EpCAM-CD16-NKG2D三特异性抗体及其应用的制作方法

epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生化分子技术领域，特别是涉及一种epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体及其应用。


背景技术：

2.肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括lak细胞、til细胞、激活的t淋巴细胞和cik细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限，故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，以提高肿瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细胞的表面抗原，并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原。这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。
3.但是，目前的双特异性抗体介导的免疫细胞杀伤力较弱，尤其是对于迁移性肿瘤。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种介导的免疫细胞杀伤力较强的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体。
5.一种epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体，包括epcam结合结构域、cd16结合结构域和nkg2d配体结合结构域，所述epcam结合结构域能够特异性地与epcam结合，所述cd16结合结构域能够特异性地与cd16结合，所述nkg2d配体结合结构域能够特异性地与nkg2d配体结合。
6.在其中一个实施例中，所述epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明还提供了一种核酸分子，其编码如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体。
8.在其中一个实施例中，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的核酸分子。
10.在其中一个实施例中，所述重组载体基于pet28a构建得到。
11.本发明还提供了一种宿主细胞，其基因组中含有如上所述的核酸分子。
12.本发明还提供了如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于治疗癌症的产品中的应用。
13.本发明还提供了一种肿瘤抑制试剂盒，包括如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体、核酸分子、重组载体或宿主细胞。
14.本发明还提供了一种药物组合物，包括如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体以及药学上可接受的助剂。
15.本发明构建的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体在epcam
×
cd16双特异性抗体的基础上增加了nkg2d受体，使其不但可以为免疫细胞靶向连接表达epcam的上皮状态的肿瘤细胞，还可以靶向连接表达nkg2d配体的间质状态的肿瘤细胞，或者epcam和nkg2d配体都表达的混合状态的肿瘤细胞，因此能够介导更强大的免疫细胞对抗迁移性肿瘤的能力，可对迁移能力强的肿瘤如卵巢癌、结肠癌细胞等产生更大的杀伤力。此外，本发明采取αepcam
‑
hma hinge
‑
αcd16
‑
igg1hinge
‑
nkg2d的方式构建三特异抗体，还可解决嵌合蛋白质比较难表达的问题，这个排列顺序也让两个靶点与cd16之间的连接互不干扰。
附图说明
16.图1为实施例1中pet28a
‑
epcam hma cd16 hinge nkg2d载体图谱；
17.图2为实施例1中部分样品的pcr扩增结果；
18.图3为实施例1中菌液pcr鉴定结果；
19.图4为实施例1中表达蛋白的sds
‑
page蛋白电泳图；
20.图5为实施例1中咪唑洗脱后的sds
‑
page蛋白电泳图；
21.图6为实施例1中超滤浓缩后的sds
‑
page蛋白电泳图；
22.图7为对比例中pet28a
‑
epcam hma cd16载体图谱；
23.图8为对比例中部分样品的pcr扩增结果；
24.图9为对比例中菌液pcr鉴定结果；
25.图10为对比例中表达蛋白的sds
‑
page蛋白电泳图；
26.图11为对比例中咪唑洗脱后的sds
‑
page蛋白电泳图；
27.图12为对比例中超滤浓缩后的sds
‑
page蛋白电泳图；
28.图13为实施例3中铬释放细胞毒性实验的实验方案；
29.图14为实施例3中cck8实验的实验方案；
30.图15为实施例3中铬释放细胞毒性实验的实验结果；
31.图16为实施例3中cck8实验的实验结果。
具体实施方式
32.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
33.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
34.本发明一实施例的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体，包括epcam结合结构域、cd16结合结构域和nkg2d配体结合结构域，epcam结合结构域能够特异性地与epcam结合，cd16结合结构域能够特异性地与cd16结合，nkg2d配体结合结构域能够特异性地与nkg2d配体结合。需要强调的是，nkg2d配体位于肿瘤细胞表面，nkg2d受体位于nk细胞表面，本发明的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体中含有的是能够与肿瘤细胞表面的nkg2d配体特异性地结合的结构域。
35.epcam
×
cd16双特异性抗体通过靶向免疫细胞如nk细胞表面的标志性受体cd16以及肿瘤细胞表面的标志物epcam，引导免疫细胞对肿瘤细胞产生抗体依赖性的细胞毒性(antibody
‑
dependent cellular cytotoxicity,adcc)。然而，epcam并非在所有肿瘤细胞中都高表达。通过研究发现，epcam主要在上皮状态(epithelial)的细胞中高表达，但在间质状态(mesenchymal)的细胞中表达不高。而且，发生迁移的肿瘤细胞会发生上皮
‑
间质转换(epithelial
‑
to
‑
mesenchymal transition,emt)，其细胞状态会在上皮与间质之间转换，甚至处于上皮/间质混合的状态中。因此，对于迁移性肿瘤，epcam
×
cd16双特异性抗体介导的nk细胞杀伤力不够强。
36.本发明构建的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体在epcam
×
cd16双特异性抗体的基础上增加了nkg2d受体，使其不但可以为免疫细胞靶向连接表达epcam的上皮状态的肿瘤细胞，还可以靶向连接表达nkg2d配体的间质状态的肿瘤细胞，或者epcam和nkg2d配体都表达的混合状态的肿瘤细胞，因此能够介导更强大的免疫细胞对抗迁移性肿瘤的能力，可对迁移能力强的肿瘤如卵巢癌、结肠癌细胞等产生更大的杀伤力。而且，本发明采取αepcam
‑
hmahinge
‑
αcd16
‑
igg1hinge
‑
nkg2d的方式构建三特异抗体，解决了嵌合蛋白质比较难表达的问题，这个排列顺序也让两个靶点与cd16之间的连接互不干扰。
37.在一个具体示例中，epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示。可以理解，各结构域的氨基酸序列不限于此，其他能够特异性结合靶点的氨基酸序列均可，例如相应的抗体、抗体片段、亲和肽、纳米抗体等。
38.本发明一实施例的核酸分子，其编码如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体。在一个具体示例中，上述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:2所示。可以理解，由于密码子的简并性，能够表达同一蛋白的核酸序列具有多种形式，以上为经过密码子优化的核酸序列，但序列形式不限于此。
39.本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子。可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。在一个具体示例中，上述重组载体基于pet28a构建得到。可以理解，载体的具体种类并不限于此，可根据具体需要进行选择，例如pmd18t载体、puc18载体或pbr322载体等。
40.本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中含有如上所述的核酸分子。在一个具体示例中，上述宿主细胞为大肠杆菌。可以理解，宿主细胞的类型不限于此，可根据需要选择。
41.本发明一实施例的肿瘤抑制试剂盒，其包括如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体、核酸分子、重组载体或宿主细胞。
42.本发明一实施例的药物组合物，其包括如上所述的epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体以及药学上可接受的助剂。
43.以下为具体实施例。
44.实施例1 epcam hma cd16 hinge nkg2d重组蛋白表达
45.1、表达载体构建
46.1.1序列信息
47.氨基酸序列如下：
[0048][0049]
注：加粗部分序列是mutated human igg1hinge，下划线部分序列是epcam hma cd16，斜体部分序列是nkg2d。可以理解，信号肽和组氨酸标签的作用只是便于表达纯化，并非其特异性结合能力所必需。优化后的dna序列如下：
[0050]
[0051][0052]
1.2重组表达氨基酸序列及载体图谱
[0053]
如图1所示，其为pet28a
‑
epcam hma cd16 hinge nkg2d载体图谱。
[0054]
1.3实验流程
[0055]
1.3.1片段的克隆
[0056]
通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物，通过多段重组的方法重组到目的载体pet
‑
28a( )(ncoi
‑
bamhi酶切载体)中，得到全长构建。pcr扩增引物如下：
[0057]
引物
‑
faactttaagaaggagatataccatgggccatcatcatcatcaccatgatattgttctgacccag引物
‑
racccagggccacactaactgccggatcctgggtcagttcactg
[0058]
经pcr扩增后得到约880bp大小的片段，与预测的片段大小880bp(加上保护碱基)相符，部分样品的扩增结果见图2。
[0059]
连接体系如表1所示。
[0060]
表1连接体系
[0061]
组分体积纯化的pcr产物5μl酶切后载体5μl无缝组装mix10μl双蒸h2oup to 20μl
[0062]
以上酶切体系混匀后置于50℃水浴锅中反应30min。
[0063]
转化的方法如下：
[0064]
(1)将质粒浓度在100ng/μl左右的质粒吸取1～3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。质粒浓度较高的适当少加质粒，质粒浓度较低的可多加一些质粒。
[0065]
(2)42℃水浴90s不要摇动。
[0066]
(3)冰浴中放置3分钟左右。
[0067]
(4)每管中加入500～800μl 37℃预温lb培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
[0068]
(5)制备含相应抗性的琼脂平板。
[0069]
(6)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。
[0070]
(7)倒置平板于37℃培养12～16小时可出现菌落。
[0071]
(8)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行pcr鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
[0072]
1.3.2克隆质粒的鉴定
[0073]
随机挑选的克隆用测序引物进行pcr，预期扩增的片段长度为881bp，菌液pcr鉴定结果如图3所示。鉴定引物如下：
[0074]
pet
‑
seqfaactttaagaaggagatataccatgggccatcatcatcatcaccatgatattgttctgacccagpet
‑
seqracccagggccacactaactgccggatcctgggtcagttcactg
[0075]
1.4测序结果
[0076]
测通引物如下：
[0077][0078][0079]
pet28a
‑
epcam hma cd16 hinge nkg2d的测序结果如下：
[0080]
ccatgggccatcatcatcatcaccatgatattgttctgacccagagcccgtttagtaatccggtgaccctgggcaccagcgccagtattagttgccgcagtaccaaaagcctgctgcatagcaatggcattacctatctgtattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatctatcagatgagtaatctggcaagcggtgttccggatcgttttagcagtagcggtagcggtaccgattttaccctgcgcattagtcgcgttgaagcagaagatgttggtgtgtattattgcgcccagaatctggaaattccgcgtacctttggcggtggtaccaaactggaaattaagggcggcggcggcagtggtggtggcggtagcggtggtggtggtagccaggttaaactgcagcagagtggcccggaactgaaaaaaccgggcgaaaccgtgaaaattagttgtaaagccagtggctatacctttaccaattatggcatgaattgggtgaaacaggccccgggcaaaggtctgaaatggatgggctggattaatacctataccggtgaaagtacctatgccgatgattttaaaggtcgc
tttgcattttcactggaaaccagcgcctcagccgcatatctgcagattaataatctgaaaaacgaggataccgccacctatttttgcgcacgctttgccattaagggcgattattggggccagggcaccaccgttaccgtgagcagtccgagtggtcaggccggtgcagcagcaagcgaaagcctgtttgtgagtaatcatgcatatagcagtgaactgacccaggatccggcagttagtgtggccctgggtcagaccgttcgtattacctgtcagggcgatagcctgcgcagctattatgcaagctggtatcagcagaaaccgggtcaggccccggttctggttatctatggcaaaaataatcgtccgagtggtattccggatcgtttcagtggtagtagcagtggcaataccgcaagtctgaccattaccggcgcccaggccgaagatgaagccgattattattgtaatagccgtgatagcagcggcaatcatgtggtgtttggtggcggtaccaaattaaccgtgggtggcggcggcggtagcggcggtggtggttcaggtggcggtggcagcgaagtgcagctggtggaaagcggtggcggtgtggtgcgtccgggcggttcactgcgcctgagctgcgctgcaagtggttttacctttgatgattatggcatgagttgggttcgtcaggccccgggtaaaggtctggaatgggtgagtggtattaattggaatggcggcagtaccggttatgccgatagtgtgaaaggccgctttaccattagtcgcgataatgccaaaaatagcctgtatctgcagatgaatagcctgcgtgccgaagataccgccgtgtattattgtgcacgcggtcgtagcctgctgtttgattattggggtcagggtaccctggtgaccgtgagtcgtgaaccgaaaagcagcgataaaacccatacgagcccgccgagcccgttcctaaactcattattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgcatgcaaaggactgtgtaaaagctt
[0081]
2、蛋白表达
[0082]
2.1实验步骤
[0083]
(1)将表达质粒转化到bl21(de3)感受态细胞中，37℃倒置过夜培养。
[0084]
(2)挑取单菌落于5ml的lb培养基中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃，250rpm条件过夜培养16～18h，作为种子液。
[0085]
(3)将种子液按1:100转接到新鲜的100ml lb培养基中，37℃，250rpm条件培养，当菌液od
600
＝0.6时，补加iptg诱导剂至终浓度为0.5mm，18℃诱导培养16～18h。
[0086]
(4)4℃，4500r/min，离心15min，收集菌体。
[0087]
(5)将菌体用4ml裂解buffer(50mm tris、500mm nacl，ph 8.0)重悬后进行超声破碎。
[0088]
(6)超声后的样品，取40μl作为“总蛋白”样品，另外取40μl在4℃、12000r/min离心3min，分别取上清和沉淀作为“蛋白上清”样品和“蛋白沉淀”样品，“蛋白沉淀”用40μl超纯水进行重悬。
[0089]
(7)“总蛋白”、“蛋白上清”、“蛋白沉淀”分别加入10μl loading buffer，混匀后沸水浴10min，取10μl用sds
‑
page胶进行蛋白分析。
[0090]
2.2实验结果
[0091]
如图4所示为电泳图，泳道1为marker，泳道2为总蛋白，泳道3为蛋白上清，泳道4为蛋白沉淀，泳道5为阴性对照。
[0092]
2.3结论
[0093]
由电泳图可知，epcam hma cd16 hinge nkg2d重组蛋白在18℃诱导条件下包涵体
表达。
[0094]
3、蛋白纯化
[0095]
3.1取诱导培养后的菌体，每1g菌体加入20～30ml裂解buffer(50mm tris、500mm nacl，ph8.0)，用移液枪、搅拌等方式重悬菌体，直至重悬液不含菌块。
[0096]
3.2将重悬液倒入烧杯中，取1装满冰水混合物(冰块居多)的泡沫盒，将烧杯放进冰块中。
[0097]
3.3开启超声破碎仪，选择ω6变幅杆(若不是，需要拆卸安装变幅杆)，泡沫盒放进超声箱体中，变幅杆插入菌液液面下约1cm。超声参数：功率120w，work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍。
[0098]
3.4超声完成后，将样品分装于离心管中(两两配平)，再置低温离心机中，12000rpm，10min。
[0099]
3.5取离心后的样品，弃上清。向沉淀中加入变性buffer(50mm tris、150mm nacl、8m尿素，ph8.0)，用移液枪、搅拌等方式重悬菌体，溶解后，4℃静置1小时，再置低温离心机内，12000rpm，10min，离心后取上清。
[0100]
3.6将上述获得的上清液，用0.45μm滤膜过滤，通过镍亲和层析柱进行蛋白纯化。步骤如下：
[0101]
(1)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
[0102]
(2)5～10倍柱体积buffer a平衡柱子，buffer a：50mm tris、150mm nacl、8m尿素，ph8.0；
[0103]
(3)将样品以0.5ml/min的速度流穿镍柱；
[0104]
(4)用buffer a平衡柱子；
[0105]
(5)分别用50mm咪唑、100mm咪唑、500mm咪唑洗脱；
[0106]
(6)将洗脱下来的样品分别进行sds
‑
page胶分析目的蛋白的浓度。如图5所示为电泳图，其中泳道1：变性后，泳道2：marker，泳道3：50mm咪唑洗脱，洗脱体积20ml，上样量20μl，泳道4：100mm咪唑洗脱，洗脱体积10ml，上样量20μl，泳道5：500mm咪唑洗脱，洗脱体积10ml，上样量20μl。
[0107]
3.7收集洗脱的样品，用复性buffer(50mm tris、50mm nacl、0.8mm l
‑
arg、1mm谷胱甘肽氧化型、20％甘油、5mm edta，ph8.0)稀释20倍，于4℃，复性48小时。
[0108]
3.8取复性后的样品，进行10倍透析(透析buffer：20mm tris，ph9.0)。
[0109]
3.9取透析后的样品，用超滤法(超滤管)浓缩，并用sds
‑
page胶检测目的蛋白纯度。如图6所示为电泳图，其中泳道1：epcam hma cd16 hinge nkg2d，上样量按uv计2μg，泳道2：marker。
[0110]
对比例epcam hma cd16重组蛋白表达
[0111]
1、表达载体构建
[0112]
1.1序列信息
[0113]
氨基酸序列如下：
[0114]
[0115][0116]
注：下划线部分序列是epcam，加粗部分序列是human muscle aldolase(hma)hinge，斜体部分序列是cd16。优化后的dna序列如下：
[0117][0118][0119]
1.2重组表达氨基酸序列及载体图谱
[0120]
如图7所示，其为pet28a
‑
epcam hma cd16载体图谱。
[0121]
1.3实验流程
[0122]
1.3.1片段的克隆
[0123]
通过pcr的方法扩增得到片段pcr产物，通过多段重组的方法重组到目的载体pet
‑
28a( )(ncoi/xhoi酶切载体，酶切位点在全长图谱中隐藏)中，得到全长构建。pcr扩增引物如下：
[0124][0125]
经pcr扩增后得到约1582bp大小的片段，与预测的片段大小1530bp(加上保护碱基)相符，部分样品的扩增结果见图8。
[0126]
连接体系如表2所示。
[0127]
表2连接体系
[0128]
组分体积纯化的pcr产物5μl酶切后载体5μl无缝组装mix10μl双蒸h2oup to 20μl
[0129]
以上酶切体系混匀后置于50℃水浴锅中反应30min。
[0130]
转化的方法参照实施例1。
[0131]
1.3.2克隆质粒的鉴定
[0132]
随机挑选的克隆用测序引物进行pcr，预期扩增的片段长度为1738bp，菌液pcr鉴定结果如图9所示。鉴定引物如下：
[0133]
pet
‑
seqfgatcccgcgaaattaatacgpet
‑
seqrggccccaaggggttatgctagt
[0134]
1.4测序结果
[0135]
测通引物如下：
[0136]
测通引物1gatcccgcgaaattaatacg测通引物2ggccccaaggggttatgctagt测通引物3atacctataccggtgaaagt
[0137]
2、蛋白表达
[0138]
2.1实验步骤
[0139]
参照实施例1进行。
[0140]
2.2实验结果
[0141]
如图10所示为电泳图，泳道1为阴性对照，泳道2为总蛋白，泳道3为蛋白上清，泳道4为蛋白沉淀，泳道5为marker。
[0142]
2.3结论
[0143]
由电泳图可知，anti
‑
(epcam hma cd16)
‑
pet28a重组蛋白在18℃诱导条件下包涵体表达。
[0144]
3、蛋白纯化
[0145]
参照实施例1进行，将洗脱下来的样品分别进行sds
‑
page胶分析是否有目的蛋白。如图11所示为电泳图，其中泳道1：变性后，泳道2：50mm咪唑洗脱，洗脱体积20ml，上样量20μl，泳道3：75mm咪唑洗脱，洗脱体积10ml，上样量20μl，泳道4：500mm咪唑洗脱，洗脱体积10ml，上样量20μl，泳道5：marker。
[0146]
取透析后的样品，用超滤法(超滤管)浓缩，并用sds
‑
page胶检测目的蛋白纯度。如图12所示为电泳图，其中泳道1：epcam hma cd16，上样量按uv计5μg，泳道2：marker。
[0147]
实施例2抗体活性检测
[0148]
实验目的：生物素标记抗体，包被对应的抗原蛋白，通过elisa方法检测抗体与抗原的结合，判断双特异抗体(对比例和epcam ham cd16 hinge claudin18.2)和三特异抗体(实施例1)是否能够识别对应抗原。
[0149]
实验流程：
[0150]
1、间接elisa
[0151]
(1)包被：将epcam、cd16、ulbp1蛋白用包被液稀释(2μg/ml，每孔100μl)，取100μl加入到酶标板中，用保鲜膜封好反应孔，4℃过夜，洗涤液洗板3次。
[0152]
(2)封闭：将洗过的反应孔中加300μl封闭液，封好保鲜膜，室温放置1h，洗涤液洗板4次。
[0153]
(3)加样：将分别进行生物素标记的双特异及三特异抗体梯度稀释，之后分别取100μl加入到封闭好的孔中，室温放置1h，洗涤液洗板4～5次。
[0154]
(4)二抗：将hrp标记的sa每孔加入100μl室温避光放置1h，洗涤液洗板4～5次。
[0155]
(5)显色：在酶标板中加入显色液a50μl，显色液b 50μl，室温避光放置15min，再加入终止液50μl。
[0156]
(6)读数：将酶标板放进酶标仪450nm进行读数，结果如下表所示。
[0157]
表3
[0158][0159]
表4
[0160][0161][0162]
表5
[0163][0164]
实施例3细胞杀伤实验
[0165]
1、实验材料
[0166]
1.1细胞系
[0167]
英文名中文名来源ht
‑
29人结直肠腺癌细胞中国典型培养物保藏中心sk
‑
ov
‑
3人卵巢腺癌细胞中国典型培养物保藏中心nk92人自然杀伤细胞atcc
[0168]
1.2试剂
[0169]
名称厂家mccoy’s 5a培养基gibcomem alpha培养基gibco胰酶sigma胎牛血清excell biopbs自配cck8solarbiona2cro
4`
4h2o阿拉丁水样中cr
6
浓度检测试剂盒solarbio
[0170]
1.3仪器
[0171]
名称厂家生物安全柜haier二氧化碳培养箱上海一恒科学仪器
医用离心机北京白羊医疗器械紫外分光光度计上海天美
[0172]
2、实验方法
[0173]
2.1铬释放细胞毒性实验
[0174]
a.靶细胞的制备：取培养24～48h的靶细胞ht
‑
29和sk
‑
ov
‑
3，细胞消化加入5mm铬酸钠溶液，置37℃培养箱中孵育60min，每间隔15min摇晃一次，然后用pbs将细胞洗涤三次，除去游离的cr
6
；
[0175]
b.效应细胞的制备：将nk92细胞用完全mccoy’s 5a培养基配制成细胞悬液备用；
[0176]
c.效
‑
靶细胞作用：将效应细胞与靶细胞按体积比1：1加入到24孔板中，保证effector:target[e:t]＝2.5:1(效应细胞：5
×
105cell/well；靶细胞6
×
104cell/well)。同时设自然释放对照孔(靶细胞体积：完全mccoy’s 5a培养液＝1：1)和最大释放孔(靶细胞体积：2％sds＝1：1)，放置37℃、5％co2恒温培养箱内孵育4h；
[0177]
d.细胞毒性测定：将培养上清收集起来，用水样中cr
6
浓度检测试剂盒测每孔的铬离子浓度，根据细胞毒性百分比公式：细胞毒性(％)＝[(实验组cr
6
浓度－自然释放组cr
6
浓度)/(最大释放组cr
6
浓度－自然释放组cr
6
浓度)]
×
100％计算细胞毒性。具体实验方案如图13所示。
[0178]
2.2cck8实验
[0179]
a.靶细胞准备：将ht
‑
29和sk
‑
ov
‑
3细胞制成5
×
104cell/ml的细胞悬液，然后按照100μl/孔接种到96孔板中，即5
×
103cell/well，于37℃培养箱中过夜培养；
[0180]
b.效
‑
靶细胞作用：将效应细胞nk92与靶细胞按2：1加入到96孔板中，即nk92细胞为1
×
104cell/well，放置37℃、5％co2恒温培养箱内过夜培养。
[0181]
c.cck8检测：24h后加入cck8检测试剂，于37℃、5％co2恒温培养箱内孵育3h，最后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。具体实验方案如图14所示。
[0182]
3、实验结果
[0183]
3.1铬释放细胞毒性实验
[0184]
na2cro4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记cr
6
的细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出cr
6
。为评价三特异抗体联合nk92细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，通过加药后测定靶细胞释放出的cr
6
浓度来判定细胞毒性作用，对实验结果进行分析可知，三特异抗体epcam ham cd16 hinge nkg2d对ht
‑
29和sk
‑
ov
‑
3的细胞毒性分别为44％、19％，对ht
‑
29细胞毒性最大；而epcam ham cd16 hinge claudin18.2与epcam ham cd16对肿瘤细胞ht
‑
29和sk
‑
ov
‑
3的细胞毒性大约为10％。由此可知，epcam ham cd16 hinge nkg2d的作用显著优于epcam ham cd16 hinge claudin18.2与epcam ham cd16(如图15所示)。
[0185]
3.2cck8实验
[0186]
为了评价三特异抗体联合nk92细胞对肿瘤细胞增殖的影响，分别对ht
‑
29和sk
‑
ov
‑
3进行了cck8实验，对实验结果分析可知，在ht
‑
29细胞中，三特异抗体epcam ham cd16 hinge nkg2d对细胞抑制作用达20％，而epcam ham cd16 hinge claudin18.2与epcam ham cd16对细胞生长抑制作用分别为4％、1％；在sk
‑
ov
‑
3细胞中，epcam ham cd16 hinge nkg2d的细胞抑制作用有17％，而epcam ham cd16 hinge claudin18.2与epcam ham cd16
对细胞生长无抑制作用，因此epcam ham cd16 hinge nkg2d的作用显著优于epcam ham cd16 hinge claudin18.2和epcam ham cd16(如图16所示)。
[0187]
综上所述，我们经过nk92细胞杀伤实验发现，不管是双特异抗体还是三特异抗体在铬离子释放实验中都表现出较nk92原始杀伤能力有所增强，尤其epcam cd16 nkg2d三特异抗体杀伤效果更为明显。进一步的，我们尝试使用cck8法检测nk92细胞杀伤肿瘤细胞活率，发现在ht
‑
29细胞中三种抗体均能够有效杀伤细胞，降低了活细胞数量，其中epcam cd16 nkg2d最为明显；但在sk
‑
ov
‑
3细胞中，只有epcam cd16 nkg2d观察到了有效的杀伤效果。因此，可证明本发明的epcam cd16 nkg2depcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体表现出更优越的肿瘤细胞杀伤效果。可以理解，该epcam
‑
cd16
‑
nkg2d三特异性抗体不仅可作用于卵巢癌和结肠癌，其他表达epcam和/或表达nkg2d配体的肿瘤皆可适用。
[0188]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0189]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。