1.本发明涉及一种天然源黄酮类化合物新的生物活性及用途——作为抗菌剂在抑制植物病原细菌中的应用，属于天然药物化学领域和农药科学领域。
背景技术：
2.我国是一个农业大国，每年由于植物细菌病害的侵袭导致大田作物的产量有大量损失。水稻白叶枯病病原菌是水稻最严重的病害之一，严重危害水稻生长，造成水稻减产和品质下降，在全世界范围内危害严重，野生稻和陆稻均可被侵染。柑橘溃疡是引起柑橘溃疡病细菌性病害的主要病原菌，严重危害我国柑橘产业的发展。
3.在现有的针对植物病害的预防和治疗方案中，化学控制方法由于反应快、成本低、易操作等优点成为最有效的管理策略之一。然而，现有传统杀菌剂如叶枯唑和噻菌铜的的长期使用和滥用，导致对病原体的抵抗能力下降，并产生了耐药病原体。因此，急需探索和开发具有高效生物活性和独特作用方式的新化学实体作为替代性杀菌剂，以应对耐药病原体带来的挑战。
4.多药耐药细菌病原体的日益出现和传播加速了对新抗生素的需求。天然产物主导着发现抗菌剂的首选化学骨架。黄酮类化合物作为自然界中分布较广泛的一类次生代谢产物，其种类繁多，且其主要分布于豆科、芸香科、伞形科、唇形科和石楠科植物中，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多种药理作用。据此，我们进一步研究了其抗菌活性，以期开发黄酮类化合物在抗菌方面的应用。
技术实现要素：
5.本发明的目的是通过研究天然源黄酮类化合物对植物病原细菌的抑制作用，特别是对水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzaeaccc 11602，柑橘溃疡病病原菌xanthomonas axonopodis pv. citri的抑制作用进行研究，以用于防治由水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzaeaccc 11602，柑橘溃疡病病原菌xanthomonas axonopodis pv. citri引起的植物病害。
6.为了研究天然源黄酮类化合物对植物病原细菌的抑制作用，本发明测试了44种天然源黄酮类化合物对水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzae accc 11602、柑橘溃疡病病原菌xanthomonas axonopodis pv. citri的抑菌活性。
7.1、黄酮类化合物对植物源细菌活性抑制作用的测定本实验中采用的水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzae accc 11602、柑橘溃疡病病原菌xanthomonas axonopodis pv. citri在nb固体培养基上划线，28℃恒温培养，待其长出单菌落后，挑取单菌落在nb液体培养基中，于28℃，180rpm的摇床中恒温培养，长至对数生长期时，于4℃冰箱保存备用。采用的培养基为nb固体培养基（牛肉膏：3 g，蛋白胨：5 g，酵母粉：1 g，蔗糖：10 g，琼脂：15 g，蒸馏水：1 l，ph7.0；121℃灭菌20 min）；nb液
体培养基（牛肉膏：3 g，蛋白胨：5 g，酵母粉：1 g，蔗糖：10 g，蒸馏水：1 l；121℃灭菌20 min）。
8.测试方法：将以准备好的植物源细菌用nb液体培养基稀释到约10
6 cfu/ml备用。将黄酮类化合物用dmso溶解，加入一定量nb液体培养基，配置成1600 μg/ml的带药培养基。取50 μl含药培养基和相同体积的含约106ꢀꢀ
cfu/ml细菌培养物加入到96孔板的孔中，使最终给药组浓度为800 μg/ml；将含等量相同浓度的100 μl dmso菌液做对照组；将此96孔板置于28℃恒温培养箱中培养约24
‑
48h直至对照组菌液浑浊。另外分别加入100 μl nb液体培养基和浓度为800 μg/ml对应的黄酮类化合物的带药培养基，在酶标仪中分别测定对照组、给药组、培养基和黄酮类化合物的od值（od
600
）。对培养基和黄酮类化合物本身造成的od值进行校正。校正od值和抑制率的计算公式如下：校正od值 = 含菌培养基od值
‑
无菌培养物od值；抑制率 =（校正后对照培养基菌液od值
‑
校正后含药培养基od值）/校正后对照培养基菌液od值
ꢀ×ꢀ
100%；所有实验设置三个重复，测定得到化合物的抑制率见表1。
9.从表1可见，大部分天然源黄黄酮类化合物在0.8 mg /ml，对于水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌均表现出优异的抑菌活性。
10.、二倍稀释法测定黄酮类化合物对植物源细菌的扩浓度测试本实验中采用的菌种和培养基同前述。
11.实验方法：将处于对数生长期的病原菌用nb培养基稀释至约106ꢀꢀ
cfu/ml备用，将黄酮类化合物用dmso溶解，加入一定量nb液体培养基，配置成1600 μg/ml的带药培养基。在96孔板中每孔中加入50 μlnb培养基，在给药组（3个重复）列首行中每孔加入50 μl已配好黄酮类化合物的带药培养基，使初始浓度为800 μg/ml。之后对药物进行二倍稀释，用移液枪对给药组第一行充分吹打（至少5 次），混匀后吸取50 μl至第二行，使与培养基充分混匀，照此重复直至给药组最后一行，吸出的50 μl药液弃掉，再在实验组每孔中加入50 μl的稀释好的菌液，用含等量dmso的100 μl菌液作为对照。将此96孔板置于28℃(37℃)恒温培养箱中培养约24
‑
48 h直至对照组菌液浑浊。另外分别加入100 μl nb液体培养基和不加菌液经二倍稀释后同浓度的黄酮类化合物的带药培养基于96孔板中，在酶标仪中分别测定对
照组、给药组、培养基和相应浓度黄酮类化合物的od值（od
600
）。对培养基和黄酮类化合物本身造成的od值进行校正。校正od值和抑制率的计算公式如下：校正od值 = 含菌培养基od值
‑
无菌培养物od值；抑制率 = （校正后对照培养基菌液od值
‑
校正后含药培养基od值）/校正后对照培养基菌液od值
ꢀ×ꢀ
100%所有实验设置三个重复，测定得到化合物的抑制率见表2。
12.从表2可见，在浓度0.2 mg / ml，部分天然源黄酮类化合物对水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌的抑制率仍在70%以上。可作为新的杀菌先导化合物进行生物合理性设计与开发。
13.所述研究表明，表中44种天然源黄酮类化合物对水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌均具有优异的抑制活性。黄酮类化合物均为天然源化合物，作为杀菌剂具有环保、毒性低、来源广泛等特点，具有开发为新型绿色高效杀菌剂的潜力，可为抗菌药物的开发提供原料。
14.上述表1、2中，44种天然源黄酮类化合物的名称及化学结构式如下：
技术特征：
1.天然源黄酮类化合物作为抗菌剂在抑制植物病原细菌中的应用。2.根据权利要求1所述天然源黄酮类化合物作为抗菌剂在抑制植物病原细菌中的应用，其特征在于：所述天然源黄酮类化合物为芹菜素、柚皮素、光甘草定、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、白杨黄素、漆黄素、松属素、杨梅素、葛根素、柚皮苷、山奈酚、高良姜素、淫羊藿素、鹰嘴豆芽素a、金雀异黄酮、刺芒柄花素、甘草素、甘草苷、异黄腐酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、木犀草素、芦丁、金丝桃苷、山奈酚
‑3‑
o
‑
芸香糖苷、儿茶素、野黄芩苷、淫羊藿苷、异鼠李素、橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、表儿茶素、原花青素、原花青素b1、原花青素b2，野黄芩素、香叶木素、川陈皮素、桔皮素、花旗松素（二氢槲皮素）、二氢杨梅素。3.根据权利要求1或2所述天然源黄酮类化合物作为抗菌剂在抑制植物病原细菌中的应用，其特征在于：所述植物病原细菌为水稻白叶枯病病原菌xanthomonas oryzae accc 11602、柑橘溃疡病病原菌xanthomonas axonopodis pv. citri。
技术总结
本发明公开了一种天然源黄酮类化合物新的生物活性及用途——作为抗菌剂在抑制植物病原细菌中的应用，属于天然药物化学领域和农药科学领域。本发明的的研究表明，44种天然源黄酮类化合物对水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌均具有优异的抑制活性。部分化合物浓度在0.2 mg/mL时，抑制率仍在70%以上，可作为新的杀菌先导化合物进行生物合理性设计与开发。另外，黄酮类化合物均为天然源化合物，作为杀菌剂具有环保、毒性低、来源广泛等特点，具有开发为新型绿色高效杀菌剂的潜力，可为抗菌药物的开发提供原料。物的开发提供原料。
技术研发人员：李安平 师彦平
受保护的技术使用者：中国科学院兰州化学物理研究所
技术研发日：2021.07.02
技术公布日：2021/10/8
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