一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与流程

1.本发明涉及病毒检测技术领域，具体地，涉及一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)是一种新型β冠状病毒(β
‑
coronavirus)，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状。sars
‑
cov
‑
2的s蛋白(spike protein)受体结合域(receptor binding domain，rbd)可结合人体ace2蛋白，从而病毒进入细胞并复制。同时，rbd也是中和抗体主要靶点。新型冠状病毒中和抗体(nab)是新型冠状病毒肺炎患者及新冠疫苗注射者体内产生的一种抗体，可与s蛋白的rbd结合从而阻断病毒与人体ace2结合，表现出直接中和活性。因此，中和抗体的检测可判断人体是否具有抵抗这种病毒感染的能力，同时能够有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及疫苗效果的评价指标。
3.抗体检测主要包括病毒中性化试验(cvnt)、酶联免疫吸附试验(elisa)和侧流试验(lfa)快速试验。病毒中性化试验(cvnt)可检测病人血液中的中和抗体，但需要在三级生物安全实验室中检测，较为繁琐费时。
4.荧光免疫层析试纸条是以微孔层析膜为固相载体，通过荧光颗粒信号物标记抗原或者抗体，基于毛细管作用进行抗原抗体反应对待测样品进行检测分析技术，相较于常见的elisa、胶体金等方法具有成本低、检测快速、灵敏、即时、无需专业操作等特点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法。。
6.本发明的第一个目的是提供一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条。
7.本发明的第二个目的是提供任一所述的新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条在制备covid
‑
19中和抗体荧光免疫层析检测试剂盒中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供任一所述的新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条的制备方法。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
10.本发明制备了一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条(如图1)，该试纸条依次由pvc底板、样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫构成。利用竞争性结合的方法，在结合垫上喷涂由荧光纳米微球标记的ace2；在反应膜上检测线(test line，t线)位置包被rbd。
11.若样品中不含covid
‑
19的中和抗体，检测时样本流至结合垫时荧光
‑
ace2复合物被溶解，结合垫上的ace2在样品的带动下流经反应膜，与反应膜t线上的rbd结合，其ace2上的荧光微球因此在t线聚集，在激发光照射时显示荧光；若血液中含有covid
‑
19的中和抗体，则样品中的中和抗体可与结合垫上的ace2同步流至反应膜上t线，竞争结合包被的rbd，中和抗体的含量越高，rbd捕获的荧光ace2越少，检测区的荧光值与中和抗体的含量呈负相
关。
12.在本检测方法中，采用荧光标记的羊抗鸡igg和鸡igy作为质控系统(c线)，起到质控与对照作用。将t线的荧光强度(f
t
)与c线荧光强度(f
c
)作比，建立测试标准曲线，将未知样本的f
t
/f
c
带入曲线，得出样本中中和抗体的含量。如果测试时c线处不出现荧光或者荧光未达到最低预测值，则表明此次测值无效，应进行重复测试。
13.因此本发明要求保护一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条，包括依次接合在底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫；
14.其中，结合垫上包被有偶联时间分辨荧光微球的ace2和羊抗鸡igg；
15.反应膜上设有检测线与质控线，检测线上包被有rbd，质控线上包被有鸡igy抗体。
16.优选地，所述时间分辨荧光微球的激发波长为300～400nm，发射波长为500～700nm。
17.优选地，结合垫上包被有偶联铕标记的时间分辨荧光微球的ace2和羊抗鸡igg。
18.优选地，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是直径为100nm～500nm的铕作为标记物的荧光微球。
19.优选地，其特征在于，所述结合物垫为玻璃纤维或聚酯材料。
20.优选地，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
21.优选地，样品垫经过样品垫的缓冲液浸泡后干燥，样品垫的缓冲液配方如下：0.5％bsa、2.5％蔗糖、1.5％tween
‑
20溶解于0.015m ph＝9pb缓冲液中。
22.优选地，结合垫用含1％牛血清白蛋白(w/w)、0.1～5％的海藻糖(w/w)和0.02～0.1％tween
‑
20(v/v)、ph 7.4的0.02～0.05mol/l tris
‑
hcl缓冲液浸泡干燥后再包被偶联时间分辨荧光微球的ace2和羊抗鸡igg。
23.任一所述的covid
‑
19中和抗体荧光免疫层析检测试纸条在制备covid
‑
19中和抗体荧光免疫层析检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
24.本发明还要求保护任一所述的covid
‑
19中和抗体荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，偶联有时间分辨荧光微球ace2蛋白喷涂在结合物释放垫上，得到包被有偶联有时间分辨荧光微球ace2蛋白的结合物垫；结合垫用含1％牛血清白蛋白(w/w)、0.1～5％的海藻糖(w/w)和0.02～0.1％tween
‑
20(v/v)、ph 7.4的0.02～0.05mol/l tris
‑
hcl缓冲液浸泡干燥后，将rbd和鸡igy分别喷涂于反应膜上作为检测线和质控线；样品垫经过样品垫的缓冲液浸泡后干燥即得，样品垫的缓冲液配方如下：0.5％(质量分数)bsa、2.5％(质量分数)蔗糖、1.5％(体积分数)tween
‑
20溶解于0.015m ph＝9pb缓冲液中。
25.优选地，将时间分辨荧光微球进行活化，与ace2蛋白混合，进行共价偶联。充分反应之后加入封闭缓冲液进行封闭。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明提供一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条，其具有成本低、检测快速、灵敏、即时、无需专业操作等特点，只需在二级生物安全实验室就可完成。该试纸条可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；提高新冠检出率，弥补核酸检测假阴性带来的漏检；检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险。
附图说明
28.图1新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条原理图
具体实施方式
29.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
30.实施例1一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
31.一、实验方法
32.1、样品垫的制备
33.将规格为25cm
×
30cm的玻璃纤维浸泡在样品垫的缓冲液中，浸泡3～5min后取出，室温干燥16～18h后，切割成2cm
×
30cm规格的样品垫。
34.样品垫的缓冲液配方如下：0.5％(质量分数)bsa、2.5％(质量分数)蔗糖、1.5％(体积分数)tween
‑
20溶解于0.015m ph9 pb缓冲液中。
35.2、荧光标记物制备与结合垫的制备方法
36.1)荧光标记ace2的制备：将200μl铕标记的时间分辨荧光微球加入到2ml ep管中，再加入800μl 0.1m ph6.0 mes，避光混匀；接着加入200μl 1mg/ml的nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)和200μl 50mg/ml的edc(碳二亚胺)，混匀后室温活化反应30分钟，活化反应后，于15000rpm，离心25min，弃上清，加入1ml mes，超声重悬乳胶微球，再加入100μl的2mg/ml的ace2，混匀后室温避光反应2小时；加入10％bsa(牛血清白蛋白)使bsa最终为1％，混匀后室温反应1小时；15000rpm离心15分钟，离心后收集沉淀物并且用复溶解液(0.015m ph7.4的pbs：10％bsa：tween
‑
20的体积比为90：10：1)复溶至原体积的两倍，得到荧光标记ace2。
37.2)荧光标记羊抗鸡igg的制备：将200μl时间分辨荧光微球加入到2ml ep管中，再加入800μl 0.1m ph6.0 mes，避光混匀；接着加入200μl 1mg/ml的nhs(n
‑
羟基琥珀酰亚胺)和200μl 50mg/ml的edc(碳二亚胺)，混匀后室温活化反应30分钟，活化反应后，于15000rpm，离心25min，弃上清，加入1ml mes，超声重悬乳胶微球，再加入20μl的2mg/ml的羊抗鸡igg，混匀后室温避光反应2小时；加入10％bsa(牛血清白蛋白)使bsa最终为1％，混匀后室温反应1小时；15000rpm离心15分钟，离心后收集沉淀物并且用复溶解液(0.015m ph7.4的pbs：10％bsa：tween
‑
20的体积比为90：10：1)复溶至原体积的两倍，得到荧光标记羊抗鸡igg。
38.3)荧光标记的ace2与羊抗鸡igg按照9:1的体积比例混合。
39.4)玻璃纤维上用含1％牛血清白蛋白(质量分数)、ph 7.4的0.02～0.05mol/l tris
‑
hcl(含0.1～5％的海藻糖和0.02～0.1％tween
‑
20)缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h，置于干燥环境中保存备用。
40.5)用喷金划膜仪将混合后的标记物喷到10mm
×
30cm的玻璃纤维上，37℃干燥18～24h后即为结合垫，备用。
41.3、反应膜的制备
42.1)包被反应膜。
43.质控线(c线)：在硝酸纤维膜上划线，c线与硝酸纤维素膜下缘的距离为0.5cm，与上缘的距离为2cm，用包被缓冲液将鸡igy抗体稀释到1mg/ml进行包被，划线参数为1μl/cm；
44.检测线(t线)：t线与硝酸纤维素膜上缘的距离为2cm，与上缘的距离为0.5cm，用包被缓冲液将rbd稀释到1.0mg/ml进行包被，划线参数为1μl/cm；
45.其中，包被缓冲液：0.01m pbs ph7.4 1％葡聚糖。
46.2)干燥
47.放入37℃烘箱，干燥6～12小时。
48.4、组装
49.各组件在底板上的排列顺序依次为吸收垫
‑‑
反应膜(硝酸纤维素膜)
‑‑
结合垫
‑‑
样品垫，
50.1)吸收垫的粘贴：将底板平铺于工作台面上；揭开底板上缘吸收垫粘贴处的保护膜，将吸收垫粘附于其上，吸收垫覆盖在反应膜(硝酸纤维素膜)上2mm。
51.2)结合垫粘贴：揭开反应膜(硝酸纤维素膜)缘结合垫粘贴处的保护膜，将结合垫粘附于其上，方法同吸收垫，结合垫覆盖在反应膜(硝酸纤维素膜)上2mm。
52.3)样品垫的粘贴：将样品垫粘附于结合垫下部，方法同吸收垫。样品垫覆盖在结合垫上2mm。
53.4)试纸条切割与装卡：将粘贴好的底板放入切条机中，切成4mm宽的试纸条，然后装入塑料卡壳中。
54.二、组成
55.包括依次接合在底板上的样品垫、结合垫、反应膜(硝酸纤维素膜)和吸收垫的试纸，
56.其中，结合垫上包被有偶联铕标记的时间分辨荧光微球的ace2和羊抗鸡igg，
57.样品垫：规格为25cm
×
30cm的玻璃纤维，经过样品垫的缓冲液浸泡后干燥，样品垫的缓冲液配方如下：0.5％bsa(质量分数)、2.5％蔗糖(质量分数)、1.5％tween
‑
20(体积分数)溶解于0.015m ph＝9pb缓冲液中；
58.反应膜(硝酸纤维素膜)，宽度为25mm，设有检测线与质控线，检测线上包被有rbd，质控线上包被有鸡igy抗体。
59.纸质条封装在壳体内成为检测卡，在壳体上依次设置有样本加样孔和观察孔窗，其中检测线和质控线与观察孔窗位置相对应，样本加样孔设置于样品垫上方。
60.三、使用方法
61.1)将试纸条和待测样品恢复至室温；
62.2)开启免疫荧光分析仪，插入对应空白检测卡以调整读数位置；使用时除去试剂条外包装，取出试剂，水平放置；
63.3)向制备得到的检测卡的加样孔加入已用pbst 20倍稀释的待测样本血清100μl，反应15min后，将检测卡插入免疫荧光分析仪，点击仪器上的“测试”按键
64.4)截留在试纸条的检测线和质控线的时间分辨荧光微球在最佳激发光下，发出强烈的荧光条带；
65.5)采用免疫层析分析仪读取试纸条的检测线和质控线的荧光强度，给出t/c值，并以抑制率＝1
‑
(t
测
/c
测
÷
t
阴
/c
阴
)计算出样品中中和抗体的含量，抑制率均大于30％为阳性。
66.实施例2新冠康复者及疫苗注射者血液样本的检测
67.一、实验方法
68.使用实施例1的试纸条检测临床样本。本实施例纳入了8位新冠康复者、8位疫苗接种者，以及16例健康者作为对照。以评价实施例1的试纸条的对于新冠病毒中和抗体的检测效果。
69.二、实验结果
70.检测结果见表1，8位新冠康复者、8位疫苗接种者抑制率均大于30％，本试纸条可检测血清中的中和抗体。
71.表1：
[0072][0073][0074]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的
精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。