一种微流控芯片及其在肿瘤干细胞分选、富集中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医学及肿瘤细胞研究领域，具体涉及一种微流控芯片及其在肿瘤干细胞分选、富集中的应用。


背景技术：

2.肿瘤干细胞是肿瘤群体中极少量异质性特征突出，但是能够决定肿瘤特性和命运的细胞。肿瘤干细胞的特性包括：无限的体内和体外增殖能力、定向分化能力以及对于理化伤害的强耐受能力。大量研究结果证实肿瘤干细胞不仅是引起肿瘤的原因，也是造成肿瘤转移、复发和治疗耐受的直接原因。因此，针对肿瘤干细胞的治疗有望根治肿瘤。由于个体差异、肿瘤类型差异以及肿瘤细胞信号通路差异，肿瘤干细胞的性质会有所不同，因而肿瘤干细胞的靶向治疗策略也会有所不同，因此，基于肿瘤干细胞的分子机制研究和药物测试是肿瘤干细胞靶向治疗必不可少的环节。
3.由于肿瘤干细胞数量稀少，因而肿瘤干细胞的分子机制研究和药物测试依赖于肿瘤干细胞分选和富集。近年来发展了一系列的肿瘤干细胞分离/富集技术，如流式细胞分析技术，主要是基肿瘤干细胞表面分子标志物进行分离，其原理是肿瘤干细胞具有特殊的表面标志物，例如乳腺癌干细胞表面标志物为lin
‑
cd44 /cd24
‑
；脑胶质细胞瘤干细胞表面标志物为cd133 ；结肠癌干细胞表面标志物为cd133 、cd44 、cd166 、epcam ；胰腺癌干细胞表面标志物为cd44 、cd24 、esa 等。然而，由于细胞表面标志物的表达存在异质性和可塑性，这类方法存在可靠性和普适性欠佳的问题。此外，流式细胞分析对细胞本身的化学和生物性质有一定的影响，不利于后续的分析。
4.基于上述流式细胞仪存在的可靠性和普适性欠佳的问题，通过依赖肿瘤干细胞的自我更新能力进行富集，有助于克服上述普适性欠佳的问题，但如何从肿瘤细胞中将肿瘤干细胞进行分选，限制了依赖肿瘤干细胞自我更新能力进行富集这一方法的应用。
5.目前，传统的体外单细胞试验需要利用有限稀释法进行细胞分散，这种细胞分散方法所能提供的单个细胞获取效率和分析通量存在明显的限制，远远不能满足肿瘤干细胞富集的需求，并且，该种方法无法排除细胞间的接触和信息交流，细胞聚集体的形成并不能有效反映肿瘤干细胞的数量，因此，为实现高效的肿瘤干细胞富集，迫切需要一种可完成高通量单细胞克隆形成试验的技术平台。


技术实现要素：

6.针对现有肿瘤干细胞分选和富集方法存在的数量有限、可靠性以及普适性欠佳的问题，本技术旨在提供一种具有良好普适性的微流控芯片，并基于该微流控芯片提供一种肿瘤干细胞分选、富集的方法，具有良好的普适性，并能有效保持肿瘤干细胞的干性以及提高富集后肿瘤干细胞的数量。
7.基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供一种微流控芯片，包括底层和顶层，底层上铺设有液滴发生
器，液滴发生器上设有油相注入孔、水相注入孔以及液滴池；顶层开设有与油相注入孔相连通的油相分配通道、与水相注入孔相连通的水相分配通道、以及与液滴池相连通的排液通道。
9.前期研究发现，肿瘤细胞群体中有少量细胞具有克隆形成能力，基于该发现，发明人所在研究团队通过控制肿瘤细胞的培养条件，对肿瘤细胞进行成球试验，成功地分选出具有单细胞克隆形成能力的肿瘤干细胞，并将这部分具有自我更新能力进行富集，实现肿瘤干细胞扩增并维持肿瘤干细胞的多向分化潜能，因此，本技术在肿瘤细胞成球试验的基础上，设计出一种微流控芯片。
10.本发明设计的微流控芯片借助油相分配通道、水相分配通道分别向液滴发生器的油相注入孔、水相注入孔通入相应的油相和含有肿瘤细胞的水相，利用油相和水相在液滴发生器中交汇产生单细胞液滴，并汇集于液滴池，液滴池的单细胞液滴经排液通道排出，实现对肿瘤干细胞的分选。
11.本发明设计的微流控芯片不依赖于肿瘤干细胞表面的标志物，便能够实现对肿瘤细胞中具有克隆形成能力的肿瘤干细胞进行分选，具有极大的普适性。
12.进一步地，液滴发生器的数量为多个，均并排铺设于底层上。
13.本发明微流控芯片采用多个液滴发生器并排设置，能够实现多个液滴发生器同时进行单细胞液滴形成，提高单细胞液滴的数量，实现肿瘤细胞悬浮液的高通量分散。
14.进一步地，底层上还开设有与液滴发生器的液滴池相连通的液滴储存池；微流控芯片还包括设于底层和顶层之间的中间层；中间层开设有与液滴储存池相配合的捕获微池阵列；中间层还开设有连通顶层各分配通道与底层相应注入孔的通孔。
15.本发明在前述微流控芯片的基础上作了进一步改进，在底层增加了与液滴池相连通的液滴储存池，在中间中间层上增加了与液滴储存池相配合的捕获微池阵列。利用捕获微池阵列将液滴储存池中的单细胞液滴进行捕获，将单细胞液滴临时固定于捕获微池阵列中，在向微流控芯片中通入干细胞培养基时，在单细胞悬浮培养条件下，单细胞液滴中的肿瘤干细胞能够依据自我更新能力进行克隆形成肿瘤球，非肿瘤干细胞因失巢凋亡，实现高效的肿瘤干细胞的富集。一方面解决了现有细胞分散方法存在的单个细胞获取效率和分析通量低的问题；另一方面，基于具备自我更新能力的肿瘤干细胞才能形成肿瘤细胞球，而分化的肿瘤细胞则会逐渐死亡的原理，对肿瘤干细胞进行培养分选、富集，不仅具有高通量的优势，还能够有效维持富集的肿瘤干细胞。
16.进一步地，所述液滴发生器包括与油相注入孔相连通的油相通道和与水相注入孔相连通的水相通道，所述油相通道与水相通道交汇处与液滴池相连通。
17.液滴发生器包括交汇设置的油相通道和水相通道，在油相通道和水相通道中分别通入油相以及分散有肿瘤细胞的水相时，油相与水相在两相交汇处产生单细胞液滴，产生的单细胞液滴流入液滴池。
18.进一步地，在油相通道与水相通道交汇处，油相通道和水相通道的内径均变窄并分别形成油相微通道和水相微通道，油相微通道和水相微通道的内径均为10～100μm。
19.通过控制液滴发生器中油相微通道与水相微通道的内径，一方面根据不同的肿瘤细胞设置不同的内径，具有良好的普适性，另一方面，有助于控制所形成的肿瘤细胞液滴的大小，在后续对单细胞液滴进行培养扩增过程中，有效避免细胞间的接触信息交流，使得扩
增后的肿瘤细胞球更为充分地增加肿瘤干细胞的数量。
20.进一步地，捕获微池阵列由多个在中间层底部呈阵列设置的微池组成，所述微池的开口端置于液滴储存池内，微池的内径为75～100μm，高度为100～200μm。
21.微池类似于盲孔，捕获微池阵列通过阵列设置的微池对液滴储存池中的单细胞液滴进行捕获，微池的内径及高度根据不同的液滴大小进行设置，满足不同大小的液滴的捕获。
22.进一步地，微池的径向截面可以为多边形、圆形、椭圆形等，微池呈中空的圆柱体、多边体、锥体等，可以为多种不同形状的内部中空结构。
23.进一步地，中间层上的通孔包括油相通孔、水相通孔和液滴通孔；当底层、中间层和顶层上下对应重叠封接时，顶层上的油相分配通道通过油相通孔与液滴发生器的油相注入孔相连通；水相分配通道通过水相通孔与液滴发生器的水相注入孔相连通；排液通道通过液滴通孔与液滴发生器的液滴池相连通。
24.进一步地，中间层的厚度为100～500μm，即油相通孔、水相通孔、液滴通孔的高度为100～500μm；油相通孔、水相通孔、液滴通孔的内径为100～500μm。
25.进一步地，液滴汇集池中还设有支柱，用于对中间层进行支撑，尤其是对捕获微池阵列进行支撑，防止其塌陷。
26.第二方面，本发明提供了基于上述微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集的方法，包括如下步骤：
27.(1)单细胞分散：利用权利要求1或2所述微流控芯片将肿瘤细胞悬浮液分散为单细胞液滴；
28.(2)细胞培养：将单细胞液滴于水凝胶体系中进行3d扩增培养，形成肿瘤细胞球的水凝胶液滴；
29.(3)细胞回收：将肿瘤细胞球的水凝胶液滴进行溶胶处理，释放肿瘤干细胞并回收。
30.进一步地，步骤(2)和步骤(3)的细胞培养、细胞回收过程在第二种微流控芯片中进行或者在培养基中进行。
31.本发明提供了两种最基本的微流控芯片，第一种微流控芯片利用与液滴发生器连通的油相分配通道、水相分配通道和排液通道，通过向液滴发生器中通入含肿瘤细胞的水相和油相，实现肿瘤细胞的单细胞液滴形成，并经排液通道进行收集；结合芯片外培养方法，对单细胞液滴于干细胞培养基上进行培养扩增，实现对肿瘤干细胞的分选、富集；第二种微流控芯片在第一种微流控芯片的基础上，增加了液滴储存池和捕获微池阵列，捕获微池阵列对单细胞液滴进行捕获后，通过向微流控芯片中通入干细胞培养基，对单细胞液滴中的干细胞进行扩增培养及回收，在微流控芯片中实现肿瘤干细胞的分选、富集。
32.进一步地，利用前述两种微流控芯片进行单细胞分散的具体过程为：向水相分配通道中通入分散有肿瘤细胞的水相并流动至液滴发生器的水相注入孔，涌入水相通道；向油相分配通道中通入酸化的油相并流动至液滴发生器的油相注入孔，并涌入油相通道；涌入水相微通道、油相微通道的水相与酸化的油相，于两相交汇处形成液滴，并汇集于液滴池，完成单细胞分散过程。
33.进一步地，在单细胞分散过程中，水相的通入速率为1～20μl/min；酸化的油相的
通入速率为5～60μl/min，通过控制水相、油相的通入流速，以实现在芯片的液滴池、液滴储存池中形成单细胞液滴，稳定地进行单细胞分散。
34.进一步地，利用第二种微流控芯片进行单细胞培养的具体过程为：液滴池的单细胞液滴汇入液滴储存池，并被捕获微池阵列捕获，向油相分配通道中通入酸化的油相，使捕获微池阵列内的单细胞液滴呈凝胶状，被固定于捕获微池阵列内；随后向油相分配通道中通入干细胞培养基，干细胞培养基流动至液滴储存池中，对捕获微池阵列中单细胞液滴中的肿瘤细胞进行悬浮扩增培养，形成肿瘤细胞球的水凝胶液滴。
35.进一步地，利用第二种微流控芯片进行细胞回收的具体过程为：向油相分配通道中通入溶胶液，溶胶液经依次流入油相注入孔、液滴池、液滴储存池中，并于对应的捕获微池阵列中将呈凝胶状的肿瘤细胞球的水凝胶液滴进行解聚恢复流动性，停止通入溶胶液；随后向油相分配通道中通入干细胞培养基，解聚后的肿瘤细胞随流动的干细胞培养基流入排液通道，并收集肿瘤干细胞悬液。
36.本发明在前述微流控芯片的基础上，通过向油相分配通道、水相分配通道中分别通入分散有肿瘤细胞的水相和油相，利用液滴发生器形成单细胞液滴，单细胞液滴被捕获微池阵列捕获后，通过向微流控芯片中通入干细胞培养基，对单细胞液滴中的肿瘤干细胞进行分选、富集。
37.在单细胞培养条件下，只有具备自我更新能力的干细胞才能形成微球，而分化的肿瘤细胞则会逐渐死亡，因此，本发明提供的基于微流控芯片的肿瘤干细胞分选、富集的方法，能够依据干细胞的自我更新能力分选肿瘤干细胞，还可以借助肿瘤干细胞的克隆形成富集肿瘤干细胞，无需对肿瘤干细胞进行标记即可实现肿瘤干细胞的分选与富集，具有极大的通用性。
38.另外，本发明对肿瘤干细胞进行分选、富集的方法，具有单细胞分散高通量的优点，分散后的单细胞液滴在单细胞条件下，不仅为细胞克隆形成提供更为苛刻的条件，而且可以排除细胞间的信息交流，单细胞分析获取的是单个细胞的结构和功能信息，这种分析方法可以最大程度地显示细胞之间的差别。单细胞成球实验可以最大程度地分辨肿瘤细胞自我更新能力的差别，并在特定培养条件下单细胞克隆内细胞可以保持干性特征，从而突破现有优先稀释法进行细胞分散存在的单细胞获取效率低、分析通量严重受限的问题；并且本发明方法对富集的肿瘤干细胞的生物和化学性质基本无影响，非常适用于下游研究，如基于肿瘤干细胞的分子机制研究和药物测试等。
39.进一步地，水相为水凝胶基质与ca
‑
edta的混合液；所述油相为氟化油或矿物油；所述酸化的油相为含有酸溶液的氟化油或矿物油。
40.利用酸化的油相将ca
2
从ca
‑
edta络合物中释放出，释放出的ca
2
与水凝胶基质反应形成水凝胶，使得酸化的油相与含有肿瘤细胞的水相交汇后，形成单细胞水凝胶液滴，并被捕获微池阵列捕获而留存于捕获微池阵列中，便于对捕获微池阵列中的肿瘤细胞进行悬浮培养扩增。
41.进一步地，所述水凝胶基质为海藻酸盐水凝胶、matrigel水凝胶、胶原水凝胶、羟甲基纤维素水凝胶、聚乙二醇水凝胶中的任一种；所述溶胶液为乙二胺四乙酸、柠檬酸钠、胶原酶中的任一种或多种；所述酸溶液为0.00％～0.1％(v:v)的乙酸溶液。
42.通过向培养扩增后的微流控芯片中通入溶胶液，便于将呈水凝胶状的扩增后的肿
瘤细胞球水凝胶液滴进行解聚，使其具有流动性，再向微流控芯片中通入干细胞培养基，实现扩增后的肿瘤干细胞进行回收。
43.第三方面，本发明提供的肿瘤干细胞分选、富集的方法在细胞系、临床组织标本、临床液体标本、类器官构建、药物筛选、个体化检测中的应用。
44.与现有技术相比，本发明利用微流控芯片中液滴发生器，将肿瘤细胞悬浮液分散成单细胞液滴，并基于在单细胞培养条件，具备自我更新能力的肿瘤干细胞才能形成细胞球，而分化的肿瘤细胞则会逐渐死亡的原理，利用干细胞培养基对单细胞液滴中的肿瘤细胞进行培养分选、富集，无需标记即可实现肿瘤干细胞的分选、富集，使得本发明方法具有良好的普适性；并且，分选富集的肿瘤干细胞数量较高、具有明显的干性特征，有助于利用富集的肿瘤干细胞进行药物测试等下游研究。
附图说明
45.图1为实施例1微流控芯片结构示意图；
46.图2为实施例1微流控芯片的俯视图；
47.图3为实施例1微流控芯片的a
‑
a视图；
48.图4为实施例1微流控芯片底层结构示意图；
49.图5为液滴发生器的结构示意图；
50.图6为实施例1微流控芯片的中间层结构示意图；
51.图7为实施例1微流控芯片的顶层通道结构示意图；
52.图8为实施例2微流控芯片的结构示意图；
53.图9为实施例2微流控芯片的俯视图；
54.图10为实施例2微流控芯片的a
‑
a视图；
55.图11为实施例2微流控芯片底层结构示意图；
56.图12为实施例2微流控芯片的中间层结构示意图；
57.图13为实施例2捕获微池阵列的局部放大图；
58.图14为实施例2微流控芯片的顶层通道结构示意图；
59.图15为实施例4中水凝胶液滴中单细胞分散情况图；
60.图16为实施例4中结肠癌单细胞培养的细胞存活率图；
61.图17为不同培养方式的结肠癌单细胞培养后的干细胞含量图；
62.图18为实施例4中结肠癌单细胞培养后的干细胞含量图；
63.图19为实施例5中结肠癌组织单细胞培养后的细胞克隆球干细胞标志物的表达图。
64.图中：1、底层；2、中间层；3、顶层；4、液滴发生器；41、油相注入孔；42、水相注入孔；43、液滴池；44、水相通道；441、水相微通道；45、油相通道；451、油相微通道；5、油相通孔；6、水相通孔；7、液滴通孔；8、油相分配通道；81、进油口；9、水相分配通道；91、进水口；10、排液通道；101、排液口；11、液滴储存池；12、捕获微池阵列；121、微池；13、支柱。
具体实施方式
65.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明
作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
66.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
67.实施例1
68.一种微流控芯片，其结构如图1～7所示，由三层结构组成，包括底层1以及在底层1上依次铺设的中间层2和顶层3，其中，底层1上并排设置有多个液滴发生器4，液滴发生器4上设有油相注入孔41、水相注入孔42以及液滴池43；中间层2覆盖于底层1上，中间层2开设有与液滴发生器4上的油相注入孔41、水相注入孔42、液滴池43相配合的油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7；顶层3并排开设有油相分配通道8、水相分配通道9、排液通道10，油相分配通道8通过油相通孔5与油相注入孔41相连通，水相分配通道9通过水相通孔6与水相注入孔42相连通，排液通道10通过液滴通孔7与液滴池43相连通。
69.底层1上的液滴发生器4可采用流动聚焦法或t型通道法或共轴聚焦法的原理设计，本实施例中的液滴发生器4采用的是流动聚焦法的原理，其具体结构包括与油相注入孔41相连通的油相通道45和与水相注入孔42相连通的水相通道44，油相通道45与水相通道44交汇处与液滴池43相连通。油相通道45与水相通道44交汇处的油相通道451和水相通道441的内径为10～100μm，根据不同液滴的大小进行调整相应的内径，内径尺寸设置标准为使得液滴发生器4形成大小合适的单细胞液滴。
70.本实施例微流控芯片的核心在于液滴发生器4，利用流动聚集法原理，在液滴发生器4的油相注入孔41、水相注入孔42分别加入相应的油相和含有肿瘤细胞悬浮液的水相后，两种流体聚焦形成液滴，并流动至液滴池43，通过控制油相通道451和水相通道441的内径，实现肿瘤细胞悬浮液的单细胞分散。通过在底层1上并排设置多个液滴发生器4，实现对肿瘤细胞悬浮液的高通量分散。
71.中间层2的厚度为50～500μm，即油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7的高度为100～500μm；油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7的内径为100～500μm。中间层2上的油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7的作用均是便于相应的流体通过，通常将其尺寸设置的稍大于单细胞液滴的粒径，便于单细胞液滴、水相、油相等流体的流动。
72.顶层3上并排开设有油相分配通道8、水相分配通道9、排液通道10，三者的底部均开设有与中间层2相对应的多个通孔；三者的端部开设有相应的进油口81、进水口91和排液口101。通过进油口81、进水口91分别向油相分配通道8、水相分配通道9中通入相应的流体油相、水相，油相和水相分别经油相分配通道8、水相分配通道9底部的通孔、中间层2上的油相通孔5、水相通孔6，分别流动至液滴发生器4的油相注入孔41、水相注入孔42，油相与水相经液滴发生器4相应的管路交汇聚焦形成单细胞液滴，能够实现肿瘤细胞悬浮液的高通量分散，相对于现有有限稀释法进行细胞分散的方法，基于本发明微流控芯片进行单细胞分散的方法，具有高通量的优势，且操作简单；通过液滴发生器4的规模集成便能够获取大规模的单细胞，在单细胞分析领域具有重要的应用价值。
73.底层1、中间层2和顶层3均采用透明材质，并且底层1、中间层2以及顶层3的通道按照图1～7所示位置紧密封接，尤其是顶层3的油相分配通道8、水相分配通道9、排液通道10底部的通孔与中间层2上的油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7以及与液滴发生器4上的油相
注入孔41、水相注入孔42以及液滴池43一一对应，且无隙固定，防止流体在流动过程中流入其他通道。
74.本实施例中的微流控芯片的加工工艺过程包括如下步骤：
75.(1)在硅片上旋涂su
‑
8光胶，继而遮蔽含有微通道图形的掩膜，曝光及显影后得到su
‑
8模具。
76.(2)按质量或体积比为10:1混合pdms预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除。
77.(3)在含有su
‑
8结构的基板上浇铸pdms抽真空脱气，并置于85℃烘箱中加热固化，将固化后的pdms从su
‑
8模具上剥离，获得芯片的微结构；
78.(4)将固化后的pdms层与pdms底层键合，封接牢固，得到pdms芯片。
79.实施例2
80.一种微流控芯片，其结构如图8～14所示，由三层结构组成，包括底层1以及在底层1上依次铺设的中间层2和在中间层2上方铺设的顶层3，其中，底层1上并排设置有多个液滴发生器4，液滴发生器4上设有油相注入孔41、水相注入孔42以及液滴池43；中间层2覆盖于底层1上，中间层2上开设有与液滴发生器4上的油相注入孔41、水相注入孔42、液滴池43相配合的油相通孔5、水相通孔6、液滴通孔7；顶层3上开设有并排设置的油相分配通道8、水相分配通道9、排液通道10，油相分配通道8通过油相通孔5与油相注入孔41相连通，水相分配通道9通过水相通孔6与水相注入孔42相连通，排液通道10通过液滴通孔7与液滴池43相连通。
81.与实施例1中的微流控芯片相比，本实施例微流控芯片的底层1上还开设有与液滴发生器4的液滴池43相连通的液滴储存池11，液滴储存池11中设置有支柱13；中间层2底部开设有与液滴储存池11相配合的捕获微池阵列12，捕获微池阵列12由开设于中间层2底部的多个呈阵列设置微池121组成，微池类似于盲孔，微池的顶部封闭，底部开口，微池121的开口端置于液滴储存池11内，微池121的内径为75～100μm，高度为100～200μm。微池的径向截面可以为多边形、圆形、椭圆形等，微池为中空的圆柱体、锥体、多边体等，可以为多种不同形状的内部中空结构。
82.设置与液滴储存池11中的支柱13用于对中间层2进行支撑，尤其是对捕获微池阵列12部分的中间层2进行支撑，防止中间层2塌陷。
83.本实施例微流控芯片在实施例1微流控芯片的基础上，进一步增加了液滴储存池11和捕获微池阵列12，在利用并排设置的液滴发生器4进行肿瘤细胞悬浮液进行高通量分散后，将分散得到的单细胞于捕获微池阵列12中被捕获于微池121中，通过向液滴储存池11中通入相应的干细胞培养基，对微池121中的肿瘤细胞进行悬浮培养，从而进行肿瘤干细胞的分选、富集，使得能够在本实施例微流控芯片中完成肿瘤细胞的单细胞分散、肿瘤干细胞的分选、富集过程。
84.本实施例微流控芯片亦采用标准软刻蚀工艺加工而成，具体加工过程参照实施例1。
85.实施例3
86.利用实施例1微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集的方法，包括单细胞分散、细胞培养和细胞回收过程，其中，单细胞分散过程在微流控芯片中实现，细胞培养和细胞回收
过程在现有培养基中实现。
87.1、在进行肿瘤干细胞分选、富集过程中所涉及到的溶液如下：
88.(1)水相为海藻酸盐/ca
‑
edta溶液，其配制过程如下：
89.将100mmol/l氯化钙溶液和100mmol/l edta
‑
na溶液按照体积比1:1混合得混合液，利用氢氧化钠溶液将上述混合液的ph值调节至7.2，得到ca
‑
edta溶液。
90.将2wt％的海藻酸盐溶液与ca
‑
edta溶液按照体积比1:1的比例混合，涡旋混合均匀，得到海藻酸钠/ca
‑
edta溶液。
91.(2)油相为氟化油(hfe7500)，氟化油中含有1wt％的表面活性剂(krytox
‑
peg
‑
krytox)。
92.(3)酸化的油相为向(2)中的油相中加入了0.1％(v:v)的乙酸。
93.(4)干细胞培养基的组成如下：
94.dmem/f12培养基：1mg/ml nahco3、5mm hepes、2mm谷氨酰胺、4mg/ml肝素、4mg/ml bsa、10～50ng/ml bfgf、20～50ng/ml egf、100mg/ml apotrasferrin、25mg/ml胰岛素、9.6mg/ml腐胺、10～30nm亚硒酸钠、10～20nm黄体酮。
95.2、利用实施例1微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集方法，具体过程如下：
96.(1)单细胞分散
97.将前述配制的海藻酸盐/ca
‑
edta溶液与(0.5～2)
×
106/ml细胞悬浮按照体积比1:1混合得到分散有细胞的水相，油相为含有1wt％的表面活性剂(krytox
‑
peg
‑
krytox)和0.1％(v/v)乙酸的氟化油。
98.将油相从微流控芯片的进油口81引入，控制油相的流速为60μl/min；将分散有细胞的水相从微流控芯片的进水口91进入，控制水相的流速为20μl/min；油相经油相分配通道8底部的通孔流出，经中间层2上的油相通孔5流动至底层1上滴液发生器的油相注入孔41；水相经水相分配通道9底部的通孔流出，经中间层2上的水相通孔6流动至底层1上液滴发生器4的水相注入孔42，油相和水相分别经液滴发生器4上的油相通道45和水相通道44，继续涌入内径为50μm的油相微通道451和水相微通道441，油相和水相两相交汇形成直径为50～100μm的单细胞液滴，并储存于液滴池43；储存于液滴池43的单细胞液滴依次经中间层2上的液滴通孔7涌动至排液通道10，并于排液口101处收集单细胞液滴悬液。
99.(2)单细胞培养
100.将步骤(1)收集到的单细胞液滴悬液滴加到0.1％(v/v)乙酸的油相中进行孵育2～5min，使得单细胞液滴悬液中的海藻酸盐形成海藻酸钙水凝胶，即单细胞水凝胶液滴；将单细胞水凝胶液滴加入干细胞培养基，同时向干细胞培养基中加入含有20％(v/v)全氟
‑1‑
辛醇(perfluoro
‑1‑
octanol,pfo)的氟化油(hfe7500)，将单细胞水凝胶液滴转换到干细胞培养基进行连续培养。
101.(3)细胞回收
102.向步骤(2)经干细胞培养基培养后的单细胞水凝胶液滴中加入edta溶液(50mm，ph7.2)，解聚单细胞水凝胶液滴中的海藻酸钙水凝胶，释放液滴中的细胞，于1000rpm/min下离心3min，回收细胞。
103.实施例4
104.利用实施例1微流控芯片进行结肠癌干细胞的分选、富集方法，包括如下步骤：
105.(1)将密度为1
×
106/ml的结肠癌细胞hct116悬液与海藻酸盐/ca
‑
edta溶液按照体积比1:1混合，得到分散有细胞的水相，油相为含有1wt％的表面活性剂(krytox
‑
peg
‑
krytox)和0.1％(v/v)乙酸的氟化油。
106.将油相从微流控芯片的进油口81引入，控制油相的流速为60μl/min；将分散有细胞的水相从微流控芯片的进水口91进入，控制水相的流速为20μl/min；油相经油相分配通道8底部的通孔流出，经中间层2上的油相通孔5流动至底层1上滴液发生器的油相注入孔41；水相经水相分配通道9底部的通孔流出，经中间层2上的水相通孔6流动至底层1上液滴发生器4的水相注入孔42，油相和水相分别经液滴发生器4上的油相通道45和水相通道44，继续涌入内径为50μm的油相微通道451和水相微通道441，油相和水相两相交汇形成直径为50～100μm的单细胞液滴，并储存于液滴池43；储存于液滴池43的单细胞液滴依次经中间层2上的液滴通孔7涌动至排液通道10，并于排液口101处收集单细胞液滴悬液。
107.(2)单细胞培养
108.将步骤(1)收集到的单细胞液滴悬液滴加到0.1％(v/v)乙酸的油相中进行孵育2～5min，使得单细胞液滴悬液中的海藻酸盐形成海藻酸钙水凝胶，即单细胞水凝胶液滴；将单细胞水凝胶液滴入培养基，同时向培养基中加入含有20％(v/v)全氟
‑1‑
辛醇(perfluoro
‑1‑
octanol,pfo)的氟化油(hfe7500)，将单细胞水凝胶液滴转换到干细胞培养基中进行培养，并在显微镜下观察单细胞生长情况。
109.(3)细胞回收
110.向步骤(2)经干细胞培养基培养后的单细胞水凝胶液滴中加入edta溶液(50mm，ph7.2)，解聚单细胞水凝胶液滴中的海藻酸钙水凝胶，释放液滴中的细胞，于1000rpm/min下离心3min，回收细胞，进行结肠癌干细胞的鉴定。
111.结果如图15所示，细胞密度为1
×
106个/ml，细胞分散后符合泊松分布，多细胞(n≥2)液滴的含量小于2％，可以忽略多细胞的影响。
112.如图16所示，连续培养12天，第0、2、4、6、8、10、12天的单细胞的存活率发生改变，部分细胞死亡，从而筛选出能单细胞存活和增殖的细胞群。
113.如图17所示，与对照组传统悬浮培养富集方法和空白对照组贴壁细胞相比，微流控液滴单细胞培养方法中结肠癌细胞在第6天和第12天的表达干细胞标志物cd133阳性细胞群比例分别达到16.20％和15.60％；，其中，传统的悬浮培养的细胞是每孔1000个/ml细胞在低黏附板上培养后回收的细胞，贴壁培养是细胞在培养皿中贴壁培养后回收的细胞，微流控液滴单细胞培养的细胞是经过本发明的微流控液滴芯片的单细胞培养后回收的细胞。
114.如图18所示，与对照组传统悬浮培养富集方法相比，微流控液滴单细胞培养方法中结肠癌细胞表达干细胞标志物cd133阳性细胞群比例较高。表明本发明的微流控芯片单细胞培养方法分离富集肿瘤干细胞的可行性。
115.实施例5
116.利用实施例1微流控芯片进行结肠癌临床组织标本干细胞富集的方法，包括如下步骤：
117.(1)临床手术切除结肠癌组织标本，用pbs缓冲液(含青霉素、链霉素和两性霉素b)洗4次，加入2％胶原酶iv，消化孵育30～60min，1000rpm/min离心5min，dmem培养基重悬细
胞，过40μm筛网，1000rpm/min离心5min，dmem培养基重悬细胞，得到结肠癌细胞悬液。
118.(2)参照实施例3和实施例4中单细胞分散、单细胞培养和细胞回收的方法进行，与上述实施例的区别在于，对单细胞水凝胶液滴进行连续培养的天数不同，本实施例对单细胞水凝胶液滴进行连续培养20天。
119.如图19所示，微流控液滴单细胞培养方法中结肠癌组织细胞克隆球表达干细胞标志物cd133和lgr5，表明本发明的微流控芯片单细胞培养方法分离富集临床标本来源的肿瘤干细胞的可行性。
120.实施例6
121.利用实施例2微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集的方法，包括单细胞分散、细胞培养和细胞回收过程，上述单细胞分散、细胞培养和细胞回收过程在微流控芯片中实现。
122.1、在利用实施例2微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集的方法中所用到的溶液如下：
123.(1)水相为海藻酸盐/ca
‑
edta溶液，其配制过程如下：
124.将100mmol/l氯化钙溶液和100mmol/l edta
‑
na溶液按照体积比1:1混合得混合液，利用氢氧化钠溶液将上述混合液的ph值调节至7.2，得到ca
‑
edta溶液。
125.将2wt％的海藻酸盐溶液与ca
‑
edta溶液按照体积比1:1的比例混合，涡旋混合均匀，得到海藻酸钠/ca
‑
edta溶液。
126.(2)油相为氟化油(hfe7500)，氟化油中含有1wt％的表面活性剂(krytox
‑
peg
‑
krytox)。
127.(3)酸化的油相为向(2)中的油相中加入0.1％(v:v)的乙酸。
128.(4)干细胞培养基的具体组成如下：
129.dmem/f12培养基、1mg/ml nahco3、5mm hepes、2mm谷氨酰胺、4mg/ml肝素、4mg/ml bsa、10～50ng/ml bfgf、20～50ng/ml egf、100mg/ml apotrasferrin、25mg/ml胰岛素、9.6mg/ml腐胺、10～30nm亚硒酸钠、10～20nm黄体酮。
130.2、利用实施例2微流控芯片进行肿瘤干细胞分选、富集方法，具体过程如下：
131.(1)单细胞分散
132.将前述配制的海藻酸盐/ca
‑
edta溶液与1
×
106/ml的结肠癌细胞hct116悬浮按照体积比1:1混合得到分散有细胞的水相，油相为含有1wt％的表面活性剂(krytox
‑
peg
‑
krytox)的氟化油。
133.将油相从微流控芯片的进油口81引入，控制油相的流速为60μl/min；将分散有细胞的水相从微流控芯片的进水口91进入，控制水相的流速为20μl/min；油相经油相分配通道8底部的通孔流出，经中间层2上的油相通孔5流动至底层1上滴液发生器的油相注入孔41；水相经水相分配通道9底部的通孔流出，经中间层2上的水相通孔6流动至底层1上液滴发生器4的水相注入孔42，油相和水相分别经液滴发生器4上的油相通道45和水相通道44涌入内径均为50μm油相微通道451和水相微通道441，油相和水相于两相交汇形成直径为50～100μm的单细胞液滴，流动至液滴池43，并最终汇入液滴储存池11。
134.(2)单细胞培养
135.向油相分配通道8中注入酸化的油相，对液滴储存池中的单细胞液滴进行孵育2～5min，使单细胞液滴悬浮液中的海藻酸盐形成海藻酸钙水凝胶，从而形成单细胞水凝胶液
滴，液滴储存池11中的单细胞水凝胶液滴被中间层2底部的捕获微池阵列12捕获，暂存于捕获微池阵列12的微池121中，形成高密度水凝胶液滴阵列；更换油相为纯的氟化油(hfe7500)按照4μl/min灌流5min，以排除多余的酸化氟化油。
136.随后，由进油口81向微流控芯片中通入干细胞培养基，干细胞培养基经油相分配通道8底部的通孔、中间层2上的油相通孔5流入液滴发生器4的油相注入孔41，再流入液滴发生器4的液滴池43、液滴储存池11，将捕获微池阵列12中的海藻酸钙水凝胶液滴转换到干细胞培养基中进行培养，并在显微镜下观察单细胞生长情况。
137.(3)细胞回收
138.步骤(2)经干细胞培养基培养后，通过向进油口81灌入edta溶液(50mm，ph7.2)，解聚单细胞水凝胶液滴中的海藻酸钙水凝胶，释放海藻酸钙水凝胶中的细胞；随后以60μl/min的流速由进油口81向微流控芯片中灌入干细胞培养基，由排液口101收集细胞悬液，随后于1000rpm/min离心3min，重悬细胞沉淀，实现细胞回收，并进行结肠癌干细胞的鉴定。
139.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。