巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用的制作方法

巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1及其突变体与应用
技术领域
1.本发明涉及一种巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1及其突变体与应用，具体涉及来源于巴氏杆菌(bisgaard taxon)的肝素骨架合酶及其两种突变体与在肝素骨架合成中的应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)是一种结构复杂的生物大分子，由己糖醛酸或己糖和己糖胺组成的重复二糖单元，有规则的排列而形成的一种线性无分支的酸性多糖。糖胺聚糖分布广泛且种类繁多，根据硫酸化程度分为无硫酸修饰的糖胺聚糖和硫酸修饰的糖胺聚糖，无硫酸修饰的糖胺聚糖只有透明质酸一种，而硫酸修饰的糖胺聚糖包括硫酸皮肤素/硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素等。
3.肝素(heparin，简称hp)，是一种重要的糖胺聚糖，是由d
‑
β
‑
葡糖醛酸(或l
‑
α
‑
艾杜糖醛酸)和n
‑
乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。它因首先从肝脏中发现而得名，肝素具有增强天然丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶ⅲ的活性，催化抑制内源性凝血途径的所有丝氨酸蛋白酶，因此具有抗凝血抗血栓的作用，此外还可用于治疗心绞痛、肾病综合征、严重烧伤、类风湿性关节炎等，其需求量在国际上常年处于生物技术药物领域的前列。
4.肝素的来源主要分为动物提取、化学合成和化学酶法合成。动物提取肝素主要是从猪和牛的小肠粘膜中提取，但由于提取方法的差异以及动物体来源的肝素的基本单元的结构，数目各不相同，导致肝素产物的结构、构型、分子量各有异同，可能引发肝素污染。此外，肝素的结构较为复杂，使用化学合成的方法延长糖链时要考虑对不稳定基团进行保护、去保护、活化和偶联等步骤，而且还要考虑区域选择性和立体选择性等情况，难度较大且产率低。hp的化学酶法合成是化学法和酶法相结合的方法，合成过程反应条件温和，特异性强。相对于化学合成来说，该方法步骤简单，效率高。目前化学酶法合成肝素骨架糖链常用的酶有kfia和pmhs2等肝素骨架合酶，其中pmhs2是具有n
‑
乙酰氨基葡糖转移酶活性和葡萄糖醛酸转移酶活性的双功能酶，在化学酶法合成中应用广泛，寻找该酶的同工酶有助于高效合成肝素骨架糖链，以及深入研究对该酶家族反应机制。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1及其突变体与应用，本发明中的肝素骨架合酶bths1来源于巴氏杆菌(bisgaard taxon)，并经过定点突变得到三种高活性突变体，该肝素骨架合酶及三种高活性突变体可应用于肝素骨架的合成。
6.术语说明：
7.glca
‑
pnp：中文全称为4
‑
硝基苯基
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖醛酸，其作用是作为肝素寡糖合成的起始受体底物；
8.udp
‑
glcnac：中文全称为尿苷二磷酸
‑
n
‑
乙酰氨基葡萄糖，其作用是作为供体，为
肝素寡糖的合成提供乙酰葡萄糖胺；
9.udp
‑
glcntfa：中文全称为尿苷二磷酸
‑
n
‑
三氟乙酰氨基葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供叠氮乙酰氨基半乳糖供体；
10.udp
‑
galnaz：中文全称为尿苷二磷酸
‑
n
‑
叠氮乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供三氟乙酰氨基葡萄糖供体；
11.udp
‑
galnac：中文全称为尿苷二磷酸
‑
n
‑
乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供乙酰氨基半乳糖糖供体；
12.udp
‑
glc：中文全称为udp
‑
n
‑
葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供葡萄糖供体；
13.udp
‑
gal：中文全称为udp
‑
n
‑
半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性，为寡糖的合成提供半乳糖供体。
14.本发明技术方案如下：
15.一种巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1，其氨基酸序列如seq id no.2所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.一种巴氏杆菌肝素骨架合酶突变体bths1(s305n)，其氨基酸序列如seq id no.4所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；是将上述巴氏杆菌肝素骨架合酶氨基酸序列中第305位的丝氨酸突变为天冬酰胺。
17.一种巴氏杆菌肝素骨架合酶突变体bths1(s305q)，其氨基酸序列如seq id no.6所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；是将上述巴氏杆菌肝素骨架合酶氨基酸序列中第305位的丝氨酸突变为谷氨酰胺。
18.一种重组载体，是在质粒载体中插入上述巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1或上述巴氏杆菌肝素骨架合酶突变体的编码基因。
19.根据本发明优选的，所述质粒载体为pet30a( )。
20.本发明中，含有目的基因的重组载体由南京金斯瑞公司合成。
21.一种重组菌株，是将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。
22.根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选为大肠杆菌bl21(de3)。
23.本发明中，含有目的基因的重组载体由南京金斯瑞公司合成。
24.上述巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1或上述巴氏杆菌肝素骨架合酶突变体在合成肝素骨架中的应用。
25.根据本发明优选的，所述应用是以udp
‑
glcnac作为供体底物，glca
‑
pnp作为受体底物，催化反应生成结构为glcnac
‑
glca
‑
pnp的肝素骨架。
26.根据本发明优选的，所述应用是以udp
‑
glca作为供体底物，glcnac
‑
glca
‑
pnp作为受体底物，催化反应生成结构为glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp的肝素骨架。
27.本发明中未详细描述的实验操作均可按照本技术领域的常规实验操作进行。
28.有益效果
29.本发明公开的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1，是一种全新来源的肝素骨架合酶，同时具备乙酰氨基葡萄糖转移酶glcnac
‑
t和葡萄糖醛酸转移酶glca
‑
t两种转移酶活性。并且在最适条件下能够利用udp
‑
glcnac作为供体底物，glca
‑
pnp作为受体底物，或者udp
‑
glca
作为供体底物，glcnac
‑
glca
‑
pnp作为受体底物有效地合成肝素骨架，催化效率高于目前常用酶pmhs2。并且本发明设计突变得到了活性更高的bths1突变体。本发明提高了肝素骨架合成中glcnac和glca转移合成效率，极大地促进了肝素仿生合成应用化发展，为糖胺聚糖的研究发展开启了全新的一页。
附图说明
30.图1是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1及其突变体在重组大肠杆菌中可溶性表达目的蛋白的sds
‑
page检测结果图；
31.图中，m为marker；a中，1为bsa，2为bths1；b中，3为bths1(s305n)，4为bths1(s305q)。
32.图2是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的活性测定曲线；
33.图中，a为bths1
‑
glcnac
‑
t活性曲线，图b为bths1
‑
glca
‑
t活性曲线。
34.图3是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的产物确证，
35.图中，a为肝素二糖glcnac
‑
glca
‑
pnp的1d1h
‑
nmr图谱；b为肝素二糖glcnac
‑
glca
‑
pnp的质谱分析图谱；c为肝素三糖glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp的1d1h
‑
nmr图谱；d为肝素三糖glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp的质谱分析图谱。
36.图4是不同ph下巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1体外催化合成肝素骨架二糖的相对得率曲线图；
37.图中，横坐标为ph值，纵坐标为反应产物的相对得率(以最佳反应组为100％)；
38.图5是不同反应温度下巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1体外催化合成肝素骨架二糖的转换率曲线图；
39.图中，横坐标为时间，纵坐标为反应产物的相对得率(以最佳反应组为100％)；
40.图6是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1以glca
‑
pnp为起始受体底物，分别使用udp
‑
glcnac、udp
‑
glcntfa、udp
‑
glcnaz、udp
‑
glc、udp
‑
glanac、udp
‑
glanaz、udp
‑
glantfa、udp
‑
gla为供体底物时，体外催化合成肝素骨架二糖的转换率柱状图；
41.图中，纵坐标为产物得率；
42.图7是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1和pmhs2在各自最适温度、ph，相同催化体系，相同反应时间，相同酶量(mg/ml)时的转换率曲线；
43.图中，纵坐标为转换率；a为glcnac转移酶活性曲线，b为glca转移酶活性曲线；
44.图8是巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1及其两个突变体在相同催化条件下的相对转化率，设定bths1转化率为1，其突变体转化率折合为其倍数。
具体实施方式
45.下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
46.发明人在数据库ncbi中通过blast发现菌株巴氏杆菌(bisgaard taxon 40)中一段序列(awx15661.1)与之前已经报道的肝素骨架合酶pmhs2的氨基酸序列有50％的序列同源性，因此推测这段基因表达的蛋白产物可能具有肝素骨架合酶活性，在大肠杆菌表达系
统中表达该蛋白，将其命名为bths1，核苷酸序列如seq id no.1所示，将其表达的蛋白命名为bths1，氨基酸序列如seq id no.2所示。
47.同时，发明人对于检索到的pmhs2同源序列，进行序列同源分析，使用embl clustal omega工具进行多序列比对，并使用jalview软件对于氨基酸序列高保守区域进行分析。同时使用swiss
‑
model工具对bths1进行蛋白质模拟建模，并使用hotspot wizard 2.0对该酶的活性中心进行预测。发现bths1的氨基酸序列的91位、158位和305位，位于活性中心及高保守区域附近，对其进行定点突变极有可能提高bths1的催化活性。因此结合同源分析的在该三个位置的优势氨基酸，设计了bths1(t91y)、bths1(t91l)、bths1(y158s)、bths1(y158n)、bths1(s305q)、bths1(s305n)、bths1(s305y)共计七个突变体，其中突变体bths1(s305n)核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示；突变体bths1(s305q)核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。
48.除非另外说明，本发明所采用的底物糖类试剂均购自于sigma公司和生工。所有的bths1及其突变体的质粒均委托南京金斯瑞公司构建。所采用的hplc检测方法均使用ymc的氨基柱，液相系统为日本岛津液相，紫外检测系统为spd
‑
20a。检测上述肝素骨架合酶催化产物通过色谱柱分离后各组分在310nm和254nm的紫外吸收，hplc流动相条件见表1：
49.表1检测肝素寡糖所使用hplc分析方法
[0050][0051]
实施例1.巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1和bths2的制备
[0052]
(1)表达菌株的构建
[0053]
将南京金斯瑞公司合成的重组质粒pet28a
‑
his tag
‑
mbp tag
‑
bths1
‑
stop codon转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，在含卡那霉素(100μg/ml)的lb平板上培养12h，筛选转化子(同时进行阴性对照实验)，获得bths1阳性转化子。
[0054]
按照上述相同方法构建得到七个突变体bths1(t91y)、bths1(t91l)、bths1(y158s)、bths1(y158n)、bths1(s305q)、bths1(s305n)、bths1(s305y)的阳性转化子。
[0055]
(2)蛋白的表达和纯化
[0056]
将bths1阳性转化子单菌落在50ml无菌的lb液体培养基中活化培养12h(37℃，225r/min)。之后向含有卡那霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中加入1％体积的活化菌液，37℃，225r/min震荡培养大约3个小时至od
600
为0.6
‑
0.8，加入iptg(终浓度0.2mm)，在22℃，225r/min条件下诱导16
‑
18h。然后8000rpm离心10min收集菌体并用平衡缓冲液重悬，冰上
超声破碎(工作15s，间歇45s，振幅33％，能量1500kj，4℃)20min，将破碎后菌体12000rpm离心40min(4℃)，保留上清，上清用0.22μm滤膜过滤。用镍柱通过组氨酸标签进行纯化：首先镍柱使用平衡缓冲溶液平衡5
‑
10个柱体积，过滤后的上清流过镍柱以完成上样步骤，上样后用平衡缓冲液平衡3
‑
5个柱体积，然后用洗涤缓冲液洗掉杂蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱得到目的蛋白。纯化得到的蛋白质保存在20％甘油中，每管分装保存于
‑
80℃冰箱。
[0057]
其中，平衡缓冲液的组分为：0.3m nacl，50mm nah2po4，ph＝8；
[0058]
洗涤缓冲液的组分为：10mm咪唑，0.3m nacl，50mm nah2po4，ph＝8；
[0059]
洗脱缓冲液的组分为：250mm咪唑，0.3m nacl，50mm nah2po4，ph＝8。
[0060]
按照上述相同方法纯化得到七个突变体bths1(t91y)、bths1(t91l)、bths1(y158s)、bths1(y158n)、bths1(s305q)、bths1(s305n)、bths1(s305y)的重组蛋白。
[0061]
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)对纯化后的bths1及其bths1(s305q)、bths1(s305n)突变体重组蛋白的表达情况进行鉴定(如图1所示)。结果显示，bths1及其突变体均成功使用此法纯化得到，条带单一，bths1重组蛋白的分子量与理论值一致，为114.4kda。
[0062]
实施例2.巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的活性验证
[0063]
(1)巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1酶活性验证
[0064]
分别用商业化glca
‑
pnp(终浓度为0.2mm)作为受体底物，udp
‑
glcnac(终浓度为0.3mm)作为供体底物，以实施例1制备得到的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1为蛋白酶进行反应，反应体系如表2所示；该反应置于37℃水浴锅中反应4h后，沸水加热5min使蛋白酶失活从而终止反应，反应液用0.22μm的滤膜过滤后按照表1所述方法进行hplc检测，单糖受体的pnp基团在紫外310nm检测波长下有特异性吸收，流动相流速为0.5ml/min，检测结果见图2。
[0065]
表2.巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的酶活性验证反应体系
[0066][0067]
由图2可知，本发明提供的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1同时具有glcnac转移酶活性和glca转移酶活性，能将glcnac基团转移到glca
‑
pnp的非还原端，生成肝素二糖glcnac
‑
glca
‑
pnp；也能将glca基团转移到glcnac
‑
glca
‑
pnp的非还原端，生成肝素三糖glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp。
[0068]
(2)巴氏杆菌肝素骨架合酶产物的确证
[0069]
为了确证上述活性反应的产物结构，随后进行电喷雾电离质谱(esi
‑
ms)和1d1h
‑
nmr分析。反应以较大规模进行以获得足够的产物，产物通过p2柱进行纯化。然后在thermo lcq
‑
deca上进行ms分析，ms的所有样品都溶解在50％甲醇中，ms实验在负离子模式下进行，喷雾电压为5kv，毛细管温度为275℃。同时在agilent 600mhz仪器上22℃条件下测定二糖和三糖产物的d1h
‑
nmr，并通过mestrenova软件进行光谱分析。结果如图3所示。
[0070]
由图3可知，ms图谱中得到了与glcnac
‑
glca
‑
pnp(m
w
＝518.14)脱去一个质子后分子量相符合的峰(516.96)，以及与glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp(m
w
＝694.55)脱去一个质子后分子量相符合的峰(693.04)证明产物glca
‑
glcnac
‑
glca
‑
pnp的生成。d 1
h
‑
nmr光谱分析确证二糖结构为glcnac
‑
(α1,4)
‑
glca
‑
pnp，三糖结构为glca
‑
(β1,4)
‑
glcnac
‑
(α1,4)
‑
glca
‑
pnp，与预期一致。
[0071]
实施例3巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的催化性质研究
[0072]
(1)酶的体外反应最适反应ph测定
[0073]
反应体系如表2所示，以实施例1制备得到的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1为蛋白酶，除缓冲液ph外其他条件都不变，将tris
‑
hcl缓冲液换成不同ph值的tris
‑
hcl/pbs/mes缓冲液，分别设置2.0，4.4，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8，10.5共计10个ph梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同实施例2。
[0074]
结果如图4所示，结果表明巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1在广泛的ph范围内(5.0～10.5)具有活性，其中反应的最适ph为6.0～8.0。说明bths1可在较强碱性条件(ph＝10.5)下保持良好的活性。
[0075]
(2)酶的体外反应最适温度的测定
[0076]
反应体系如表2所示，以实施例1制备得到的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1为蛋白酶，反应温度设置4℃，10℃，20℃，30℃，35℃，40℃，55℃共8个温度梯度点进行反应，每个温度梯度设置三组平行实验，反应体系在最佳ph(6.5)且反应体系中添加mn
2
离子。测定反应温度对酶活力的影响。
[0077]
结果如图5所示，表明巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1在4
‑
40℃之间催化合成二糖的相对得率较高，均在90％以上，其中最适温度应为40℃左右。
[0078]
实施例4巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的供体特异性研究
[0079]
为了确定巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的底物特异性，使用商业化glca
‑
pnp作为受体，udp
‑
glcnac和其他种类结构类似的各种udp
‑
糖作为供体(udp
‑
glcnac，udp
‑
glcntfa，udp
‑
glcnaz，udp
‑
galnaz，udp
‑
gal，udp
‑
galnac，udp
‑
galntfa，udp
‑
glc)，按照表2的体系进行反应。所有反应均在37℃水浴中进行4小时。最后反应产物按照表1所述的方法通过hplc分析。
[0080]
结果如图6所示，表明当受体是单糖glca
‑
pnp时，在实验组所有的单糖供体中，巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1除了其天然底物udp
‑
glcnac外，还可以以udp
‑
glcntfa、udp
‑
glcnaz为底物，但反应程度很弱。说明本发明中的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1对天然底物udp
‑
glcnac具有较强的底物特异性。
[0081]
实施例5巴氏杆菌肝素骨架合酶催化反应的动力学常数测定
[0082]
(1)催化反应的动力学常数测定
[0083]
以巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1和肝素骨架合酶pmhs2的glcnac
‑
t转移酶活性的动力学常数测定为例。以实施例1制备得到的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1和现有肝素骨架合酶pmhs2为蛋白酶。测定在glca
‑
pnp分别设定为0.15，0.2，0.4，0.6，1mm，udp
‑
glcnac浓度从0.1
‑
0.5变化时，反应40s之后，加入20μl 0.6％tfa终止反应(以上反应每个设置三个平行,反应体系见表3(以[glca
‑
pnp]＝0.15mm为例))，并使用udp
‑
glo
tm
glycosyltransferase assay试剂盒(购于promega)测定反应转化率。从而得到不同底物浓度下的反应初速度，以及某glca
‑
pnp浓度下，1/v随[udp
‑
glcnac]变化的曲线，从而得到不同glca
‑
pnp浓度下的k
n
和b
n
，并计算出相应的动力学常数。测定结果见表4和图7。
[0084]
参考公式如下：
[0085]
v＝p/t，其中p代表瞬时转化率，t为反应时间，v为反应初速度；
[0086]
其中[a]代表供体底物的浓度，[b]代表受体底物的浓度，代表酶对于供体底物的km值，代表酶对于受体底物的km值。
[0087]
并且记上式中k
cat
＝v
max
/e
t
，其中v
max
代表最大反应速度，e
t
代表酶的浓度。
[0088]
表3.肝素骨架合酶的动力学常数测定反应体系
[0089][0090][0091]
表4.肝素骨架合酶的动力学常数测定结果
[0092][0093]
由表4可知，巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1的催化效率好于肝素骨架合酶pmhs2；且无论是glcnac转移酶活性还是glca转移酶活性，巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1对于供体亲和力比肝素骨架合酶pmhs2高。
[0094]
(2)肝素骨架合酶bths1和pmhs2的实时转化率
[0095]
为侧面验证上述结果，以实施例1制备得到的巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1和现有肝素骨架合酶pmhs2为蛋白酶，分别在各自最适温度、ph，相同催化体系，相同酶量(0.06mg/ml)下进行体外催化反应，并在相同反应时间取样，按照实施例2进行样品处理。通过表1所述方法进行hplc分析，转化率随时间曲线如图7，再次说明bths1的催化效率好于pmhs2。
[0096]
实施例6巴氏杆菌肝素骨架合酶bths1突变体活性研究
[0097]
以实施例1得到的七个突变体bths1(t91y)、bths1(t91l)、bths1(y158s)、bths1
(y158n)、bths1(s305q)、bths1(s305n)、bths1(s305y)重组蛋白以及bths1重组蛋白为蛋白酶在相同反应条件(37℃，ph＝7.5，50mm tris
‑
hcl，20mm mn
2
)，相同酶量(0.012mg/ml)，相同底物量([glca
‑
pnp]＝0.2mm，[udp
‑
glcnac]＝0.3mm或[glcnac
‑
glca
‑
pnp]＝0.2mm，[udp
‑
glca]＝0.3mm)下进行体外催化反应。反应20min后，沸水加热5min使蛋白酶失活从而终止反应，反应液用0.22μm的滤膜过滤后按照实例2所述方法进行hplc检测，转化率之比柱状图如图8所示，
[0098]
由图8可知，结果显示bths1(s305n)、bths1(s305q)的活性有不同程度的提升，其中bths1(s305n)转移酶活性为bths1的2.99倍，glca转移酶活性为bths1的1.52倍，bths1(s305q)的glcnac转移酶活性为bths1的1.47倍，glca转移酶活性相对于bths1没有明显变化。bths1(s305y)的glcnac转移酶活性相较于bths1略微下降，且其余突变体均丧失活性，本发明不对其进行保护。