出新笋，40天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm3 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图2为引物bm3扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t4为实施例4突变植株；与对照株相比突变株有较多新条带出现。
63.实施例5：
64.步骤一、选取茎秆壁厚0.9cm、茎秆横切面维管束密度10个/mm2、导管直径42μm、维管束高102μm、维管束宽150μm的硬头黄竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
65.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷
氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l、 0.1mol/l氨基酸锌、0.05mol/l油菜素甾醇、0.03mol/l壳聚糖和0.05mol/l 茶皂素；溶液ph6.5；
66.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、0.1mol/l氨基酸锌、0.1mol/l油菜素甾醇、0.02mol/l虾青素、0.06mol/l酵母硒、接种活菌量浓度为1.5
×
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cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
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‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
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‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
67.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡32小时，浸泡温度为30℃；在浸泡的中间时间段施加双频超声120min(即浸泡至15小时时开始施加双频超声120min至17小时停止施加超声，并继续浸泡15小时)；所述双频超声的交替频率为35khz和125khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w；
68.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为250gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
69.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡6小时，浸泡温度为30℃；在浸泡的中间时间段施加双频超声60min(即浸泡至2.5小时时开始施加双频超声60min至2.5小时停止施加超声，并继续浸泡15小时)；所述双频超声的交替频率为35khz和125khz，双频超声交替处理的时间为5min，双频超声的功率为500w；
70.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；30天后长出新笋，40天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm3 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图2为引物bm3扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t3为实施例5突变植株；与对照株相比突变株有更多新条带出现。
71.实施例6：
72.步骤一、选取茎秆壁厚1cm、茎秆横切面维管束密度11个/mm2、导管直径50μm、维管束高95μm、维管束宽190μm的佯黄竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
73.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
74.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
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苄基腺嘌吟0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
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‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
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cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
10
10
cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
75.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡48小时，浸泡温度为30℃；
76.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为350gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
77.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡12小时，浸泡温度为30℃；
78.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；40天后长出新笋，50天后形成植株，再用丛生竹专用的est
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ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm4 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图3为引物bm4扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t1
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t4：为突变植株；与对照株相比突变株有新条带出现。
79.实施例7：
80.步骤一、选取茎秆壁厚1.6cm、茎秆横切面维管束密度13个/mm2、导管直径46μm、维管束高110μm、维管束宽120μm的甜龙竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
81.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
82.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
10
10
cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
10
cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
10
10
cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
83.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡25小时，浸泡温度为30℃；
84.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为600gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
85.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡10小时，浸泡温度为30℃；
86.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；38天后长出新笋，43天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm2 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图4为引物bm2扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t1
‑
t4：为突变植株；与对照株相比突变株有新条带出现。
87.实施例8：
88.步骤一、选取茎秆壁厚0.8cm、茎秆横切面维管束密度8个/mm2、导管直径37μm、维管束高98μm、维管束宽176μm的甜慈竹的一种带有笋芽的根茎(即竹根茎)；
89.步骤二、配制浸竹根茎促芽破眠的复合溶液，复合溶液各组分浓度为：蔗糖0.6mol/l、氯化钙0.4mol/l、硝酸钙0.8mol/l、磷酸二氢铵0.6mol/l、天冬酰胺0.1mol/l、谷氨酰胺0.3mol/l、赤霉素0.5mg/l、吲哚丁酸0.2mg/l，溶液ph6.5；
90.配制浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液，有机复合溶液各组分浓度为：活性竹炭粉500mg/l、赤霉素0.2mg/l、细胞激动素0.4mg/l、6
‑
苄基腺嘌吟0.1mg/l、接种活菌量浓度为1.5
×
10
10
cfu.kg
‑1的胶质芽孢杆菌、接种活菌量浓度为2
×
10
10
cfu.kg
‑1的多粘类芽孢杆菌，接种活菌量浓度为5
×ꢀ
10
10
cfu.kg
‑1的解淀粉芽孢杆菌，溶液ph6.5；
91.步骤三、用浸竹根茎促芽破眠的复合溶液浸泡竹根茎，浸泡18小时，浸泡温度为30
℃；
92.步骤四、采用电子束进行辐照诱变步骤三浸泡后的竹根茎，辐照剂量分别为550gy；电子束能量10mev，功率20kw，频率100hz；
93.步骤五、用浸竹根茎促芽生长的有机复合溶液浸泡辐照后的竹根茎，浸泡9小时，浸泡温度为30℃；
94.步骤六、将浸泡后的竹根茎移栽到直径60cm、高度60cm的盆中；移栽的基质为土和草炭以2∶1重量比混合的基质；40天后长出新笋，50天后形成植株，再用丛生竹专用的est
‑
ssr分子标记技术(本实施例采用引物bm1 扩增)对上述植株进行筛选，获得突变体植株，对其分篼筛选得到具有优良性状的炭用竹新种质或新品种。图5为引物bm1扩增结果；注：m:marker； ck:为未辐照诱变的植株；t1
‑
t4：为突变植株；与对照株相比突变株有新条带出现。
95.表1为用est
‑
ssr分子标记技术筛选突变体植株所用引物
96.分别采用表1中的特异的4条est
‑
ssr引物对突变体进行筛选。
97.表1
[0098][0099]
其中上述实施例中的est
‑
ssr分子标记技术为：
[0100]
1、取叶片，提取基因组dna；
[0101]
2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用est
‑
ssr引物进行est
‑
ssr pcr扩增；
[0102]
分别采用表1中的4条est
‑
ssr引物。
[0103]
反应体系(20μl)：0.9μl dntp混合溶液(2.5mm each)、5.0μl 2x gc buffer(2.5mm)、0.2μl rtaq dna聚合酶溶液(5u/μl)、2.0μl基因组dna、0.5μl引物f溶液(10μm)、0.5μl引物r溶液(10μm)，余量为ddh2o。2x gc buffer(2.5mm)：takala公司；
[0104]
反应条件：95℃5min；95℃30s、53℃30s、72℃40s，34个循环；72℃ 10min；4℃保存；
[0105]
取步骤2得到的pcr扩增产物，进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0106]
从73条est
‑
ssr引物中筛选到4条，即bm1、bm2、bm3和bm4。这四条引物对每个样本进行多次重复试验，每次电泳条带均清晰，多次重复试验的带型显示均一致。
[0107]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。