玉米单倍体诱导系的选育方法及其应用与流程

1.本发明属于农作物领域，尤其涉及玉米单倍体诱导系的选育方法及其应用。


背景技术：

2.自交系的创制和筛选是玉米杂交育种的核心，常规的杂交和多轮回交方法需要六代回交和两代自交共八个世代才能获得纯合率高于99％的稳定自交系，耗时数年，成本高，周期长。近年来发展的玉米单倍体加倍技术，通过用单倍体诱导系的花粉与优质遗传资源材料杂交，产生的部分后代被诱导成为单倍体，之后在这些单倍体胚萌发成苗的特定阶段用秋水仙素等细胞分裂抑制剂处理，诱导染色体组加倍，成长为二倍体植株并自交授粉结实，仅需要两个世代就获得纯合率为100％的双单倍体(doubled haploid，dh)自交系，最大限度加快了玉米自交系的创制时间，极大地降低了成本，逐渐在玉米杂交育种中得到广泛应用。如果在幼胚发育阶段即挑选单倍体胚进行染色体加倍，体外培养成苗后自交授粉结实，则仅需要一个半世代就能获得纯合的双单倍体(prasanna et al.,2012；prigge and melchinger2012；ren et al.,2017)。
3.常用的玉米单倍体诱导系材料大多来源于stock6突变体并携带花青素合成基因r1
‑
nj，依靠花青素在胚和胚乳中区别性表达鉴别单倍体胚(dellaporta et al.,1988；eder and chalyk2002；zhang et al.,2008)。由于诱导系本身的基因缺陷，造成诱导系亲本来源的染色体在部分合子减数分裂过程中完全丢失，产生的后代种子含单倍体胚，仅携带被诱导材料亲本的一套染色体，不携带花青素合成基因r1
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nj，因而不能表达积累花青素而为无色胚；胚乳作为三倍体则携带诱导系来源的r1
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nj基因，可表达积累花青素而呈现紫色(eder and chalyk2002；prasanna et al.,2012；prigge and melchinger 2012；ren et al.,2017)，盾片(即胚乳)紫色而胚无色的种子为单倍体。因为玉米花青素合成受多个基因的复杂调控，在不同马齿粒型及硬杆型遗传背景的材料中r1
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nj基因表达情况不同，如果诱导系的r1
‑
nj基因在胚或胚乳中的表达容易受母体材料抑制，会直接影响单倍体胚的准确鉴别，因此选用诱导率高，花青素在胚中表达好的诱导系对双单倍体技术在玉米育种中的成功应用至关重要。
4.近期的研究揭示了玉米单倍体诱导系的基因缺陷是在花粉粒特异表达的一个磷酸酯酶基因zmpla的3’端编码序列中插入了四个碱基，造成移码突变和提前终止，突变后的磷酸酯酶功能降低(gilles et al.,2017；liu et al.,2017)，导致减数分裂过程中诱导系的染色体丢失，产生部分单倍体胚。据此原理可以用基因编辑技术敲除突变该磷酸酯酶基因，创制不同遗传背景的玉米单倍体诱导系，或水稻等其它作物的单倍体诱导系，将单倍体加倍技术在其它作物育种中推广应用(yao et al.,2018)。
5.由于单倍体是卵子受精后已经进入合子中的诱导系精子染色体逐渐丢失造成的，父本基因有一定时间表达并发挥功能，因此诱导系父本携带的基因编辑载体可以在丢失之前表达，并对母本的目标基因进行编辑，经染色体加倍处理，最终产生不带任何诱导系遗传物质的基因编辑双单倍体系(kelliher et al.,2019；wang et al.,2019)。因为用玉米花
粉授粉小麦的远源杂交可以诱导小麦产生单倍体，基于同样原理可以用转基因玉米花粉诱导小麦单倍体和定点基因突变编辑(budhagatapalli et al.,2020)。
6.基于细菌获得性免疫系统crispr的基因编辑技术利用spcas9核酸内切酶与导引grna形成核蛋白酶复合体，通过grna中20bp长的rna序列与被编辑dna序列的碱基配对识别目标，特异性高，酶切活性强，实验设计简单易行，使得crispr/cas9基因编辑系统迅速在不同动植物系统中得到广泛的成功应用(chen et al.,2019)。但基因编辑在许多重要但遗传转化困难的作物如玉米、大豆中的应用受限，建立这些作物的通用高效遗传转化系统是基因编辑应用的必要前提。目前玉米的有效转化仅局限于几个实验用材料如hiii或自交系b104等(frame et al.,2006；ishida et al.,2007)。由于这些实验自交系遗传性状比较差，已不能直接用于现代育种，其转化后代必须经过杂交和多代回交转育导入到性状优良的自交系中后才能用于育种，这个过程严重制约了基因编辑的育种应用。况且玉米杂交育种是一个不断创制和筛选优良自交系的过程，即使成功研发了不依赖基因型的玉米转化技术，也需要针对每一个新创制的优良自交系耗时、耗力地建立和完善转化系统，难以及时有效的实现基因编辑育种。
7.通过用基因编辑载体转化单倍体诱导系，再用含基因编辑载体的转基因诱导系后代诱导任何玉米材料产生单倍体，过程中部分单倍体的目标基因可能被编辑，染色体加倍后形成编辑的双单倍体系，彻底规避了不同玉米自交系难以转化的瓶颈问题，只需要建立一个以诱导系为受体的遗传转化体系，就可以实现任何玉米材料的基因编辑，而且获得的后代是可以直接用于育种筛选的纯合编辑双单倍体系。如果所用材料是成熟优良自交系，编辑的双单倍体系就是改良的自交系；如果所用材料是杂交材料，编辑的双单倍体系就是新创制的自交系。
8.目前使用的单倍体诱导系ky8556虽然诱导率较好，散粉量大，但是幼胚显色较晚，长度低于3毫米的幼胚难以显色，且需要体外光照24小时后才显色明显，不适于早期鉴别挑选单倍体幼胚；成熟籽粒的胚乳显色颜色较浅，面积较小，也不利于单倍体籽粒的挑选。


技术实现要素：

9.玉米中花青素生物合成受复杂基因调控，许多资源材料包括s8360可以在授粉后十几天的早期幼胚中就合成积累足够的花青素而呈现大面积紫色。通过杂交将s8360的早期快速显色等优良性状导入ky8556诱导系中，经多代回交选育结合分子标记筛选，选育幼胚显色早，花期同步，散粉量大，花粉活力高，诱导率好，综合性状优良的诱导系，即可以提高单倍体胚鉴别准确率，提高双单倍体系的制备效率，降低玉米杂交育种成本，也可以作为通用的遗传转化受体材料，结合双单倍体技术，进行不受基因型限制的玉米基因编辑育种。
10.本发明的主要目的在于选育新的玉米单倍体诱导系。以玉米单倍体诱导系ky8556和一个早期幼胚为紫色的资源材料s8360为亲本杂交，获得f1代种子后与诱导系ky8556适时播种，回交授粉13天后剥取幼胚光照，挑选显色早且明显的幼胚组织培养成苗，温室中栽培，期间进行分子标记分析，筛选保留携带4bp插入纯合突变的zmpla基因，并且遗传背景恢复率高的5个单株，栽培至成熟散粉时挑选综合性状好的单株再与ky8556回交，重复上述流程，共完成5
‑
6次回交后自交结实收穗。田间播种，挑选后代整齐划一、综合性状好的株系测试单倍诱导率，同时自交结实留种，最终根据诱导率、胚和胚乳显色情况、以及其它综合性
状表现，选育出改良诱导系备用。主要实验步骤包括：1)杂交、回交和自交选育；2)幼胚组织培养筛选和成苗；3)基因zmpla诱导突变分子标记筛选；4)诱导系遗传背景恢复分子标记筛选；5)单倍体诱导率测试；6)单倍体组织培养法染色体加倍。
11.选育的单倍体诱导系除直接用于双单倍体制备外，也可以作为转化受体材料进行玉米遗传转化研发，转化后携带基因编辑载体工具的单倍体诱导系同样可以诱导单倍体，并通过自然授精过程将基因编辑载体引入卵细胞，同步实现目标基因的编辑和单倍体诱导，染色体加倍后直接获得基因编辑的双单倍体系。因为单倍体的诱导基本不受基因型限制，只要用基因编辑载体转化一个单倍体诱导系，就可以通过上述双单倍体创制过程实现任何遗传背景玉米材料的自交系制备和同步基因编辑。
12.具体的，本发明的技术方案如下：
13.本发明第一个方面公开了一种选育玉米单倍体诱导系的方法，通过选取玉米资源库中的单倍体诱导系与幼胚早期显色的材料进行杂交后，接着多代回交，再自交得到玉米单倍体诱导系。
14.优选的，包括：
15.s1：杂交、回交和自交选育；
16.s2：幼胚组织培养筛选和成苗；
17.s3：进行单倍体诱导率测试，得到玉米单倍体诱导系。
18.应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤s1之前、步骤s1和s2之间、步骤s2和s3之间、步骤s3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
19.本文中“幼胚早期显色的材料”是指在幼胚发育早期可以大量表达花青素生物合成基因的玉米品种。玉米含有花青素生物合成基因，受多种因素调控而在不同组织中有不同水平的表达。有的玉米品种在幼胚发育早期可以大量表达花青素生物合成基因，产生的花青素使得幼胚在见光后呈现紫色；有的玉米品种在幼胚发育期不能表达花青素生物合成基因，幼胚为乳白色，即使照光后也保持乳白色。据此可以区分含花青素生物合成基因的二倍体胚和缺失花青素生物合成基因的单倍体胚。
20.更优选的，在s1中，选取玉米资源库中单倍体诱导系ky8556与紫色幼胚资源材料s8360进行杂交获得f1杂交种子。
21.应当理解，在s1中，单倍体诱导系并不限于ky8556，紫色幼胚资源材料并不限于s8360，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的单倍体诱导系和紫色幼胚资源材料来完成本发明的技术方案，且均在本发明的保护范围之内。
22.在本发明的一些优选实施例中，将ky8556与f1回交，挑选性状较好的单株用于下一轮回交，直至完成5轮或6轮回交，然后进行1至3轮自交获得稳定的候选诱导系。
23.优选的，在s3中，用上述的候选诱导系与其它玉米材料杂交结实，进行单倍体胚的组培鉴别和/或单倍体籽粒鉴别，单倍体发生率高的待选诱导系成为新的玉米单倍体诱导系。
24.具体的，任何期待用于制备自交系的玉米育种中间杂交材料，旧自交系，杂交种等都可以作为母本，用单倍体诱导系作为父本花粉进行授粉，由于单倍体诱导系本身的遗传缺陷，二者杂交产生的后代中有约10％的种子的胚丢失了父本来源的全套染色体，仅保留
了母本来源的一套染色体(1n)，成为单倍体胚。经染色体加倍后处理后可恢复成为纯合的2n双单倍体状态，从而快速获得自交系。
25.优选的，采用基因zmpla诱导突变分子标记和/或遗传背景恢复分子标记的方法筛选性状较好的单株用于下一轮回交。
26.优选的，在s2中，挑选显色早、颜色深、面积大的幼胚转移到含生长培养基的培养瓶中，萌发成苗，待幼苗长到6
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7厘米，移苗栽到较大花盆中培养，适量施肥，直到开花结实。
27.在本发明的一些具体实施例中，所述玉米单倍体诱导系的选育方法包括：
28.一、诱导系材料杂交和回交选育：
29.(1)杂交单株筛选：选取玉米资源库中单倍体诱导系ky8556与紫色幼胚资源材料s8360，适时田间播种，挑选5株发育正常的单株在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工授粉杂交，正常结实收穗，获得f1杂交种子。
30.(2)多代回交：温室中播种诱导系ky8556和上述f1杂交种子，挑选10株发育正常的单株在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行ky8556
×
f1回交授粉。约13天后收取幼穗，表面消毒灭菌后，于无菌操作工作台内剥取幼胚，光照显色，挑选显色颜色深、面积大且显色快的幼胚，组织培养成苗，挑选健壮幼苗约50株，作为bc1f1植株移栽温室中栽培。
31.适时在温室中播种诱导系ky8556，确保与上述bc1f1植株花期相遇，在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行ky8556
×
bc1f1回交授粉。约13天后收取幼穗，重复上述幼胚组织培养筛选和成苗，必要的话进行目标基因zmpla突变标记筛选、诱导系ky8556遗传背景恢复的分子标记筛选，挑选5株恢复率最高、并且综合表型性状较好的单株用于下一轮回交，直至完成5轮或6轮回交，获得bc5f1和bc6f1植株。
32.(3)自交：完成5轮和6轮回交选育的bc5f1和bc6f1植株在温室中栽培，在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行自交授粉5株，继续栽培直到果穗自然成熟，单穗收获bc5f2和bc6f2种子。在玉米生长季节田间播种bc5f2和bc6f2种子，每穗保留约20株在各个生长阶段进行表型评估，挑选后代整齐一致果穗的植株，在抽穗、抽丝前分别套袋雌雄穗，人工进行自交授粉5株，继续栽培直到果穗自然成熟，单穗收获bc5f3和bc6f3种子，作为候选诱导系与被诱导材料适期播种，杂交测试单倍体诱导效果。
33.二、幼胚组织培养筛选和成苗：
34.(1)幼胚组织培养筛选：取授粉后约13天，幼胚长约3毫米的幼穗，用75％的酒精消毒灭菌果穗后，置于直径150毫米培养皿中，用手术刀挑取幼胚，盾片向上摆放在诱导培养基上，置于温度26
‑
28℃培养室，24小时连续光照使幼胚见光显色。
35.(2)幼胚成苗筛选：挑选显色早、颜色深、面积大的约50个幼胚转移到含生长培养基的玻璃培养瓶中，萌发成苗。待幼苗长到6
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7厘米左右，移苗栽到较大花盆中培养，适量施肥，直到开花结实。期间可取样这些t0植株的叶片，提取dna进行基因型分析。
36.三、目标基因zmpla突变分子标记筛选：
37.(1)单倍体诱导系ky8556的zmpla基因测序：玉米单倍诱导系的功能基因已经被鉴定为非钙离子依赖的磷酸酯酶grmzm2g471240基因zmpla(ca2
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independent phospholipase a2)，在其编码序列的3’末端4个碱基cgag的插入移码突变导致其功能降低，造成减数分裂过程中诱导系的染色体丢失(gilles et al.,2017；liu et al.,2017)。根据已测序自交系b73的zmpla基因grmzm2g471240序列(https://
phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，设计多对pcr引物，以ky8556基因组dna为模板，分段扩增并测序ky8556诱导系的zmpla基因序列，检测其编码序列的3’末端是否含有同样的4个碱基cgag插入移码突变。
38.(2)突变zmpla基因特异性pcr标记：诱导系ky8556的zmpla
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ky基因除其编码序列的3’末端有4个碱基cgag插入突变外，下游还有多处与b73野生型zmpla基因序列不同的点突变，根据这些差异设计zmpla
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ky序列特异的引物，分别以ky8556和s8360的基因组dna为模板进行pcr扩增，只有ky8556模板能成功扩增预期长度的特异片段，s8360没有任何pcr产物，因此可以作为突变zmpla
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ky基因特异性pcr标记，用于诱导系植株的鉴定和筛选。
39.(3)定量qpcr检测诱导系突变基因zmpla
‑
ky拷贝数：诱导系ky8556作为二倍体自交系含有2个拷贝zmpla
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ky突变基因，s8360含有2个拷贝zmpla野生型基因，ky8556和s8360的杂交f1分别含有zmpla
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ky和zmpla各一个拷贝，而f1与ky8556的回交后代bc1f1则有50％的植株含有2个拷贝zmpla
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ky，另外50％植株分别含有zmpla
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ky和zmpla各一个拷贝。荧光定量pcr可以估测bc1f1植株中所含zmpla
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ky拷贝数，选出含有2个拷贝zmpla
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ky的植株用于继续与ky8556回交，之后的回交后代不再分离，均稳定含有2个拷贝zmpla
‑
ky突变基因。
40.四、遗传背景恢复分子标记筛选：
41.(1)bc1f1的诱导系ky8556遗传背景筛选：为了提高ky8556与s8360杂交后代的恢复筛选效率，用kasp(kompetitive allele specific pcr)基因分型方法对亲本及多代回交后代进行分析(semagn et al.,2013)，每代挑选ky8556基因型恢复率最高的5株植株进行下一代回交。共使用384个snp(single nucleotide polymorphism)标记分析ky8556和s8360亲本，鉴定了在二者间具多态性的有效snp标记。用这些标记分析了早期幼胚显色好、经组培成苗的bc1f1移栽植株，经统计分析选取背景恢复率最高、且qpcr分析确认zmpla
‑
ky突变基因为纯合的植株，再与ky8556进行下一代回交。
42.(2)bc2f1的诱导系ky8556遗传背景筛选：bc1f1与ky8556回交后，组织培养挑选早期幼胚显色好、组培成苗植株移栽成活，取样叶片提取基因组dna，用上述仍然表现有多态性的标记分析单株恢复率。经统计分析选取背景恢复率最高的单株，再与ky8556进行下一代回交。
43.(3)bc3f1的诱导系ky8556遗传背景筛选：bc2f1与ky8556回交后，组织培养挑选早期幼胚显色好、组培成苗植株移栽成活，取样叶片提取基因组dna，用上述仍然表现有多态性的标记分析单株恢复率。经统计分析选取背景完全恢复的单株，再与ky8556进行下一代回交。
44.五、单倍体诱导率测试：
45.(1)单倍体诱导：以ky8556诱导系为对照，用同样的玉米材料测试选育的改良诱导系的单倍体诱导效果，因为不同材料的诱导率一般有差异，应该使用多份材料同时测试同一诱导系。根据不同被诱导玉米材料和诱导系的生育期差异，适当调整错期播种，确保父、母本花期相遇。植株抽穗和吐丝前分别套袋，用诱导系花粉人工授粉被诱导材料。
46.(2)单倍体胚的组培鉴别：授粉约13天后取果穗灭菌消毒，挑取长约3毫米的幼胚，盾片面向上置于含诱导培养基的的培养皿上，光照24小时后大部分胚显示紫色，不显色的则为单倍体胚，直至48小时后所有二倍体胚显色后，计数统计单倍体诱导率。
47.(3)单倍体籽粒的鉴别：完成诱导系授粉的材料也可继续栽培，等待果穗自然成
熟，收获后脱粒，根据籽粒的显色情况鉴别单倍体。胚乳呈紫色而胚为白色的为单倍体，胚乳和胚同为紫色的为诱导系与被诱导材料的正常杂交种，个别胚乳为白色的则为其它来源花粉污染传粉结实的种子，以单倍体在总籽粒数中的百分比计为单倍体诱导率。
48.本发明第二个方面公开了上述的方法得到的玉米单倍体诱导系。
49.本发明第三个方面公开了一种转基因单倍体诱导系，使用上述的玉米单倍体诱导系作为受体材料进行基因编辑载体转化，获得携带基因编辑载体的转基因单倍体诱导系。
50.本发明第四个方面公开了一种使得上述的玉米单倍体诱导系或上述的转基因单倍体诱导系诱导产生的单倍体染色体加倍的方法，包括：将所述玉米单倍体诱导系与任何玉米材料杂交，诱导产生的单倍体幼胚转移到含细胞有丝分裂抑制剂的加倍培养基上，培养12
‑
48小时诱导染色体加倍，组培成苗后自交结实。
51.优选的，所述细胞有丝分裂抑制剂为秋水仙素。
52.在本发明的一些具体实施例中，单倍体组织培养法染色体加倍的方法包括：
53.(1)单倍体胚染色体加倍处理：挑选上述组织培养中根据颜色鉴定的无色单倍体幼胚，转移到含适当浓度的秋水仙素、或其它细胞有丝分裂抑制剂的加倍培养基上，培养12
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48小时诱导染色体加倍。秋水仙素或其它加倍剂的浓度及处理时间依材料的不同而需要调整，浓度过低或处理时间太短会导致加倍率低，过高或太长则损害细胞生长，抑制幼胚发育成苗。
54.(2)组织培养成苗移栽：幼胚在生长培养基上培养约1周即萌发成苗，2
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3个星期后长高约5厘米以上，根系发达，当幼苗主根系长约5厘米且较健壮时，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，在16/8小时光照的28℃/24℃人工气候室或温室内适应培养约1周，直到有新叶长出后，移栽到大田、或较大花盆中栽培，适时浇水、施肥，直到开花结实。
55.(3)加倍植株自交授粉结实：成功加倍的双单倍体植株可育，大多数能产生可育花粉并可以散粉，但部分植株可能因为雌雄花期不遇等难以成功结实。在双单倍体植株即将抽穗和吐丝前及时套袋、人工自交授粉，自然成熟结实，收获双单倍体系种子用于来年播种，作为新的自交系进行评估筛选。
56.本发明第五个方面公开了根据上述的方法得到的玉米双单倍体系。
57.本发明第六个方面公开了上述的方法、上述的玉米单倍体诱导系、上述的转基因单倍体诱导系和上述的玉米双单倍体系在玉米育种中的应用。
58.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
59.本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
60.(1)选育了综合性状好、诱导率高的玉米单倍体诱导系。通过已有单倍体诱导系与紫色幼胚资源材料杂交和多代回交、自交选育，获得了幼胚显色早且显著、结实好、诱导率高等综合性状较好的改良单倍体诱导系，且本发明公开的方法容易在幼胚发育早期精准挑选单倍体胚。
61.(2)研发并公布了玉米单倍体的组织培养染色体加倍处理方法，在幼胚发育早期即可鉴别挑选单倍体胚，组织培养过程中用细胞分裂抑制剂处理，提高了加倍效率。再生苗正常发育、散粉、结实，在同一生长季节即可获得双单倍体种子，缩短了制备双单倍体自交系的时间。
62.(3)测序并公布了改良玉米诱导系的zmpla基因序列，与b73的对应序列有多处特征性差异，在3’端编码区含有4个碱基cgag插入突变，导致zmpla基因编码序列提前终止，是其具有单倍体诱导能力的基因基础。
63.(4)选育的单倍体诱导系散粉量大，花粉活力好，结实率高，紫色基因表达强。成熟籽粒的胚和盾片胚乳完全呈现深紫色，显色均匀，诱导产生单倍体后，有利于成熟种子时期单倍体种子的准确挑选。
64.(5)选育的单倍体诱导系综合性状较好，组织培养分化和再生能力好，可以作为通用受体材料进行遗传转化，获得的转基因单倍体诱导系与其它自交系进行杂交和多次回交，可将转化的基因导入其它自交系用于转基因育种。
65.(6)用基因编辑载体转化选育的单倍体诱导系，获得的转基因诱导系携带基因编辑载体，与其它杂种材料或自交系杂交诱导产生单倍体，过程中部分单倍体的相应目标基因可被编辑，经染色体加倍后获得基因编辑的双单倍体自交系，直接实现目标基因的纯合编辑改良。
附图说明
66.图1为玉米单倍体诱导系选育路线图。
67.图2为玉米磷酸酯酶基因zmpla的dna序列对比示意图。
68.图3为玉米磷酸酯酶基因zmpla的氨基酸序列对比示意图。
69.图4为选育的单倍体诱导系果穗和籽粒示意图。
70.图5为单倍体诱导系与被诱导材料杂交后代幼胚的显色比较示意图。
具体实施方式
71.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
72.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
73.实施例1
74.本实施例主要涉及玉米单倍体诱导系的选育及单倍体组织培养染色体加倍方法。以玉米单倍体诱导系ky8556和一个早期幼胚为紫色的资源材料s8360为亲本杂交，f1后代与ky8556回交，授粉13天后剥取幼胚光照，挑选显色早且明显的幼胚组织培养成苗，温室中栽培，期间进行分子标记分析，筛选携带4bp插入纯合突变的zmpla基因、并且遗传背景恢复率高的5个单株，至成熟散粉时挑选综合性状好的单株再与ky8556回交，重复上述流程，共完成5
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6次回交后自交结实收穗(图1)。田间播种，挑选后代整齐划一、综合性状好的株系测试单倍诱导率，同时自交结实留种，最终根据诱导效率及其它综合性状表现，选育出优良诱导系。所用技术方案主要包括：一、常规杂交和回交选育表型筛选；二、幼胚组织培养筛选和成苗；三、目标基因zmpla突变分子标记筛选；四、诱导系遗传背景恢复分子标记筛选；五、单倍体诱导率测试；六、单倍体组织培养法染色体加倍。具体步骤如下：
75.一、诱导系材料杂交和回交选育：
76.(1)杂交单株筛选：选取北大荒垦丰种业自主培育收集的玉米资源库中单倍体诱
导系ky8556与紫色幼胚资源材料s8360适时田间播种，挑选5株发育正常的单株在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工授粉杂交，正常结实收穗，获得f1杂交种子。
77.其中，ky8556是广为应用的玉米单倍体诱导系stock6(eder and chalyk 2002；zhang et al.,2008)的衍生后代，s8360是紫粒糯玉米黑农粘1号的衍生后代。
78.(2)多代回交筛选：温室中播种诱导系ky8556和上述f1杂交种子，挑选10株发育正常的单株在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行ky8556
×
f1回交授粉。约13天后采取幼穗，表面消毒灭菌后，于无菌操作工作台内剥取幼胚，光照显色，挑选显色颜色深、显色面积大且显色快的幼胚组织培养成苗，挑选健壮幼苗约50株，作为bc1f1植株移栽温室中栽培。取样幼株叶片，提取基因组dna，分别进行目标基因zmpla突变标记筛选、和诱导系ky8556遗传背景恢复的分子标记筛选，保留5株含zmpla纯合突变、恢复率最高、并且综合表型性状较好的bc1f1单株用于下一代回交。
79.适时在温室中播种ky8556，确保与上述bc1f1植株花期相遇，在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行ky8556
×
bc1f1回交授粉。约13天后收取幼穗，重复上述幼胚组织培养筛选和成苗，进行目标基因zmpla突变标记筛选、诱导系ky8556遗传背景恢复的分子标记筛选，挑选5株恢复率最高、并且综合表型性状较好的单株用于下一轮回交，直至完成5轮或6轮回交，获得bc5f1和bc6f1植株。由于幼胚组织培养成苗未经种子正常成熟过程而直接获得下一代植株，极大的缩短了杂交和回交世代的时间，并且在温室中种植不受季节限制，大约每三个月就能完成一个世代，每年可以进行4轮回交。
80.(3)自交筛选：完成5轮和6轮回交选育的bc5f1和bc6f1植株在温室中栽培，在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行自交授粉5株，继续栽培直到果穗自然成熟，单穗收获bc5f2和bc6f2种子。在玉米生长季节田间播种bc5f2和bc6f2种子，每穗保留约20株在各个生长阶段进行表型评估，挑选后代整齐一致果穗的植株，在抽丝、抽穗前分别套袋雌雄穗，人工进行自交授粉10株，继续栽培直到果穗自然成熟，单穗收获bc5f3和bc6f3种子，观察并筛选胚和盾片显色好的果穗作为候选诱导系(图4)。
81.同季节适当错期播种多个被诱导材料，用上述bc5f2和bc6f2植株的花粉授粉，测试各候选诱导系的单倍体诱导效果。上述bc5f3和bc6f3种子可在来年田间播种，继续进行性状表现、诱导率测试等评估，直至选育出理想的改良诱导系。
82.二、幼胚组织培养筛选和成苗：
83.(1)幼胚组织培养筛选：取授粉后约13天，幼胚长约3毫米的幼穗，用75％的酒精喷洒果穗表面消毒，喷一层扒除一层苞叶，最后用解刨刀将玉米顶端和基部多余的部分切除。将去除苞叶的玉米幼穗放入烧杯里面，置于超净工作台中，先用75％的酒精浸泡清洗5分钟，更换新鲜75％酒精继续浸泡消毒15分钟(该步骤的酒精可以再使用一次，用于第一步的浸泡消毒)，最后用无菌蒸馏水清洗3次，每次2分钟。
84.将消毒灭菌好的果穗置于150毫米直径培养皿中，用手术刀切除果穗表面约3毫米，手术刀尖端在籽粒朝向果穗上端的一面、由上往下倾斜约30度角插入胚乳和种皮之间，挑出幼胚，盾片向上摆放在诱导培养基上(表1)，将培养皿倒置在组织培养架上，温度26
‑
28℃，24小时连续光照使幼胚见光显色，约12小时后幼胚陆续显紫色。
85.表1单倍体染色体组织培养加倍使用的培养基
[0086][0087]
(2)幼胚组织培养成苗：挑选显色早、颜色深、面积大的约50个幼胚转移到含生长培养基(表1)的玻璃培养瓶中，继续培养，萌发成苗。待幼苗长到6
‑
7厘米左右，主根系长约5厘米且较健壮时，打开培养瓶盖并加入少量蒸馏水保持湿度，炼苗24小时后，小心用镊子将植株夹出，避免损伤茎和根，用清水冲洗根部附着的培养基，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，加盖保持湿度，在16/8小时光照的28℃/24℃人工气候室或温室内培养约1周，直到有新叶长出后，移苗栽到较大花盆中培养，适量施肥，直到开花散粉结实。期间可取样这些植株的叶片，提取dna进行基因型分析。
[0088]
三、目标基因zmpla突变分子标记筛选：
[0089]
(1)单倍体诱导系ky8556的zmpla基因测序：玉米单倍诱导系的功能基因已经被鉴定为非钙离子依赖的磷酸酯酶grmzm2g471240基因zmpla(ca2
‑
independent phospholipase a2)，其1452bp长的表达序列包含1287bp的cds序列，编码428氨基酸的蛋白质序列(seq id no：1
‑
3)。在其编码序列的3’末端4个碱基cgag的插入移码突变导致其功能降低，造成减数分裂过程中诱导系的染色体丢失(gilles et al.,2017；liu et al.,2017)。根据已测序自交系b73的zmpla基因grmzm2g471240序列(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，设计多对pcr引物(seq id no：8
‑
30)，以ky8556基因组dna为模板，分段扩增并测序ky8556诱导系的zmpla基因序列，并检测其编码序列的3’末端是否含有4个碱基cgag的插入移码突变。
[0090]
取样ky8556植株叶片，用一个基于sds(sodium dodecyl sulphate)的dna快速提取方法提取基因组dna，用多对b73的grmzm2g471240(zmpla)序列特异引物分段扩增并测序ky8556的对应基因zmpla
‑
ky。pcr反应体系采用takara one shot la pcr试剂盒(takara bio inc.)，20微升的pcr反应体系包含：10μl 2x one shot la pcr mix,0.5μl10μm正向引物，0.5μl 10μm反向引物，7.0μl无菌水，最后加2.0μl 50ng/μl样品的基因组dna。pcr反应条件为94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，60℃退火1分钟，和72℃延伸1分钟共30个循环，最后72℃延伸5分钟，并在4℃保持。
[0091]
取2μl的pcr扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，成功扩增了特异长度片段的剩余pcr产物直接用pcr引物测序，或根据topo ta cloning kit厂商(invitrogen)提供的方法，克隆到pcr2.1 topo载体后用载体特异的m13f或m13r(seq id no：33，34)引物测序。因为b73和ky8556的zmpla基因序列有多处差异，有的引物对未能扩增出pcr片段，需要设计不同引物重新尝试，最终引物对zmpla
‑
f3/zmpla
‑
r3(seq id no：12，13)、zmpla
‑
f7/zmpla
‑
r4(seq id no：20，15)、和zmpla
‑
f2/zmpla
‑
r2(seq id no：10，11)分别成功扩增了811、901、和605bp相互重叠片段，测序后组装成部分ky8556的zmpla
‑
ky序列。为了获得更长的3’端序列，使用了zmpla
‑
f5(seq id no：16)和6个不同3’端引物zmpla
‑
r5，zmpla
‑
r7，zmpla
‑
r9，zmpla
‑
r10，zmpla
‑
r11，及zmpla
‑
r12的配对组合(seq id no：17，21，25，26，27，28)，但均未能成功扩增出特异pcr片段。
[0092]
为了获得ky8556的更长zmpla端序列，根据上述部分组装的ky8556的zmpla序列，设计了引物zmpla
‑
f9，zmpla
‑
r13，及zmpla
‑
r14(seq id no：24，29，30)，并采用inverse pcr扩增方法(green and sambrook 2019)，先将ky8556基因组dna样品用多个不同的限制性内切酶切成片段，加入t4 dna连接酶使部分片段自我链接成环状，然后用zmpla
‑
f8和zmpla
‑
r13引物进行第一轮pcr扩增(seq id no：22，29)，再以第一轮pcr反应物为模板，再用zmpla
‑
f9和zmpla
‑
r14进行第二轮pcr扩增(seq id no：24，30)，获得特异性片段后用topo ta cloning kit厂商(invitrogen)提供的方法，克隆到pcr2.1 topo载体中后，用载体特异的m13f或m13r(seq id no：33，34)引物测序。
[0093]
汇总上述各种测序结果，与b73的zmpla基因片段序列对比分析，最终获得了2495bp长的ky8556的zmpla
‑
ky基因片段序列(seq id no：5)，对应的b73的zmpla基因片段序列长2522bp(seq id no：4)。对比分析发现两个序列在编码区域的上下游、以及内含子等非编码区域有众多差异，据此可以开发ky8556及其衍生诱导系特异的分子指纹标记(图2)。在ky8556的zmpla基因编码序列的3’端有4个碱基cgag的插入移码突变，造成编码序列提前终止，预测的cds序列长度为1200bp(seq id no：6)，编码的突变zmpla
‑
ky磷酸酯酶长为399氨基酸(seq id no：7)，比b73的428氨基酸野生型zmpla磷酸酯酶在羧基端缺失了29个氨基酸并有20个差异序列，除此之外，在中部还分布有三个氨基酸点突变(图3)。
[0094]
(2)突变zmpla
‑
ky基因特异性pcr标记：诱导系ky8556的zmpla
‑
ky基因除其编码序列的3’末端有4个碱基cgag插入突变外，下游还有多处与b73野生型zmpla基因序列不同的点突变，根据这些差异设计zmpla
‑
ky序列特异的引物zmpla
‑
f8和zmpla
‑
r8(seq id no：22，23)，分别以ky8556和s8360的基因组dna为模板进行pcr扩增，只有ky8556模板成功扩增了预期的150bp长的特异片段，s8360没有任何pcr产物，因此引物对zmpla
‑
f8和zmpla
‑
r8可以作为突变zmpla
‑
ky基因特异性pcr标记，用于诱导系植株的鉴别和筛选。
[0095]
(3)定量qpcr检测诱导系突变基因zmpla
‑
ky拷贝数：诱导系ky8556作为二倍体自交系含有2个拷贝zmpla
‑
ky突变基因，s8360含有2个拷贝zmpla野生型基因，ky8556和s8360的杂交f1分别含有zmpla
‑
ky和zmpla各一个拷贝，而f1与ky8556的回交后代bc1f1群体则有50％的植株含有2个拷贝zmpla
‑
ky，另外50％植株分别含有zmpla
‑
ky和zmpla各一个拷贝。荧光定量pcr可以估测bc1f1植株中所含zmpla
‑
ky拷贝数，选出含有2个拷贝zmpla
‑
ky的植株用于继续与ky8556回交。该基因位点在之后的回交后代不再分离，均稳定含有2个拷贝zmpla
‑
ky突变基因。
[0096]
提取ky8556，ky8556xs8360 f1和s8360植株叶片基因组dna，分别作为zmpla
‑
ky突变基因的2，1，和0拷贝对照样品，并以含有单拷贝的ky8556xs8360 f1植株基因组dna的5倍系列稀释为标准样品，以玉米乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase zmadh，af123535)为内源参照基因，设计zmpla
‑
ky和zmadh基因特异的引物，进行荧光绿qpcr扩增，建立各自的标准曲线，评估确认两个引物对的pcr扩增效率一致，三个对照样品ky8556，ky8556xs8360和s8360的zmpla
‑
ky拷贝数符合后，用同样方法对未知样品进行拷贝数检测。
[0097]
荧光定量pcr反应体系采用green realtime pcr master mix试剂盒(toyobo life science)，20微升的pcr反应体系包含：10μl 2x master mix,0.5μl 10μm引
物zmpla
‑
f8和0.5μl 10μm引物zmpla
‑
r8(seq id no：22，23)，8.0μl无菌水,最后加1.0μl 30ng/μl样品的基因组dna。pcr反应条件为95℃变性5分钟，然后95℃变性10秒，66℃退火10秒，72℃延伸15秒共40个循环。用玉米乙醇脱氢酶特异引物zmadh
‑
f3和zmadh
‑
r3作为内源参照基因对照(seq id no：31，32)。在进行实时定量qpcr反应时，标准样品和待检测样品的pcr反应在同一个96孔板上进行，各样品均设置3次重复，取平均值计算拷贝数，鉴别出zmpla
‑
ky基因拷贝数为2的bc1f1植株。完成第二轮回交后，用同样的定量qpcr验证所有bc2f1植株的突变zmpla
‑
ky基因拷贝数均为纯合二倍体，因此第3
‑
5轮回交后代未再进行同样验证。
[0098]
四、遗传背景恢复分子标记筛选：
[0099]
(1)bc1f1群体的ky8556诱导系遗传背景筛选：为了提高ky8556与s8360杂交后代的恢复筛选效率，用kasp(kompetitive allele specific pcr)基因分型方法对亲本及多代回交后代进行分析(semagn et al.,2013)，每代挑选ky8556基因型恢复率最高的5株植株进行下一代回交。共使用384个snp(single nucleotide polymorphism)标记分析ky8556和s8360亲本，鉴定了在二者间具多态性的有效snp标记共139个。用这139个标记分析了早期幼胚显色好、经组培成苗的bc1f1移栽植株共36株，经统计分析后发现44个标记已经完全恢复为ky8556基因型，另外95个标记仍然表现有多态性。最终选出了背景恢复率最高、且qpcr分析确认zmpla
‑
ky突变基因为纯合的5株bc1f1单株ky2，18，19，8，20再与ky8556进行下一轮回交(表2)。
[0100]
(2)bc2f1群体的诱导系ky8556遗传背景筛选：bc1f1与ky8556回交后，组织培养挑选早期幼胚显色好、组培成苗共65株bc2f1植株移栽成活，取样叶片提取基因组dna，用上述仍然表现有多态性的95个标记分析单株恢复率。经统计分析后发现38个标记已经完全恢复为ky8556基因型，另外57个标记仍然表现有多态性，但其中5个pcr扩增分型异常不能使用，仅剩余52个有效标记。最终选出了背景恢复率最高的5株bc2f1单株ky18
‑
5，19
‑
14，18
‑
3，20
‑
23，和18
‑
4再与ky8556进行下一轮回交(表2)。
[0101]
表2 ky8556xs8360回交后代ky8556亲本遗传背景的恢复
[0102][0103]
*两个bc3f1单株被选用于后续回交选育。
[0104]
(3)bc3f1群体的诱导系ky8556遗传背景筛选：bc2f1与ky8556回交后，组织培养挑选早期幼胚显色好、组培成苗共71株bc3f1植株移栽成活，取样叶片提取基因组dna，用上述仍然表现有多态性的52个标记分析单株恢复率。经统计分析后发现6株样品的52个标记已经完全恢复为ky8556基因型，另外有8株样品的51个标记已经完全恢复为ky8556基因型，因此完成了遗传背景恢复的分子标记筛选。最终从背景恢复率高的bc3f1单株中，挑选生长状态健壮、综合性状好的两个单株ky18
‑5‑
24和18
‑5‑
3再与ky8556进行下一轮回交(表2)。
[0105]
五、单倍体诱导率测试：
[0106]
(1)单倍体诱导：经过上述的与ky8556多轮回交、自交和各种筛选后，获得了多个各种性状表现稳定一致的候选改良诱导系，选取其中三个重新命名为ky3，ky10和ky11进行
单倍体诱导率测试。因为不同材料的诱导率一般有差异，应该使用多份材料同时测试同一诱导系。以ky8556诱导系为对照，用同样的玉米材料测试ky3，ky10和ky11改良诱导系的单倍体诱导效果，根据不同被诱导材料和诱导系的生育期差异，适当调整错期播种，确保父、母本花期相遇。植株抽穗和吐丝前分别套袋，用诱导系授粉被诱导材料，授粉约13天后取果穗灭菌消毒，挑取长约3毫米的幼胚进行组织培养筛选、根据幼胚经光照后的情况鉴别单倍体胚。也可等果穗自然成熟，收获后脱粒，根据籽粒中胚的颜色鉴别单倍体。
[0107]
(2)单倍体胚组织培养鉴别：玉米幼穗取回后先去除表面老苞叶、剪除顶端花丝、再逐层剥开去除苞叶，每层喷施75％酒精表面消毒，然后将果穗浸泡在75％酒精中消毒10分钟，无菌水清洗三遍。将完成消毒的果穗放在直径150毫米培养皿中，用手术刀削掉种子上部约2毫米，将手术刀尖从发育种子的含胚端倾斜插入胚乳和种皮之间，挑出位于种子基部的幼胚，盾片面向上置于含诱导培养基的的培养皿上(表1)，光照12小时后大部分胚显示紫色，不显色的则为单倍体胚(图5)，计数统计单倍体诱导率。
[0108]
改良诱导系ky3，10，11诱导的幼胚显色相互之间无明显差异，在光照约6
‑
7小时后就开始观察到紫色，而ky8556诱导的幼胚直到光照8小时后才开始显色，改良诱导系ky3，10，11的显色时间显著早于ky8556的约1
‑
2小时。待12小时后大部分胚都显色时，改良诱导系的胚的显色面积也明显比ky8556的大、颜色也较深，因此更适合用于准确挑选不显色的单倍体胚(图5)。根据显色幼胚比例判断的各诱导系的平均单倍体诱导率相似，介于12
‑
15％，不同材料的单倍体诱导率可能存有差异，但由于实验数据较小，难以下结论，需要采集田间大实验数据后分析确认(表3)。
[0109]
表3选育诱导系的单倍体诱导率
[0110][0111][0112]
(3)单倍体成熟籽粒的鉴别：完成诱导系授粉的材料也可继续栽培，等待果穗自然成熟，收获后脱粒，根据籽粒的显色情况鉴别单倍体。胚乳显紫色而胚呈浅黄色的为单倍体，胚乳和胚同为紫色的为诱导系与被诱导材料的正常杂交种，个别胚乳为浅黄色的则可能为其它来源花粉污染传粉结实的种子，单倍体在总籽粒数中的百分比计为单倍体诱导率。
[0113]
六、单倍体组织培养法染色体加倍：
[0114]
(1)单倍体胚染色体加倍处理：挑选上述组织培养中根据颜色鉴定的无色单倍体幼胚，转移到含浓度为0.005％至0.05％的秋水仙素、或适当浓度其它细胞有丝分裂抑制剂
的加倍培养基上，培养12
‑
48小时诱导染色体加倍。秋水仙素或其它加倍剂的浓度及处理时间依材料的不同而需要调整，浓度过低或处理时间太短会导致加倍率低，过高或太长则损害细胞生长，抑制幼胚正常发育成苗。完成染色体加倍处理后，及时将幼胚转移到含生长培养基的玻璃培养瓶中，在28℃组织培养室中16/8小时光照培养成苗。
[0115]
(2)组织培养成苗移栽：幼胚在生长培养基上培养约1周即萌发成苗，2
‑
3个星期后长高约5厘米以上，根系发达，当幼苗主根系长约5厘米且较健壮时，打开培养瓶封口膜并加入少量蒸馏水保持湿度，炼苗24小时后，小心用镊子将植株夹出，避免损伤茎和根，用清水冲洗根部附着的培养基，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，加盖保持湿度，在16/8小时光照的28℃/24℃人工气候室或温室内适应培养约1周，直到有新叶长出后，移栽到大田、或较大花盆中栽培，适时浇水、施肥，直到开花结实。
[0116]
(3)加倍植株自交授粉结实：未加倍的单倍体植株和加倍成功的双单倍体植株较矮小，长势弱，远不及种子自然萌发的自交系植株、或可能污染的杂交植株，据此可以辨别并去除杂株。单倍体植株不育，不能散粉结实，被自动淘汰。成功加倍的双单倍体植株可育，大多数能产生可育花粉并可以散粉，适时抽丝，但部分植株会因为雌雄花期不遇等难以成功结实。在双单倍体植株即将抽穗和吐丝前及时套袋、人工自交授粉，自然成熟结实，收获双单倍体系种子用于来年播种，作为新的自交系进行评估筛选。
[0117]
本实施例中涉及到的核苷酸序列如下所示：
[0118]
seq id no 1：zea mays b73 phospholipase a2 gene zmpla grmzm2g471240 1452bp；
[0119]
seq id no 2：zea mays b73 phospholipase a2 gene zmpla grmzm2g471240cds 1287bp；
[0120]
seq id no 3：zea mays b73 phospholipase a2 zmpla grmzm2g471240protein 428aa；
[0121]
seq id no 4：zea mays haploid inducer b73 phospholipase a2 gene fragment zmpla 2522bp；
[0122]
seq id no 5：zea mays haploid inducer ky8556 phospholipase a2 gene fragment zmpla
‑
ky2495bp；
[0123]
seq id no 6：zea mays haploid inducer ky8556 phospholipase a2 gene zmpla
‑
ky cds1200bp；
[0124]
seq id no 7：zea mays haploid inducer ky8556 phospholipase a2 zmpla
‑
ky protein 399aa；
[0125]
seq id no 8：zmpla
‑
f1 oligo 21bp；
[0126]
seq id no 9：zmpla
‑
r1 oligo 22bp；
[0127]
seq id no 10：zmpla
‑
f2 oligo 21bp；
[0128]
seq id no 11：zmpla
‑
r2 oligo 26bp；
[0129]
seq id no 12：zmpla
‑
f3 oligo 22bp；
[0130]
seq id no 13：zmpla
‑
r3 oligo 22bp；
[0131]
seq id no 14：zmpla
‑
f4 oligo 21bp；
[0132]
seq id no 15：zmpla
‑
r4 oligo 22bp；
[0133]
seq id no 16：zmpla
‑
f5 oligo 19bp；
[0134]
seq id no 17：zmpla
‑
r5 oligo 22bp；
[0135]
seq id no 18：zmpla
‑
f6 oligo 18bp；
[0136]
seq id no 19：zmpla
‑
r6 oligo 18bp；
[0137]
seq id no 20：zmpla
‑
f7 oligo 21bp；
[0138]
seq id no 21：zmpla
‑
r7 oligo 20bp；
[0139]
seq id no 22：zmpla
‑
f8 oligo 17bp；
[0140]
seq id no 23：zmpla
‑
r8 oligo 19bp；
[0141]
seq id no 24：zmpla
‑
f9 oligo 21bp；
[0142]
seq id no 25：zmpla
‑
r9 oligo 21bp；
[0143]
seq id no 26：zmpla
‑
r10 oligo 21bp；
[0144]
seq id no 27：zmpla
‑
r11 oligo 20bp；
[0145]
seq id no 28：zmpla
‑
r12 oligo 21bp；
[0146]
seq id no 29：zmpla
‑
r13 oligo 21bp；
[0147]
seq id no 30：zmpla
‑
r14 oligo 22bp；
[0148]
seq id no 31：zmadh
‑
f3 oligo 22bp；
[0149]
seq id no 32：zmadh
‑
r3 oligo 22bp；
[0150]
seq id no 33：m13f oligo 20bp；
[0151]
seq id no 34：m13r oligo 17bp。
[0152]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0153]
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