一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法与流程

1.本发明属于致敏原检测技术领域，尤其涉及一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法。


背景技术：

2.高油酸花生是油酸含量达到70％以上的花生品种。高油酸花生在提高油酸含量的同时，降低亚油酸的含量，提高油酸与亚油酸含量的比值，加强花生抗氧化的能力，提高储藏稳定性。目前高油酸花生致敏性相关研究不充分。目前常用于检测花生致敏原的方法有两类：一种是基于致敏原成分基因的检测方法，如：聚合酶链反应(pcr法)、实时荧光聚合酶链反应(rt
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pcr)等；另一种是基于致敏蛋白的检测方法，如，酶联免疫吸附试验(elisa)、表面等离子共振法(spr)、免疫印迹法(wb)等。
3.聚合酶链反应法，即pcr扩增法，是基于dna复制过程中碱基互补配对原则的基因水平致敏原检测方法，具有较高的灵敏度和选择度、特异性强，不会漏检致敏原花生源性成分，具有可靠的安全保障性等优势。实际加工生产过程中会经过一系列复杂的加工方式，可能会使花生致敏蛋白的结构受到破坏，免疫活性降低，此时再用传统方法将会使试验结果出现偏差。在这种情况下，因为普通的加工处理不能破坏花生致敏蛋白的dna，相较于直接检测花生致敏蛋白，利用pcr法检测dna残留则更加可靠。pcr法对样品纯度要求较低，dna粗制品和rna均可直接作为扩增模板用于检测。目前，pcr法也存在一些缺陷，pcr法只能甄别原料中是否存在花生源性成分，并不能够特异性地检测花生致敏蛋白基因；且使用pcr检测花生致敏原容易出现假阴性和假阳性的现象；此外，实验过程中还可能会出现交叉污染。这些都局限了pcr法检测致敏原的发展。
4.酶联免疫吸附试验(elisa)有着反应迅速，灵敏度高，针对性强等优点，elisa法是目前免疫学检测中应用最为广泛的技术。但是由于加热过程会改变致敏蛋白的一级结构，使抗体无法正确识别被检测致敏原，产生假阴性现象。此外，食品组分复杂，且加工会造成蛋白质变性，elisa这种抗原抗体的检测模式也会发生交叉反应，出现检测值偏高和假阳性现象，影响实验结果准确性。
5.目前，免疫印迹法(wb)法已经很成熟，免疫印迹法在检测花生致敏蛋白方面有很多优势，但因为实验操作的原因易出现多条带、没有条带、背景出现黑色斑点、凝胶染色不均匀等现象，影响试验的准确性，所以，免疫印迹法大多数用于致敏蛋白的定性分析。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，该方法快速且准确。
7.本发明提供了一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，包括以下步骤：
8.利用质谱平行反应监视法对高油酸花生提取物进行质谱分析，得到蛋白质信息；
9.将所述蛋白质信息与uniprot数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，得到
与花生过敏有关的致敏蛋白；
10.按照特定的筛选条件筛选出致敏蛋白中的特异性肽段，得到特定致敏原中的特异性肽段；筛选含有特异性肽段的致敏蛋白的条件包括：1)无任何修饰(如氧化、脱氨基以及氨基甲基化)；2)psms(peptides spectrum matchs)＞3，即图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸(c)和甲硫氨酸(m)。
11.在本发明中，所述质谱分析的结果使用proteome discover软件在uniprot/swiss
‑
prot数据库进行检索。
12.在本发明中，所述质谱分析的色谱柱条件为：c
‑
18色谱柱；流速：300μl/min；进样体积2ml；a液：0.1％甲酸水溶液，b液：0.1％甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱；
13.质谱条件：电子源：esi；扫描方式：prm；采用正离子模式，离子传输管温度320℃；一级全扫描范围为350～1550m/z；二级扫描agc设置为5.0e4，离子注入时间it设为100ms，碰撞能量为32ev。
14.在本发明中，所述高油酸花生提取物按照以下方法制得：
15.将花生剥壳去红衣，粉碎，脱脂，得到脱脂花生粉末；
16.将所述脱脂花生粉末与缓冲溶液混合，8500～9500rpm下剪切55～65s，再在4℃下磁力搅拌4～4.2h，得到的花生蛋白匀浆离心，收集上清液；
17.将所述上清液煮沸，上样，用bio
‑
rad预制胶和垂直电泳槽，恒定电压150v电泳50min，考马斯亮蓝染色后脱色，得到凝胶条带；
18.切下所述凝胶条带，切碎，用乙腈和碳酸氢铵脱色，二硫苏糖醇还原二硫键，用胰蛋白酶酶解，35℃～40℃下处理10～15h，然后终止酶解反应，所得到肽段用含0.1％的三氟乙酸和50％丙酮溶解液提取多次，将提取的肽段浓缩，再复溶于甲酸溶液中，离心，得到高油酸花生提取物。
19.在本发明中，所述凝胶条带中过敏蛋白的分子量为5kda～75kda。
20.在本发明中，所述特异性肽段包括q9sqh7、b0yiu5、b6cg41、q647g5、o82580和q45w87中的一种或多种。所述特异性肽段优选还包括n1ng13、b0yiu5、b6cg41、q647g5和q45w87中的一种或多种。
21.本发明提供了一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，包括以下步骤：利用质谱平行反应监视法对高油酸花生提取物进行质谱分析，得到蛋白质信息；将所述蛋白质信息与uniprot数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，得到与花生过敏有关的致敏蛋白；按照条件筛选出致敏蛋白中的特异性肽段，得到致敏蛋白中的特异性肽段；筛选致敏蛋白中特异性肽段的条件包括：1)无任何修饰(如氧化、脱氨基以及氨基甲基化)；2)psms(peptides spectrum matchs)＞3，即图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸(c)和甲硫氨酸(m)。本发明提供的方法能够定性定量检测花生致敏蛋白，且准确度较高。该方法能够解决免疫学方法通量低、存在交叉干扰等弊端，也可以解决pcr法无法直接检测致敏蛋白的缺点，还能够确证蛋白质和肽段，并特异性筛选出对应肽段，为后续使用同位素稀释法鉴定花生致敏原奠定基础。
附图说明
22.图1为本发明实施例1的电泳中各过敏原组分分布图。
具体实施方式
23.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
24.实施例1
25.1.高油酸花生致敏原蛋白提取
26.1.1实验方法
27.a.花生脱脂
28.将花生剥壳去红衣，用粉碎机粉碎成花生泥。将花生泥与丙酮按质量体积比1:10混合，于4℃磁力搅拌脱脂4h，然后进行抽滤，得到沉淀。所得沉淀重复脱脂1次，经离心分离得脱脂花生粉末。
29.b.致敏蛋白提取
30.将脱脂花生粉末与含1m nacl，ph8.0 0.05m的tris
‑
hcl缓冲溶液按质量体积比1mg:10ml混合，9000r/min高速剪切1min，于4℃下磁力搅拌4h，将花生蛋白匀浆在4℃下以5000r/min离心30min，收集上清液。将沉淀重新粗提取蛋白1次，收集二次提取上清液。
31.c.分离花生致敏原蛋白
32.sds
‑
page：将高油酸花生提取物用1ml 2x sds loading buffer溶解后离心，将上清液移至干净的ep管中，煮沸5min，上样量2μl，用bio
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rad预制胶和垂直电泳槽，恒定电压150v电泳50min，考马斯亮蓝染色后脱色。
33.1.2结果分析与讨论
34.通过两次提取后得到的上清液与沉淀，其电泳图中各过敏原组分分布见图1，图1为两次粗提取上清液与沉淀花生蛋白sds
‑
page电泳谱图，其中，1.加样量为1μl第一次粗提取上清液；2.加样量为2μl第一次粗提取上清液；3.加样量为2μl第二次粗提取上清液；4.加样量为4μl第二次粗提取上清液；5.加样量为2μl第一次粗提取沉淀；6.加样量为4μl第一次粗提取沉淀；7.加样量为5μl第二次粗提取沉淀；8.加样量为10μl第二次粗提取沉淀。其中主要过敏蛋白以分子量标记：ara h1(63.5kda)、ara h2(17kda)、ara h6(15kda)。由图1可知，两次粗提取均提取出了ara h1、ara h2、ara h6。沉淀中含量较少，证明提取方法有效。
35.2.花生致敏原蛋白鉴定
36.2.1实验方法
37.a.凝胶胰蛋白酶消化
38.切下sds
‑
page电泳后得到的凝胶，对应的蛋白质条带，进一步切碎成1mm3小块，转移于ep管中，用乙腈和碳酸氢铵脱色，二硫苏糖醇(dtt)还原二硫键，用胰蛋白酶酶解，37℃过夜处理，然后用10％的三氟乙酸终止酶解反应，所得到肽段用含0.1％的三氟乙酸和50％丙酮溶解液提取两次，将提取好的肽段用真空离心浓缩仪进行浓缩，再用0.1％甲酸超纯水复溶，高速离心混匀，用于质谱检测。
39.b.质谱检测
40.利用thermo orbitrap fusion质谱平行反应监视法(prm)定性高油酸花生提取物中的致敏原。色谱柱条件：c
‑
18色谱柱(75μm
×
2cm,5μm,varian,lexington,ma)。流速：300μl/min；进样体积2ml；a液：0.1％甲酸水溶液，b液：0.1％甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱。
41.质谱条件：电子源：esi；扫描方式：prm；采用正离子模式，离子传输管温度320℃；一级全扫描范围位350
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1550m/z；二级扫描(dd
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ms2)agc设置为5.0e4，离子注入时间it设为100ms，碰撞能量为32ev，对所有质谱结果使用proteome discover(version 1.4)软件在uniprot/swiss
‑
prot数据库进行检索，得到最合适鉴定结果。
42.2.2质谱结果与分析
43.将电泳条带酶水解后进行质谱分析，得到结果。使用质谱分离出1159个蛋白质，其中752个蛋白质得分大于或等于5(质谱中响应强度≥5)，可信度较高。将得到的蛋白质与uniprot数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，共从752个蛋白质中筛选出了16个与花生过敏有关的蛋白质或蛋白质亚基。其中有2个来自ara h1，2个来自ara h2，3个来自ara h3，3个来自ara h4，2个来自ara h6，其余四个分别来自ara h8(17kd)、ara h10(16kd)、ara h11(14kd)和ara h14(17.5kd)。
44.针对被筛选出的相关蛋白质，按照以下几个条件筛选特异性肽段：1)无任何修饰，如氧化、脱酰胺等；2)psms>3，即图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)对应的蛋白质不超过2个，即该序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸(c)和甲硫氨酸(m)。
45.冀花5(jh5)为普通油酸花生，从表1中可以看出，筛选后有14种花生致敏蛋白的21个蛋白亚基的76个序列符合条件。对比文献发现，q9sqh7、b0yiu5、b6cg41、q647g5先前文献中已有报道。与之前的文献对比发现，n1ng13中的nnpfyfpsr、ivqieakpntlvlpk、gseeegditnpinlr、egeqewgtpgshvr、rpshqqpr、eeeededeeeegsnr、ssennegvivk、egepdlsnnfgk、nnpfyfpsr、ehveeltk和q9sqh7中的ffvppfqqspr等肽段(已在表1中加粗标记)已有报道，由此可以验证该筛选方法的可行性。除此之外，此方法还在致敏蛋白ara h 1(n1ng13)中筛到3个未经报道的特异性肽段(dgepdlsnnfgr、kgseeegditnpinlr、nnpfyfpsrr)，致敏原蛋白ara h 8(b0yiu5)、ara h 9(b6cg41)、ara h 10(q647g5)等蛋白质亚基中筛选到未经报道的特异性肽段。
46.表1冀花5致敏蛋白亚基及其特异性肽段
47.48.49.[0050][0051]
冀花13(jh13)为高油酸花生，从表2中可以看出，筛选后有11种花生致敏蛋白中的16个蛋白亚基的64个序列符合条件。对比文献发现，q9sqh7、b0yiu5、q647g5等亚基的18个肽段先前文献中已有报道，如q9sqh7中的ffvppfqqspr等肽段(已在表2中加粗标记)，由此可以验证该筛选方法的可行性。除此之外，此方法筛选到了致敏原蛋白ara h 1(n1ng13)中5个未经报道的特异性肽段(grreeeededeeeegsnr、vskehveeltk、kgseeegditnpinlr、nnpfyfpsrr、ehveeltk)，其他致敏蛋白和亚基中也筛选到了未经报道的特异性肽段。
[0052]
表2冀花13致敏蛋白亚基及其特异性肽段
[0053]
[0054]
[0055][0056]
冀花16(jh16)为高油酸花生，从表3中可以看出，筛选后有8种花生致敏蛋白中的18个蛋白亚基的68个序列符合条件。对比文献发现，o82580、q9sqh7、q647g5先前文献中已有报道。与之前的文献对比发现o82580的ffvppsqqspr和q9sqh7中的ffvppfqqspr等肽段(已在表3中加粗标记)已有报道，由此可以验证该筛选方法的可行性。除此之外，此方法筛到了致敏原蛋白ara h 1(n1ng13)中5个未经报道的特异性肽段(grreeeededeeeegsnr、vskehveeltk、kgseeegditnpinlr、nnpfyfpsrr、ehveeltk)，致敏原蛋白ara h 8(b0yiu5)、ara h 10(q647g5)等蛋白质和亚基中也筛到了未经报道的特异性肽段。
[0057]
表3冀花16致敏蛋白亚基及其特异性肽段
[0058]
[0059]
[0060][0061]
冀花18(jh18)为高油酸花生，从表4中可以看出，筛选后有9种花生致敏蛋白中的12个蛋白亚基的76个序列符合条件。对比文献发现，o82580、q9sqh7、q647g5、q45w87先前文献中已有报道。与之前的文献对比发现o82580的adeeeeydedeyeydeedr和q9sqh7中的ffvppfqqspr等肽段(已在表4中加粗标记)已有报道，由此可以验证该筛选方法的可行性。除此之外，此方法筛到了致敏原蛋白ara h1(n1ng13)中5个未经报道的特异性肽段(grreeeededeeeegsnr、vskehveeltk、kgseeegditnpinlr、nnpfyfpsrr、ehveeltk)，致敏原蛋白ara h 10(q647g5)、ara h 11(q45w87)等蛋白质和亚基中也筛到了未经报道的特异性肽段。
[0062]
表4冀花18致敏蛋白亚基及其特异性肽段
[0063]
[0064]
[0065][0066]
由以上实施例可知，本发明提供了一种利用质谱法检测高油酸花生中致敏原的方法，包括以下步骤：利用质谱平行反应监视法对高油酸花生提取物进行质谱分析，得到蛋白质信息；将所述蛋白质信息与uniprot数据库中的生物信息学数据进行比对和筛选，得到与花生过敏有关的致敏蛋白；通过特定的筛选条件筛选出致敏蛋白中的特异性肽段；筛选出的特异性肽段的条件包括：1)无任何修饰；2)图谱库中与该段氨基酸序列相吻合的谱图数大于3；3)序列仅在某个或某两个蛋白质中存在；4)氨基酸数目为7～20；5)肽段中不含有半胱氨酸和甲硫氨酸。本发明提供的方法能够定性定量检测花生致敏蛋白，且准确度较高。该方法能够解决免疫学方法通量低、存在交叉干扰等弊端，也可以解决pcr法无法直接检测致敏蛋白的缺点，还能够确证致敏蛋白和肽段，并特异性筛选出对应肽段，为后续使用同位素稀释法鉴定花生致敏原奠定基础。
[0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。