用于降磷的益生菌、其制备方法及其用途与流程

1.本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及用于降磷的益生菌、其制备方法及其用途。


背景技术：

2.维持性血液透析患者高磷血症具有发病率高、达标率低的特点。持续高磷血症导致患者心血管事件显著增加，因此这是世界各地肾脏病工作者面临的问题。
3.目前的降磷方案及存在的问题包括：
4.(1)含钙磷结合剂，比如碳酸钙、醋酸钙等，这种方案存在高血钙、血管钙化等问题；
5.(2)重金属结合剂，比如碳酸镧等，这种方案存在重金属累积的问题；
6.而且上述的现有降磷方案效果欠佳，有必要探索新的降磷方法。
7.部分野生聚磷菌具有超量吸磷的特性，这种细菌可以吸收环境中多余的磷，并将其储存在体内，从而降低环境磷水平,而且微生物降磷不存在高钙血症、血管钙化及其他重金属蓄积等问题。但是，这些聚磷菌均为致病菌，人体无法使用，更无法用于维持性血液透析患者高磷血症降磷。


技术实现要素：

8.本发明的目的之一，就在于提供一种用于人体体内降磷的益生菌，以解决上述问题。
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种用于降磷的益生菌，是以益生菌大肠杆菌nissle 1917为宿主细胞，并导入宿主自身的多聚磷酸盐激酶ppk1和重组质粒pet
‑
28a( )。
10.本发明的降磷益生菌，通过基因测序，并翻译成如下的seq id no.5所示的氨基酸序列：
11.‑
fnrlnfple
‑
fcltlrrrytmgsshhhhhhssglvprgshmmgqeklyiekelswlsfnervlqeaadksnpliermrflgiysnnldefykvrfaelkrriiiseeqgsnshsrhllgkiqsrvlkadqefdglynelllemarnqiflinerqlsvnqqnwlrhyfkqylrqhitpilinpdtdlvqflkddytylaveiirgdtiryalleipsdkvprfvnlppeaprrrkpmilldnilryclddifkgffdydalnaysmkmtrdaeydlvhemeaslmelmssslkqrltaepvrfvyqrdmpnalvevlrekltisrydsivpggryhnfkdfinfpnvgkanlvnkplprlrhiwfdkaqfrngfdairerdvllyypyhtfehvlellrqasfdpsvlaikiniyrvakdsriidsmihaahngkkvtvvvelqarfdeeanihwakrlteagvhvifsapglkihaklflisrkengevvryahigtgnfnektarlytdyslltadaritnevrrvfnfienpyrpvtfdylmvspqnsrrllyemvdreianaqqglpsgitlklnnlvdkglvdrlyaasssgvpvnllvrgmcslipnlegisdniraisivdrylehdrvyifenggdkkvylssadwmtrnidyrievatplldprlkqrvldiidilfsdtvkaryidkelsnryvprgnrrkvraqlaiydyiksleqpe
‑
lehhhhhh
‑
dpaankarkeasp
12.本发明是把大肠杆菌nissle 1917的ppk1基因转染商业质粒载体pet
‑
28a( )上，
通过电转的方式，转到大肠杆菌细胞里面，通过转染至大肠杆菌内目标质粒上的阿拉伯启动子，就能不断表达ppk1基因，并不改变益生菌大肠杆菌nissle 1917本身的基因序列。
13.本发明的目的之二，在于提供一种上述的用于降磷的益生菌的制备方法，采用的技术方案为，包括下述步骤：
14.(1)质粒构建：利用采自益生菌大肠杆菌nissle 1917的ppk1基因和一个阿拉伯糖启动子分别独立构建中拷贝载体psb3c5和低拷贝载体psb4c5，分别命名为psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk，具体方法：
15.(a)将商业质粒pet
‑
28a( )与ppk1基因连接在nde i和xho i的限制性内切酶位点上，得到pet
‑
28a
‑
ppk；
16.(b)用引物对pet
‑
28a
‑
ppk进行另一轮pcr，得到保留his标签、ppk1并引入新的xba i和pst i限制性内切酶位点的pcr产物，得到psb3c5
‑
ppk及psb4c5
‑
ppk；
17.(2)质粒转化：将步骤(1)所得的psb3c5
‑
ppk及psb4c5
‑
ppk向宿主细胞益生菌大肠杆菌nissle 1917转化，得到益生菌为ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk。
18.其中，质粒系统存在高、中、低拷贝系统。拷贝数的不同，会导致质粒复制量的不同，并最终导致目的蛋白表达量的不同；但质粒复制量、目的蛋白的表达量，可能会影响菌体自身生长发育，因此需要平衡质粒表达与菌体自身生长发育，即寻找质粒表达和菌体自身生长发育的最佳组合。发明人通过试验证实：转染高拷贝质粒系统的菌体并无法存活，可能是目的基因的过度表达，影响了菌体自身生长发育，导致菌体死亡。
19.作为优选的技术方案：步骤(b)中，引物为两对。
20.作为进一步优选的技术方案：所述引物序列为：
21.seq id no.1正向引物ggaattccatatgatgggtcaggaaaagctataca
22.seq id no.2反向引物ccgctcgagttattcagattgttcgagtgatt
23.seq id no.3正向引物gctctagatgggcagcagccatcatcat
24.seq id no.4反向引物
25.aactgcagcggccgctactagtattattcaggttgttcgagtgatttgatgtagt。
26.作为优选的技术方案：步骤(2)中，转化的具体步骤为：
27.(a)单个ecn菌落在lb培养基中培养作为预培养；
28.(b)ecn感受态细胞的制备方法为:将预培养接种到培养基中；
29.(c)调整细胞培养液od600，冰浴,离心15min；
30.(d)收集的细胞在冰水浴中浸泡，离心收集；
31.(e)细胞悬浮液加入1ul甘油；
32.(f)转化过程中，感受态细胞分别与psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk质粒混合，混合物在冰浴中孵育；
33.(g)然后，电击混合物，并立即加入soc介质，摇晃恢复细胞；
34.(h)最后，将细胞分散在添加氯霉素的lb平板上，孵育；
35.(i)获得的psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk质粒分别命名为ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk。
36.作为优选的技术方案：步骤(2)之后，还对所得的益生菌进行固定化。
37.作为进一步优选的技术方案：所述固定化的方法为生物3d打印。
38.作为更进一步优选的技术方案：，所述生物3d打印以海藻酸钠和明胶为生物墨水。
39.本发明基于合成生物学技术，制备得到两个多聚磷酸盐激酶(ppk1)过表达基因质粒，并以益生菌大肠杆菌nissle 1917为宿主细胞，改造成功了两株具有超滤吸收磷且可用于人体的益生菌。进一步通过固定化生物工程的3d打印技术，将改造后的益生菌工程菌进行固定化，可进一步提高降磷水平，且可重复使用。
40.本发明的目的之三，在于提供上述的用于降磷的益生菌在制备用于人体体内降磷的制剂中的应用。
41.作为优选的技术方案：用于维持性血液透析患者高磷血症的降磷制剂。
42.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的益生菌具有超滤吸收磷的作用，可用于体内降磷作用，相对于现有的降磷方法，不会额外增加血钙含量，不会引起高钙血症和血钙钙化，也没有重金属摄入，不会造成体内重金属累积。
附图说明
43.图1为实施例制备益生菌的的流程图；
44.图中，xo为xho
‑
i；xa为xho
‑
i；f为primer2f；r为primer2r；p为pst i；s为spe i；e为ecor i；arac为l
‑
阿拉伯糖调节蛋白；
45.图2为实施例中制得的质粒psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk的电泳图，其中，1为psb3c5
‑
ppk，2为psb4c5
‑
ppk；
46.图3为实施例中ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk的生长曲线图；
47.图4为ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk底物溶液中的磷浓度变化图；
48.图5为实施例的3d打印系统；
49.图6为3d打印后的扫描电镜图；
50.图7为细菌生物学的3d打印实物图像；
51.图8为3d打印细菌除磷能力图；
52.图9为3d打印生物细菌的回收和再利用实验结果。
具体实施方式
53.下面将结合附图对本发明作进一步说明。
54.质粒与菌株和材料
55.以大肠杆菌nissle 1917(ecn)和空载质粒psb3c5、psb4c5为材料；
56.大肠杆菌dh5α感受态细胞购买自武汉生工生物；
57.稳定的纯细菌基因组dna提取试剂盒购自湖南艾特生物有限公司；
58.凝胶提取试剂盒和质粒迷你试剂盒购自美国omega bio
‑
tek公司；
59.所有的quickcut限制性内切酶均来自中国大连的takara公司；
60.其他试剂采购国药化学试剂有限公司。
61.实施例1
62.一种用于降磷的益生菌的制备方法，参见图1，包括下述步骤：
63.1.质粒构建：
64.ppk1基因采自ecn基因组(genbank:cp007799.1)，得到ppk1基因的方法为：提取大
肠杆菌nissle 1917(ecn)总dna，然后对其进行pcr扩增，得到ppk1基因；然后，利用ppk1基因和一个阿拉伯糖启动子分别独立构建拷贝数为10
‑
50的低拷贝载体psb3c5和拷贝数为50
‑
100的中拷贝载体psb4c5，分别命名为psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk，具体方法为：
65.(1)克隆ppk1：通过引物1f和引物1r从益生菌大肠杆菌nissle 1917中克隆ppk1基因(本来的大肠杆菌nissle 1917中也有这个基因，但表达量很低，并不表现出降磷作用，通过克隆后连接到特定的质粒上，通过质粒上的启动子，就能高表达)
66.表1：pcr反应体系
[0067][0068]
表2：pcr反应条件
[0069][0070]
通过上述pcr，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物后，切去正确的目的基因的条带，用胶回收试剂盒来回收目的片段，得到目的基因ppk1；
[0071]
(2)用ndeⅰ和xhoi酶对回收的产物(ppk1)进行双酶切，再跑胶回收得到ppk1骨架；
[0072]
同时用ndeⅰ和xhoi酶对商业质粒pet
‑
28a( )进行双酶切，跑胶回收得到质粒骨架；
[0073]
将回收后的ppk1和质粒骨架进行连接，相当于用上述酶做一个连接位点，使得两者相连，得到pet
‑
28a
‑
ppk；
[0074]
上述双酶切和连接的条件见表3和表4。
[0075]
表3：双酶切反应条件
[0076][0077]
表4连接条件
[0078][0079]
(3)再用引物2f、2r对pet
‑
28a
‑
ppk进行pcr(pcr条件同第一次pcr，即如表2所示)，得到保留his标签、ppk1并引入新的xba i和pst i限制性内切酶位点的pcr产物，得到psb3c5
‑
ppk及psb4c5
‑
ppk。
[0080]
所得的质粒电泳图如图2所示，所使用的引物序列见表5。
[0081]
表5质粒构建时所使用的引物序列
[0082]
geneprimer 1fggaattccatatgatgggtcaggaaaagctatacaprimer 1rccgctcgagttattcagattgttcgagtgattprimer 2fgctctagatgggcagcagccatcatcatprimer 2raactgcagcggccgctactagtattattcaggttgttcgagtgatttgatgtagt.
[0083]
需要说明的是，对于启动子的选择，发明人尝试采用半乳糖启动子，但菌株无法存活。
[0084]
2.质粒向ecn转化，具体步骤为：
[0085]
(1)菌种活化
[0086]
从
‑
80℃取出冻存的菌种(益生菌大肠杆菌nissle 1917)，放置在冰上，使用无菌的中枪头蘸取菌种并于对应抗性平板上划线(此处由于是野生型菌种，故使用无抗性平板)，将平板放置在37℃培养箱过夜培养。挑取生长旺盛且单独生长的单菌落，接种于装有2ml培养基的无菌培养管中，37℃、200rpm摇菌过夜培养；
[0087]
(2)感受态的制备
[0088]
将过夜培养的菌液取出，重新转接到20ml新鲜培养基中，37℃、200rpm摇菌2
‑
3h，待菌液od600达到0.4时停止培养，将菌液、无菌去离子水和10％甘油放置于冰上15min，将菌液转移到15ml无菌离心管中，4℃，5000g离心15min。小心吸弃上清，用预冷的无菌去离子水重悬菌团。充分重悬后，4℃，5000g离心15min，小心吸弃上清；重复以上洗涤步骤一次，小心吸弃上清。再以3
‑
5ml冰的10％甘油重悬菌团，同上条件离心，吸弃上清，再以每10ml菌液对应100μl 10％甘油的比例重悬菌体，放置于冰上；完成感受态的制备；
[0089]
(3)电转化
[0090]
将电转杯和需转化的质粒提前放到冰上冰浴，将质粒与感受态细胞混合后入电转杯冰浴10min。然后将电转杯放入电转仪，1800v电击；取出电转杯，迅速加入900μl培养基，并轻揉吹打，使电转杯凹槽中的菌液与新加入的培养基混匀。吸取电转杯中的菌液，于无菌1.5ml ep管中，37℃、200rpm复苏摇菌1h。然后取出菌液，以100μl菌液涂布平板，放入37℃培养箱过夜培养。
[0091]
(4)挑取阳性菌落
[0092]
取出平板，挑取单克隆菌落，于抗性培养基和适宜温度37℃下摇菌培养并保种，获
得的psb3c5
‑
ppk和psb4c5
‑
ppk质粒分别命名为ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
–
ppk。
[0093]
3.培养ecn
[0094]
(1)将野生型ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk在37℃含氯霉素的lb培养基中培养12h；
[0095]
(2)本研究采用人工肠液(无菌)(购自福州飞净生物科技有限公司，品牌：phygene，型号：ph1841)(磷溶度为15mg p/l)对构建的菌株进行评价；
[0096]
(3)将改造后的ecn(1ml)接种到人工肠液中，在37℃的旋转摇床上以200rpm摇动；
[0097]
(4)分别在不同时间点取1ml液体样本，进行磷水平检测。
[0098]
实施例2
[0099]
生物3d打印，步骤为：
[0100]
(1)该生物3d打印油墨由jiang等人制备。油墨由1.0g海藻酸钠、0.5g明胶和10ml去离子水组成(参见jiang,w.,pei,r.,zhou,s.
‑
f.,2020.3d
‑
printed xylanase within biocompatible polymers as excellent catalyst for lignocellulose degradation.chemical engineering journal 400,125920.https://doi.org/10.1016/j.cej.2020.125920)；
[0101]
(2)油墨在60℃的水浴中沉淀直到完全溶解；
[0102]
(3)在lb培养基中37℃培养过夜后，将野生型ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk细胞离心(7000rpm，5min)，用hepes缓冲液(20mm,ph 7.0)洗涤2次；
[0103]
(4)在生物3d打印之前，用hepes缓冲液(20mm,ph 7.0)，稀释至od600为1.0，然后将1ml细胞混合在溶解的墨水中(10ml)；
[0104]
(5)生物3d打印的参数设置为0.34mm,0.4mpa压力；
[0105]
(6)将3d打印的ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk滴入氯化钙溶液，交联固化5min，用去离子水冲洗掉表面残留的氯化钙；
[0106]
(7)获得3d打印后的ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk，用于后续实验。
[0107]
实施例3
[0108]
1.生物3d打印ecn除磷试验
[0109]
(1)将生物3d打印ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk放入20ml含有15mg p/l的人工肠液中，放入50ml生物反应器中；
[0110]
(2)生物反应器置于37℃的培养箱中，不同时间点取1ml液体样本，进行磷水平检测。
[0111]
2.分析方法
[0112]
(1)采用gb 11893
‑
1989总磷的测定
‑‑
钼酸铵分光光度法进行总磷测定；
[0113]
(2)采用扫描电镜(sem,zeiss)对3d打印ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk的形貌进行了表征，扫描电压设置为5kv；
[0114]
(3)所有结果以均数
±
标准差表示,用于统计分析的软件是graphpad prism 8.0(san diego,ca,usa)，方差分析(anova)用于评估组间的偏差，给出p值，p值<0.05为显著性差异。
[0115]
3.ecn
‑
ppk生长情况及除磷能力
[0116]
(1)首先研究了ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk在底物溶液中的生长情况：如图4所
示，ecn、ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk在48小时内生长迅速，证明改造的工程菌成功；
[0117]
(2)初始底物溶液磷溶度为15mg/l，结果发现野生型ecn没有除磷能力如图5所示；底物溶液上层清液少量的磷减少(1.23
±
0.12mg/l)可以归因于细胞生长；
[0118]
(3)ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk的磷浓度在48h内持续下降，ecn
‑
3c5
‑
ppk在60h时磷去除率最高(4.57
±
0.09mg/l)，而ecn
‑
4c5
‑
ppk在48h时磷去除率最高(5.32
±
0.18mg/l)。
[0119]
4.细菌生物3d打印
[0120]
(1)游离细菌很容易受到外界条件的影响，细胞很容易在外部处理应用中丢失。
[0121]
固定化细菌可以提高细菌的稳定性，并能高效地实现高细胞密度。与传统固定化细菌技术相比，生物3d打印技术具有成本低、效率高、速度快等优点。生物墨水固定化的细菌可以保持代谢活性。如图5
‑
7所示，以海藻酸钠和明胶为生物墨水，将细菌打印成长40mm，宽30mm，厚3.0mm的片状结构；
[0122]
(2)此外，我们通过图7所示的扫描电镜观察了3d打印细菌的形态。可以观察到，细菌已经包埋在海藻酸钙载体中形成复合物，说明固定化细菌相对稳定，不易脱落，有利于除磷的应用。
[0123]
5.3d打印细菌除磷能力
[0124]
(1)采用50ml生物反应器，添加25ml底物溶液，研究3d打印细菌对磷的去除能力；
[0125]
(2)结果如图8所示，野生型的ecn血磷无明显下降；改造后3d打印的ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk有明显降磷作用；即，3d打印野生型ecn仍不具有除磷能力，底物溶液的磷浓度仅略有下降。降低的磷可以用于细菌生长，说明3d打印固定化细菌不影响细菌生长和代谢；
[0126]
(3)游离菌去除磷的结果与3d打印菌去除pi的结果不同，3d打印ecn
‑
3c5
‑
ppk在第72小时磷清除量最高7.30
±
0.40mg/l,显著高于游离菌的4.57
±
0.09；3d打印ecn
‑
4c5
‑
ppk在第72小时磷清除量最高8.11
±
0.20mg/l,也明显高于游离菌的5.32
±
0.18mg/l。结果表明，3d打印ecn
‑
3c5
‑
ppk和ecn
‑
4c5
‑
ppk保持了去除磷的能力，甚至提高了去除磷的能力；
[0127]
(4)3d打印细菌的可重复使用性是影响其除磷应用的重要因素，因此，本技术研究了3d打印细菌的可重复使用性；
[0128]
(5)第一次去除磷后，用lb发酵液替换反应器中的底物溶液，在37℃孵育24h后，用20mm hepes清洗3d打印细菌2次，然后在生物反应器中加入25ml底物溶液，测试重复使用的降磷效果；
[0129]
(6)如图9所示，我们发现随着循环次数的增加，3d打印菌对磷的去除性能逐渐降低。
[0130]
(7)在第三个循环中，3d打印细菌的除磷能力仅为第一次的50％。这些结果表明，3d打印细菌可以重复使用至少3次。
[0131]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。