一种指示菌株及利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的方法与流程

1.本发明属于植物保护技术领域，具体地，涉及一种指示菌株及利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的技术方法。


背景技术：

2.稻黄单胞菌稻生致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，即水稻细菌性条斑病菌，引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上的重要病害之一，属全国植物检疫性病害，常年发生为害面积达300
‑
500万亩，主要为害籼稻，尤其是杂交籼稻，通常造成水稻产量损失5％
‑
15％，严重时达50％以上。水稻细菌性条斑病主要在病田收获的稻谷、病稻草上越冬，成为第二年主要的初侵染源；水稻播种或移栽后，水稻细菌性条斑病菌在田间开始缓慢增殖，适宜条件下病原菌完成侵染并急速增殖，引发水稻细菌性条斑病，然后借助风雨水露在田间扩展蔓延，造成严重危害。当前，防控水稻细菌性条斑病的主要措施是以预防为主，登记的噻菌铜、噻霉酮、噻唑锌等药剂在发病初期使用可以取得较好防控效果，但是，对病害的治疗效果一般。因此，准确预测病害发生时期将为水稻细菌性条斑病的预防控制提供技术支撑。目前，采用大田定期踏查或设立专门的预测圃，调查初始发病点或发病中心，再结合中短期天气预报预测病害的发生发展。现有方法见病后才能发布预警信息，不能准确预测病害发生时期，使得大田水稻细菌性条斑病的防控工作表现滞后性，总体防控效果不高。
3.噬菌体与寄主细菌间存在高度的专化性，并且噬菌体数量与寄主细菌的数量呈正相关。噬菌体可以将寄主细菌快速裂解，在含有寄主细菌的培养基固体平板上形成肉眼可见的透明噬菌斑，通过噬菌斑的形成数量可以快捷、简易的评估寄主细菌的数量。在水稻细菌性条斑病菌侵染水稻至表现病害症状期间，病原菌迅速增殖，稻田水中的噬菌体数量也相应急剧增加(急增期)；通过监测田水中噬菌体数量，可以预测水稻细菌性条斑病的发生时间，从而适期开展病害防控，提高病害防控效果，减少化学农药用量。
4.但是由于噬菌体与菌株之间亲和性存在分化，且水稻细菌性条斑病发展还受到内外因素的影响，导致利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的技术方法不成熟，预测准确度较低，对病害预防控制缺乏实际指导价值。因此，提供一种快捷、简易且相对准确的水稻细菌性条斑病发生期预测方法，对病害预防控制具有重要指导价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种指示菌株及利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的技术方法，以解决上述存在的技术问题，使得利用噬菌体能够快捷、简易、准确的预测水稻细菌性条斑病发生期。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
7.本发明所述的指示菌株，菌株编号为xz45，采用菌落形态观察、菌体形态观察和
16s rrna基因序列测定相结合的方法，将该菌株鉴定为稻黄单胞菌稻生致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，即水稻细菌性条斑病菌。该菌株已于2021年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为cgmcc no.21877。本发明所述的指示菌株具有灵敏、广亲和性的特点，可以更高灵敏度的进行水稻细菌性条斑病预测发生和指示。
8.水稻细菌性条斑病菌xz45在na固体培养基平板上，28℃条件下培养36
‑
48h后的菌落特征：菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色，直径达到1
‑
1.5mm。透射电镜观察下的菌体形态：菌体短杆状，大小(0.4
‑
0.6)μm
×
(1.1
‑
2.0)μm；无芽孢和荚膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围；单生，很少成对，不呈链状；极生鞭毛一根(图1)。
9.本发明提供一种利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的方法，包括以下步骤：
10.(1)样品的采集和制备：自水稻移栽返青后或直播水稻分蘖期开始，每间隔3
‑
10天采集1次田水，过滤除菌形成无菌样品；如果田间无水，采集田泥替代，加入田泥重量2
‑
3倍的无菌水混匀，然后静置取上清过滤除菌，形成无菌样品；
11.(2)指示菌液的制备：将指示菌株xz45接种到nb液体培养基中，28℃
‑
30℃条件下培养36
‑
48h，震荡频率120r/min
‑
200r/min，利用无菌水将菌体浓度调整到3.0
×
108‑
2.0
×
109cfu/ml，作为指示菌液；
12.(3)噬菌体检测：将0.1
‑
2.0ml的步骤(1)的无菌样品和0.5
‑
2ml的步骤(2)的指示菌液添加到无菌培养皿中，混合均匀，然后添加40℃
‑
45℃的液态na培养基，迅速混匀，凝固后在28℃
‑
30℃条件下倒置培养10
‑
16h，调查噬菌斑个数，统计田水或田泥中的噬菌体密度；
13.(4)水稻细菌性条斑病发生期的预测：水稻处于分蘖期时，当噬菌体密度大于或等于150pfu/ml，且未来7
‑
14天内日最高气温25℃
‑
35℃的天数大于或等于70％，降雨日数大于或等于40％，预测未来7
‑
14天该田块将发生水稻细菌性条斑病；水稻处于孕穗抽穗期时，当噬菌体密度大于或等于150pfu/ml，且未来4
‑
10天内最高气温25℃
‑
35℃的天数大于或等于70％，降雨日数大于或等于40％，预测未来4
‑
10天该田块将发生水稻细菌性条斑病；当噬菌体密度大于或等于150pfu/ml，但未来天气预报日最高温度＜24℃、最高温度＞35℃和多云晴朗天数累计超过50％，且降雨日数小于40％，水稻细菌性条斑病的发生将推迟或不发病。本发明的推迟是指预测的未来7
‑
14天内暂时不发病。
14.本发明未来天气可以根据天气预报来获知。
15.本发明根据连续检测结果，结合水稻生育期和中短期天气预报，可以准确预测水稻细菌性条斑病的发生期。
16.本发明步骤(1)获取的样品优选的立刻放入低温样品箱中保存，避免噬菌体数量变化造成的准确度差异，优选的将获取的田水或田泥形成的无菌样品4℃备用，保存时间不超过48h。
17.本发明步骤(1)获取的样品可以采用常规的方法过滤除菌，例如利用0.22μm细菌过滤器过滤除菌；如果是田泥，添加2
‑
3倍重量无菌水震荡混匀，然后静止10
‑
15min，取上清，利用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。
18.进一步地，上述步骤(1)所述样品采集方法优选为：选择水稻种植田块，自水稻移栽返青后或直播水稻开始分蘖起，在田块内随机选5个点，每点取样20
‑
100ml田水，间隔5
‑
7天取样1次；进入水稻孕穗抽穗期，在田块内随机选5个点，每点取样20
‑
100ml田水，间隔3
‑
5天取样1次。进一步的，选用无菌容器进行取样，台风暴雨前后可以各增加一次取样。将取得样品迅速转移到低温(2℃
‑
8℃)样品箱内。
19.在一些实施方式中，本发明提供了一种具体的步骤(2)的指示菌液的制备方法，其包括：将
‑
80℃甘油保存指示菌株xz45接种到na固体培养基平皿上，26℃
‑
30℃条件下培养36
‑
48h；挑取一个单菌落接种到nb液体培养基中，28℃
‑
30℃条件下培养36
‑
48h，震荡频率120r/min
‑
200r/min；将培养液以1％(v/v)转接到新鲜nb液体培养基中，28℃
‑
30℃条件下培养12
‑
30h,震荡频率120r/min
‑
200r/min，利用无菌水将菌体浓度调整到3.0
×
108‑
2.0
×
109cfu/ml，作为指示菌液，在一种更优选的制备方法中，包括(a)选用遗传特性稳定、致病力强、广亲和性的水稻细菌性条斑病菌菌株xz45作为指示菌株；(b)将
‑
80℃甘油保存的指示菌株划线接种到na固体培养基平皿上，28℃
‑
30℃条件下培养36
‑
48h；(c)挑取一个单菌落接种到nb液体培养基中，28℃
‑
30℃、120r/min
‑
200r/min条件下培养36
‑
48h；(d)将培养液以1％(v/v)转接到新鲜nb液体培养基中，28℃
‑
30℃、120r/min
‑
200r/min条件下培养18
‑
24h；(e)利用无菌水将菌体浓度调整到3.0
×
108‑
2.0
×
109cfu/ml，作为指示菌液。
20.本发明的指示菌株优选为水稻细菌性条斑病菌xz45，该菌株对噬菌体亲和性广且遗传特性稳定；优选的菌体密度为4.0
×
108‑
1.2
×
109cfu/ml，进一步优选的为5.0
×
108‑
1.2
×
109cfu/ml。
21.进一步地，制备的指示菌液在2小时内使用，更进一步地优选为现制现用。
22.在一些实施方式中，提供了一种固体培养基平皿检测方法，其包括：(a)将上述步骤(2)中处理好的无菌样品滤液和菌体密度为4.0
×
108‑
1.2
×
109cfu/ml的指示菌液添加到无菌培养皿中，混合均匀；(b)然后添加40℃
‑
45℃的液态na培养基10
‑
12ml，迅速混匀，凝固后在28℃
‑
30℃条件下倒置培养10
‑
16h，调查噬菌斑个数，统计田水或田泥中的噬菌体密度。
23.本发明根据连续检测结果，当水稻田水中噬菌体数量达到或超过150pfu/ml时，表明噬菌体进入急增期，结合未来中短期天气预报情况以及水稻生育期等可以准确预测病害的发生期。
24.进一步地，从步骤(1)样品采集到步骤(3)无菌样品和指示菌液混合宜在48h内完成，更进一步优选为在36h内完成。
25.在本发明的一些实施方式中，nb培养基组分为：蛋白胨5g/l，蔗糖10g/l，酵母提取物1g/l，牛肉浸膏3g/l，ph 6.8
‑
7.2；所述nb培养基的制备方法为各组分加水定容至1000ml，调ph 6.8
‑
7.2，121℃条件下灭菌20min。在上述nb培养基中添加琼脂粉15g/l，即为na固体培养基。
26.本发明所述的水稻为籼稻品种，包括常规籼稻和杂交籼稻。
27.本发明公开了以下技术效果：
28.本发明以生物学特性稳定、亲和性广的水稻细菌性条斑病菌菌株xz45作为指示菌，克服了噬菌体与不同来源水稻细菌性条斑病菌菌株的亲和性存在分化的问题，建立了利用噬菌体快捷、简易的预测水稻细菌性条斑病发生期的技术方法。规定了噬菌体的急增
期，结合水稻生育期及中短期天气预报，能够实现相对准确的预测水稻细菌性条斑病的发生期。从而提高病害的预防控制效果，减少化学农药用量，具有较好的经济、生态和社会效益。
附图说明
29.图1为水稻细菌性条斑病菌xz45在na培养基平板上的菌落及菌体形态；
30.图2为基于水稻细菌性条斑病菌xz45的16s rrna基因序列的blastn检索；
31.图3为水稻细菌性条斑病菌xz45作为指示菌株对田水中噬菌体数量的平皿检测；
32.图4为利用指示菌株xz45检测不同区域发病田块田水中的噬菌体数量。
具体实施方式
33.以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。若无特殊说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特殊说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规试剂材料。
34.本发明所涉及的7株噬菌体指示菌株水稻细菌性条斑病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzicola,xoc)rs105、xoc
‑
192、xoc
‑
197、xz45、xoc
‑
s、xoc
‑
m和xoc
‑
w为本研究室长期保存菌株，承诺向公众永久开放，其中本发明所述的xz45菌株致病性强、生物学特性稳定，对噬菌体亲和性广、灵敏度高，已于2021年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为cgmcc no.21877。
35.以下所述的nb培养基组分为：蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，加水定容至1000ml，ph 6.8
‑
7.2，121℃条件下灭菌20min；在nb培养基中添加琼脂粉15g/l，即为na固体培养基。
36.以下所述实施例仅为本发明部分较好的实施例，仅用于描述本发明，不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
37.实施例1：指示菌株xz45的鉴定
38.(1)指示菌株xz45的形态观察：利用无菌接种环从4℃保存的xz45平板上挑取菌体，在na固体培养基平板上划线培养，28℃条件下培养36
‑
48h后的菌落特征：菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色，直径达到1
‑
1.5mm。挑取菌体利用透射电镜观察，菌体形态特征：菌体短杆状，大小(0.4
‑
0.6)μm
×
(1.1
‑
2.0)μm；无芽孢和荚膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围；单生，很少成对，不呈链状；极生鞭毛一根。xz45的菌落及菌体形态如图1。
39.(2)指示菌株xz45的分子鉴定：利用灭菌牙签挑取xz45培养平板上的单菌落于含有50ml nb液态培养基的250ml三角瓶中，180r/min、28℃条件下培养36h，利用细菌基因组dna提取试剂盒提取xz45的总基因组dna。利用细菌16s rrna基因的通用引物16sf(5
’‑
agagtttgatcatggctcag
‑3’
)和16sr(5
’‑
acggttaccttgttacgactt
‑3’
)pcr扩增dna片段，对pcr产物进行测序。基于获得16s rrna基因序列(seq id no.1)在ncbi genbank数据库中进行blsatn检索比较，发现xz45与ncbi genbank数据库中水稻细菌性条斑病菌相应基因的同源性高达99.8％以上(见图2)。
40.基于菌落、菌体形态及分子鉴定结果，可以确定xz45属于水稻细菌性条斑病菌(xanthomonas oryzae pv.oryzicola)。该菌株已于2021年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为cgmcc no.21877。
41.实施例2：噬菌体指示菌液的制备
42.将
‑
80℃甘油保存的指示菌株rs105、xoc
‑
192、xoc
‑
197、xz45、xoc
‑
s、xoc
‑
m、xoc
‑
w划线接种到na固体培养基平皿上，28℃
‑
30℃条件下培养36
‑
48h；挑取一个单菌落接种到nb液体培养基中，28℃、180r/min条件下培养36h；将培养液以1％(v/v)转接到新鲜nb液体培养基中，28℃、180r/min条件下培养18
‑
24h；利用无菌水将菌体浓度调整到5.0
×
108‑
1.2
×
109cfu/ml，作为指示菌液。
43.实施例3：广亲和性指示菌株的筛选
44.实验室从江苏不同区域分离保存了17株水稻细菌性条斑病菌噬菌体甘油保存，株系编号如表1所示(申请人承诺向公众永久开放保存样品)，将前期甘油保存于
‑
80℃的噬菌体株系分别吸取10μl加入到新鲜培养的10ml rs105菌液中，28℃、180r/min条件下培养24
‑
36h；12000r/min、室温条件下离心3min，取上清，利用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，利用无菌水梯度稀释备用。分别将每种梯度稀释的噬菌体液1.0ml和实施例2的每种指示菌液1.0ml加入到一次性无菌培养皿中，混匀；然后加入冷却到40℃
‑
45℃的液态na培养基10
‑
12ml，迅速混匀，凝固后在28℃条件下倒置培养10
‑
16h，调查噬菌斑个数，统计分析各指示菌对不同来源噬菌体的敏感性。结果见表1，指示菌xz45对17个噬菌体株系的综合检测灵敏度最高，测定的噬菌体滴度在(4.1
×
10
10
‑
2.7
×
10
11
)pfu/ml之间，培养14h时的噬菌斑透明清晰，各噬菌株系形成的噬菌斑平均直径2.9mm
‑
3.8mm；其它6个指示菌株测定的噬菌体滴度在(1.4
×
108‑
9.3
×
10
10
)pfu/ml之间，产生的噬菌斑直径在1.7mm
‑
3.2mm之间。这些结果表明，本发明所述的xz45指示菌对不同的噬菌体具有广泛亲和性和较高的灵敏度，形成的噬菌斑清晰透明，便于计数统计。后续实施例选用xz45作为检测水稻细菌性条斑病菌噬菌体的指示菌株。
45.表1不同指示菌株对水稻细菌性条斑病菌噬菌体的检测灵敏度
[0046][0047]
实施例4：利用指示菌株xz45检测不同区域发病田块田水中的噬菌体密度
[0048]
在水稻抽穗期，分别在江苏省宿迁市、淮安市的21个发生水稻细菌性条斑病的田块采集田水并调查病情指数，每个田块随机选5个点进行调查和取样，利用150ml无菌塑料瓶每点取水样20ml，共计100ml，分别编号s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12，放置于低温(2℃
‑
8℃)保存盒内带回实验室。同时调查取样田块5个点的水稻细菌性条斑病病情指数，病害分级及调查方法如下：
[0049]
取样田块采用对角线5点取样的方法，每点调查20丛，共100丛。
[0050]
病叶分级标准如下：
[0051]
0级：叶片无病斑；
[0052]
1级：叶片仅有小点半透明水渍状病斑，占叶面积的1％以下；
[0053]
3级：叶片有零星短而窄条病斑，占叶面积的1％
‑
5％；
[0054]
5级：叶片病斑较多，占叶面积6％
‑
25％；
[0055]
7级：叶片上病斑较密，占叶面积26％
‑
50％；
[0056]
9级：叶片病斑密布，占叶面积51％以上，叶片变橙褐色、卷曲、枯死。
[0057]
病情指数计算方法：
[0058][0059]
利用0.22μm细菌过滤器将采集的田水过滤除菌，利用灭菌水5倍梯度稀释。活化水稻细菌性条斑病菌xz45，按照上述“实施例2”中描述的方法制备噬菌体指示菌液。分别将1ml样品梯度稀释液和1ml新鲜指示菌液添加到无菌培养皿中，混匀；然后加入40℃
‑
45℃的液态na培养基10
‑
12ml，迅速混匀，凝固后在28℃条件下倒置培养12
‑
16h，调查噬菌斑个数，统计田水中的噬菌体密度。结果发现，21个发病田块的病情指数为0.8
‑
35.8，所有田块的田
水中均检出噬菌体，且噬菌密度达到870
‑
129000pfu/ml，噬菌体的数量与调查田块的病情指数基本呈正相关，如图3、图4所示。上述结果也再次表明指示菌株xz45具有广泛的噬菌体亲和性，且形成的噬菌斑较大，易于调查。
[0060]
实施例5：利用噬菌体预测大田水稻细菌性条斑病的发生期
[0061]
在江苏省盱眙县马坝镇、穆店镇和泗阳县张家圩镇，选择3个具有水稻细菌性条斑病发病史的杂交籼稻种植田块，品种分别为c两优998、y两优1998、徽两优898，6月10
‑
15日移栽。自6月25开始调查水稻细菌性条斑病发生情况和田水中噬菌体密度，按照上述“实施例4”的方法进行调查和采样，间隔5
‑
7天取样1次。将取得样品迅速转移到低温(2℃
‑
8℃)样品箱内。将采集的田水样品利用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，利用灭菌水将无菌滤液进行5倍梯度稀释。活化水稻细菌性条斑病菌xz45，按照上述“实施例2”中描述的方法制备噬菌体指示菌液。分别将1ml样品梯度稀释液和1ml新鲜的指示菌液添加到无菌培养皿中，混匀；然后加入40℃
‑
45℃的液态na培养基10
‑
12ml，迅速混匀，凝固后在28℃条件下倒置培养12
‑
16h；调查噬菌斑个数，统计田水中的噬菌体密度。调查期间，水稻处于分蘖期；7月9日后的14天，日最高气温处于25℃
‑
35℃的天数为13
‑
14天，降雨天数为7
‑
12天。7月9日调查，结果发现，三块田的噬菌体密度分别达到184pfu/ml、226pfu/ml、279pfu/ml，进入急增期，分别在达到上述密度后的第10天、第7天和第12天发病，符合噬菌体进入急增期后7
‑
14天水稻细菌性条斑病发生的预测结果。具体见表2：
[0062]
表2水稻田水中噬菌体动态及水稻细菌性条斑病发生时期
[0063][0064]
实施例6：利用噬菌体预测大田水稻细菌性条斑病的发生期
[0065]
在盱眙县马坝镇、穆店镇、官滩镇、泗阳县张家圩镇，选择8个具有水稻细菌性条斑病发病史的杂交籼稻种植田块，移栽栽培。自8月6日开始调查田水中噬菌体密度，预测水稻细菌性条斑病发生时期，同时调查水稻细菌性条斑病初始发病时间。按照上述“实施例4”的方法进行调查和采样，间隔5
‑
7天取样1次，将取得样品迅速转移到低温(2
‑
8℃)样品箱内。将采集的田水样品利用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，利用灭菌水进行5倍梯度稀释。活化水稻细菌性条斑病菌xz45，按照上述“实施例2”中描述的方法制备噬菌体指示菌液。分别将1ml样品梯度稀释液和1ml新鲜的指示菌液添加到无菌培养皿(直径9cm)中，混匀；然后加入40℃
‑
45℃的液态na培养基10
‑
12ml，迅速混匀，凝固后在28℃条件下倒置培养12
‑
16h，调查噬菌斑个数，统计田水中的噬菌体密度。调查期间，水稻处于孕穗至抽穗扬花期。8月6日至8月20日期间，35℃以上高温或多云晴朗日数累计8
‑
11天，降雨日数3—5天；8月20日至9月3日，日最高气温处于25℃
‑
35℃的天数为13
‑
14天，降雨日数为7
‑
9天，且露水较重。结果发现，1号、2号、3号、5号和7号块田的噬菌体密度分别达到167pfu/ml、203pfu/ml、350pfu/ml、281pfu/ml、413pfu/ml后进入急增期，进入急增期后第4
‑
8天各田块陆续发生水稻细菌性条
斑病。8月6日，栽培c两优0861的6号田块田水噬菌体密度为277pfu/ml，达到噬菌体急增期标准，但是第16天才发生水稻细菌性条斑病，原因是8月20日之前的高温少雨天气延迟了病害发生。调查期间，4号和8号田块的最高噬菌体密度分别为67pfu/ml和121pfu/ml，未达到噬菌体急增期标准；截止乳熟期，这两块田均未发生水稻细菌性条斑病。水稻抽穗扬花期，如果天气满足本发明的条件水稻细菌性条斑病的发生，且噬菌体数量达到150pfu/ml急增期后4
‑
10天内病害将发生，高温、干旱延迟病害发生。上述田间调查结果与本发明内容所述结果相一致。具体见下表3：
[0066]
表3水稻田水中噬菌体动态及水稻细菌性条斑病发生时期
[0067]