巴氏新小绥螨和顶孢霉联合在防治二斑叶螨中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物防治技术领域，更具体地说是涉及巴氏新小绥螨和顶孢 霉联合在防治二斑叶螨中的应用。


背景技术：

2.二斑叶螨是世界性的重要害螨，已对多种杀虫(螨)剂产生高度抗性。 二斑叶螨属蛛形纲、真螨目、叶螨科、叶螨属，是大田和保护地作物上重要 的世界性害虫。能够取食蔬菜、水果、玉米、棉花和城市绿地植物及牧草等 140科1100多种植物。
3.使用单一生防制剂治理害虫，效果相对缓慢且有限，将多种生物制剂联 合用于靶标害虫的治理可以弥补此种不足，是生物防治中非常有前景的发展 方向。目前二斑叶螨的防治主要依赖杀虫(螨)剂，由于化学药剂的不合理 使用，其抗药性极速上升，明显降低了杀虫(螨)剂的防治效果。杀虫(螨)剂 的研发速度却远远滞后于淘汰速度，并且由于研发周期长、成本高致使农业 生产的投入逐年加大且防效减弱。因此，多种生物防治手段的联合使用即可 快速有效地治理害虫(螨)又可避免环境污染和延缓害虫(螨)抗药性的产 生。
4.因此，如何将巴氏新小绥螨和顶孢霉联合应用于防治二斑叶螨产品中是 本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明通过实验证明了顶孢霉与二斑叶螨的天敌巴氏新小绥 螨两者可以联合应用，避免或减缓了二斑叶螨因单一化学防治而产生的抗药 性，提高了防治二斑叶螨的效果。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.巴氏新小绥螨和顶孢霉联合在防治二斑叶螨中的应用。
8.作为本发明优选的技术方案，将巴氏新小绥螨和顶孢霉联合运用制备成 防治二斑叶螨的产品。
9.虫生真菌(顶孢霉)是否会侵染天敌是二者能否联合应用的前提，并且 将其作为评价二者是否兼容的基础。如果顶孢霉在不侵染巴氏新小绥螨的前 提下可以提高巴氏新小绥螨对二斑叶螨的捕食效能，或者捕食螨有助于提高 顶孢霉对害虫螨的侵染能力，说明二者不仅有良好的兼容性，还有很好的增 效作用；而申请人通过实验发现，顶孢霉对巴氏新小绥螨无致病作用，因此， 可以联合应用，且，联合应用后，两者具有协同增效作用，可提高对二斑叶 螨的防治效果。
10.作为本发明优选的技术方案，所述顶孢霉为顶孢霉ahy1菌株，该菌株保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2007年12 月03日，保藏编号为cgmcc no.2278，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号；分类命名为acremonium hansfordii。
11.顶孢霉ahy1菌株对二斑叶螨具有较优的防治效果，通过自身产生的胞外 蛋白酶
和几丁质酶分解二斑叶螨表皮的蛋白质和几丁质，再加上虫生真菌芽 管的机械压力，二者共同作用进入二斑叶螨体表完成对靶标昆虫的侵染，达 到防治效果。
12.作为本发明优选的技术方案，所述顶孢霉的菌株悬浮液的使用浓度为 1
×
108个/ml。
13.顶孢霉孢子悬浮液在浓度为1
×
108个/ml时，对二斑叶螨3～11天内的累 积校正死亡率接近70％，致死中时最短，为7.9882d。
14.一种防治二斑叶螨的制剂，包括巴氏新小绥螨和顶孢霉ahy1菌株。
15.综上所述，在室内条件下通过顶孢霉对叶二斑叶螨的致病力以及用顶孢 霉分别处理巴氏新小绥螨和二斑叶螨后测定其捕食功能的变化后发现，顶孢 霉与巴氏新小绥螨具有兼容性，可以协同使用。尽管顶孢霉高浓度的孢子会 对巴氏新小绥螨的捕食效能有微弱负面作用，但是更能增强巴氏新小绥螨对 已感染叶螨的捕食能力，总体评价二者具有增效作用。
附图说明
16.图1附图ahy1菌株浓度在1
×
108个/ml处理二斑叶螨和巴氏新小绥螨时 的致死中时表征图；
17.图2附图为显微镜下被ahy1菌株感染后的二斑叶螨图；
18.图3附图为显微镜下ahy1处理后的死亡巴氏新小绥螨雌成螨的图。
具体实施方式
19.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.供试材料及培养基
21.萨氏培养基(sday)：由40g葡萄糖、10g蛋白胨、2g酵母膏、15g琼 脂和1000ml水按照一定比例混合而成。
22.gottel产孢培养基：由2％玉米粉，1％麸皮，0.5％蛋白胨、2％琼脂、 0.3％kh2po4、2％mgso4·
7h2o、0.1％nh4no3和500ml水按照一定比例混合 而成。
23.供试菌株
24.顶孢霉菌株ahy1采自甘肃榆中黄家庄自然感病的桃蚜(myzus persicaesulzer)虫尸上分离得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏号为cgmcc no.2278；保藏时间为2007年12月03日，保藏地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为acremonium hansfordii。 经纯化保存于4℃冰箱中，每月转接一次。
25.将上述菌株挑取菌丝接种于pda培养基上，置于光照培养箱中(25
±
1℃， l:d＝12h：12h，rh＝75
±
5％)，3d后在菌落边缘选取生活力强且比较一致的 菌丝，用打孔器打成菌饼，移植于新pda培养基的培养皿中央，然后置于恒 温培养箱内培养待用。重复3次以便顶孢霉菌株充分活化。
26.将活化好的菌株转接到sday上培养48h，待产孢量达到峰值时取出 sday平板，无
菌操作下，向布满菌落的平板(直径9cm)表面滴入含有0.05％ 吐温
‑
80的无菌水3～5ml，用接种环或接种针轻刮平板表面孢子。收集的孢子 悬浮液用磁力搅拌器搅拌20min，使分生孢子完全分散后，用无菌纱布过滤， 在显微镜下用血球计数器镜检分生孢子含量(含孢量为1.0
×
108个/ml)，并 用无菌水调节浓度。
27.供试虫源
28.二斑叶螨初样于2012年7月采自甘肃省兰州市兴隆山国家级森林公园， 在不接触任何药剂的情况下置于温度(25
±
1)℃的养虫室内由雌、雄单系繁 殖饲养获得。
29.巴氏新小绥螨由中国农业科学院植物保护研究所害虫天敌创新课题组提 供，置于(25
±
1)℃、rh(75
±
5)％，光周期16l:8d的智能型人工气候箱 内，以室内饲养的椭圆食粉螨(aleuroglyphus ovatus troupeau)为猎物饲养繁 殖。
30.实施例1顶孢霉对二斑叶螨的致病力
31.在直径9cm培养皿中倒置一个直径7cm培养皿，在7cm培养皿上覆盖一 张与培养皿同等大小的滤纸，在滤纸上平铺一片豇豆叶，背面朝上，然后在 叶片周边围上脱脂棉并包裹叶柄，脱脂棉一头放入9cm培养皿中再在其中加 满水，做为饲养台。
32.在体视显微镜下挑取大小一致、健康活泼的雌成螨120头于上述饲养台 的叶片上，分为四组，用小型手持喷雾器(20ml)将配制好的不同浓度的孢 子悬浮液(1
×
104个/ml、1
×
106个/ml、1
×
108个/ml)均匀喷洒5ml至叶面， 对照用0.05％吐温
‑
80的无菌水处理，每个处理重复3次。在光照培养箱 (25
±
℃，l：d＝12h：12h，rh＝75
±
5％)中培养观察，分别于处理后第3、5、 7、9d和11d定时观察并记录二斑叶螨的死亡数。用毛笔轻触螨体，以螨体不 动者视为死亡；结果如表1和表2所示；
33.表1不同浓度的顶孢霉菌株ahy1孢子液对二斑叶螨雌成螨的致死率
[0034][0035]
由表1可知，用ahy1菌株孢子悬浮液的3种浓度处理二斑叶螨，随着时 间的延长，二斑叶螨雌成螨的累积校正死亡率均逐渐增加，在第11d时达到 最大。可以看出，三种浓度下的死亡率分别为36.67％、53.67％和66.33％，随 着浓度的提高，在同一时间里二斑叶螨的死亡率也逐渐增加。随着孢子悬浮 液浓度的增加，二斑叶螨的致死中时逐渐缩短，在1
×
108个/ml浓度时致死中 时最短，为7.9882d。
[0036]
表2不同浓度的顶孢霉菌株ahy1孢子液对二斑叶螨雌成螨的致死中时
[0037][0038]
实施例2顶孢霉对巴氏新小绥螨的致病力
[0039]
由于巴氏新小绥螨是捕食性天敌，虫生真菌对虫体作用缓慢。因此，在 顶孢霉对巴氏新小绥螨的致病力研究中，同样使用实施例1中的饲养台，将 经过饥饿处理24h的大小一致、健康活泼二斑叶螨的雌成螨挑取至叶片上， 每片10头。用小型手持喷雾器(20ml)将配制好的浓度为1
×
108个/ml的孢 子悬浮液均匀喷洒5ml至叶面，对照用0.05％吐温
‑
80的无菌水处理，在每个 喷洒过孢子悬浮液的饲养台中提供足量的二斑叶螨作为食物，后续若发现食 物不足须及时补充，每个处理重复9次。在光照培养箱(25
±
1℃，l：d＝12h： 12h，rh＝75
±
5％)中培养观察，分别于处理后第3、5、7、9d和11d定时观 察记录巴氏新小绥螨的死亡数。用毛笔轻触螨体，以螨体不动者视为死亡。
[0040]
结果如图1所示，经浓度为1
×
108个/ml的顶孢霉处理后的巴氏新小绥螨 成螨，在3～11天的观察中，累计校正死亡率仅为3.9％，同样处理的二斑叶螨 雌成螨，在第11天时，累计校正死亡率达到66.33％。由图1可知在同一浓度 处理下的巴氏新小绥螨与二斑叶螨，前者的死亡率远远低于后者。将死亡的 巴氏新小绥螨和二斑叶螨置于培养箱(25℃，l：d＝12h：12h，rh＝75％)中， 7天后二斑叶螨体表长出菌丝，见图2；而巴氏新小绥螨体表并无菌丝，在显 微镜下观察，也没有发现感染的症状，为正常死亡，见图3；说明顶孢霉对巴 氏新小绥螨没有致病作用。
[0041]
实施例3顶孢霉对巴氏新小绥螨f0代和f1代的亚致死效应
[0042]
为防止顶孢霉直接接触二斑叶螨对巴氏新小绥螨的取食造成影响，在对 巴氏新小绥螨的亚致病力研究中采用浸液法，将一头刚发育至雌成螨的巴氏 新小绥螨挑入浓度为1.0
×
108个/ml的孢子液中浸泡3
‑
5s，然后接入实施例1 中的饲养台。为了排除不同螨态对捕食螨寿命和繁殖的影响，在饲养台中放 入二斑叶螨卵、若虫和成虫各10头(粒)作为食物。在饲养台上挑入一头雄 螨与雌成螨交配1d后将雄螨挑出。记录交配成功后的雌成螨产卵量，并将雌 成螨转移至另一个饲养台上，继续提供三种螨态二斑叶螨各10头(粒)作为 食物，并记录巴氏新小绥螨的产卵期和成虫寿命，直至雌成螨死亡。将雌成 螨所产的卵挑至干净的饲养台，每台一粒，置于相同的试验条件并记录相关 数据，至f1代全部死亡，试验结束。对照巴氏新小绥螨用0.05％吐温
‑
80无菌 水处理。处理和对照各做60个重复；结果见表3和表4；
[0043]
表3顶孢霉处理后的巴氏新小绥螨f0代雌成螨产卵期、成虫寿命和产卵量
[0044][0045]
注：同列相同小写字母表示差异不显著(p<0.05)
[0046]
表4顶孢霉处理后的巴氏新小绥螨f1代发育历期、产卵期、成虫寿命及产卵量
[0047][0048][0049]
可知，经顶孢霉处理过的巴氏新小绥螨雌成螨与对照相比，产卵前期明 显延长1.56倍(p<0.05)。产卵期、寿命和日产卵量与对照相比均无明显变 化；顶孢霉处理过雌成螨所产f1代巴氏新小绥螨与对照组比较，其发育历期、 产卵前期、产卵期、雌成螨寿命以及日产卵量均差异不显著。
[0050]
实施例4顶孢霉处理后的巴氏新小绥螨对二斑叶螨的捕食功能反应
[0051]
分别将二斑叶螨卵、若螨和雌成螨以密度为3、6、9、12、15和18头(粒) 用细毛笔挑入饲养台中叶片表面。将一头经24h饥饿处理的巴氏新小绥螨雌 成螨挑入顶孢霉孢子悬浮液1
×
104、1
×
106和1
×
108个/ml 3个浓度中，浸渍3～5 s，然后接入饲养台中，放入温度为25
±
1℃，rh＝75
±
5％，l：d＝16h：8h的 人工气候箱中，记录24h后被取食的二斑叶螨数。每个处理重复3次，对照 用0.05％吐温
‑
80无菌水处理；结果见表5；
[0052]
表525℃时不同浓度ahy1处理后的巴氏新小绥螨雌成螨对二斑叶螨的功能反应
[0053][0054][0055]
由表5可知，经顶孢霉孢子悬浮液处理后的巴氏新小绥螨在25℃下对二 斑叶螨三种螨态的捕食功能属hollingⅱ型，随着猎物二斑叶螨密度的增加， 捕食量也随之增加。对三种螨态的捕食能力中对卵最高，若螨次之，雌成螨 最低，处理时间(th)反之，雌成螨最长，若螨次之，卵最短。
[0056]
实施例5巴氏新小绥螨对顶孢霉侵染24h后二斑叶螨的功能反应
[0057]
分别将二斑叶螨卵、若螨和雌成螨以密度为3、6、9、12、15和18头(粒) 用细毛笔挑至豇豆叶背面，待其稳定后在孢霉孢子悬浮液1
×
104、1
×
106和 1
×
108个/ml 3个浓度中，浸渍3～5s，然后将接有三种螨态的二斑叶螨叶片制 作为饲养台，分别于24h后，挑入一头饥饿处理24h的巴氏新小绥螨雌成螨， 置于t＝25
±
1℃，rh＝75
±
5％，l：d＝16h：8h的人工气候箱中，24h后记 录被取食的二斑叶螨数。每个处理重复3次，对照用0.05％吐温
‑
80无菌水处 理。
[0058]
数据分析
[0059]
捕食功能用hollingⅱ圆盘方程na＝atn/(1 at
h
n)拟合(holling,1959)， 式中n(prey density)为供试猎物初始密度，na为猎物被捕食数量，a为瞬 间攻击系数，t试验持续时间(1天)，t
h
为处理时间。本文采用倒数法将方程 na＝atn/(1 at
h
n)简化为线性方程1/na＝1/(an) t
h
，再用最小二乘法估算1/a 和t
h
值，用a/t
h
值评价巴氏新小绥螨的捕食能力。
[0060]
试验数据用excel 2013和spss19.0处理，采用duncan氏新复极差法和 t
‑
检验进行差异显著性分析。结果如表6所示；
[0061]
表625℃时巴氏新小绥螨雌成螨对经ahy1处理24h后二斑叶螨不同螨态的功能反应 方程和参数
[0062]
[0063][0064]
由表6可知，二斑叶螨三种螨态分别被不同浓度顶孢霉孢子悬浮液侵染 24h后，通过测定巴氏新小绥螨对各螨态的捕食功能反应均属hollingⅱ型。 对三种螨态的捕食量卵最大，若螨次之，雌成螨最小。随着孢子悬浮液浓度 的增大，巴氏新小绥螨对二斑叶螨雌成螨的捕食量也随之增大，浓度1
×
108个/ml时捕食量最大。对若螨的捕食量随着浓度的变化捕食量略有增大，偶 尔会有下降，对卵的捕食量随着浓度的变化并无明显变化。
[0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。