一株枯草芽孢杆菌及其在茄子褐纹病防治中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在茄子褐纹病防治中的应用。


背景技术：

2.茄子褐纹病是茄子生长发育过程中的三大病害之一,是由茄褐纹拟茎点霉（phomopsis vexans harter）引起的一种土传真菌病害，是一种世界性病害。中国早在1932年就发现茄子褐纹病（刘学敏等, 1998），首次报道是在印度的古杰拉特，目前该病在全国范围内危害茄科及其近缘属植物。目前，发生该病时仍是使用化学农药来杀死病菌，但是化学药品的长期使用不仅使病菌的耐药程度提高，对地球表层系统的五大圈也产生不可忽视的危害。现在用生防细菌去防治病害成为国内外研究者逐步关注的热点。
3.枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在；同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖,而且生产枯草芽孢杆菌制剂的工艺简单、制剂稳定、施用方便、储存期长，因此是一种理想的生防微生物。


技术实现要素：

4.本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一株枯草芽孢杆菌及其在茄子褐纹病防治中的应用。
5.具体技术方案如下：本发明的目的之一是提供一株枯草芽孢杆菌。
6.该菌种是一株枯草芽孢杆菌，命名为ku
‑
42，已保藏于湖北武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 2021862。
7.该菌株采集自潍坊后朴里大棚室外，经鉴定为枯草芽孢杆菌，其典型特征是革兰氏染色为阳性,芽孢（0.6～0.9）μm
×
（1.0～1.5）μm，位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时常形成皱壁,为需氧型细菌。
8.通过对峙培养实验验证，本发明获得的枯草芽孢杆菌对茄子褐纹病菌有显著的抑制作用。
9.本发明的目的之二是提供上述枯草芽孢杆菌在茄子褐纹病防治中的应用。
10.具体地，将上述枯草芽孢杆菌应用于抑制茄子褐纹病菌的生长。
11.其中，所述的茄子褐纹病菌无性态属于茄褐纹拟茎点霉（phomopsis vexans），有性态属于茄间座壳菌（diaporthe vexans）。
12.经对峙培养实验验证，上述枯草芽孢杆菌对茄子褐纹病菌具有高效、广谱抑制作用，可应用于茄子褐纹病的防治。
13.进一步，所述的枯草芽孢杆菌对茄子褐纹病菌的抑制率超过50%。
14.【生物保藏说明】中国典型培养物保藏中心登记入册编号：cctccno：m2021862；参椐的生物材料（株）：ku
‑
42；上述请求保藏的生物材料（株）附有建议的分类命名：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；该生物材料（株）已于2021年7月12日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。
15.中国典型培养物保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学。
16.本发明的有益效果如下：本发明通过分离鉴定得到一株枯草芽孢杆菌，经对峙培养实验验证，上述枯草芽孢杆菌对茄子褐纹病菌具有高效、广谱抑制作用，对不同株的茄子褐纹病菌的抑制率均超过50%，可应用于茄子褐纹病的防治。
附图说明
17.图1为实施例2中芽孢杆菌的16sdnapcr电泳图；图2为实施例2中芽孢杆菌的保守序列分析图；图3实施例2中芽孢杆菌的遗传进化分析；图4实施例3中茄子褐纹病菌菌株pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2的载孢体和分生孢子形态（图中，a为pvvl
‑
12，b为pvvl
‑
13，c为pvvl
‑
2）；图5为实施例4中茄子褐纹病菌8个菌株rrna
‑
itspcr电泳图（图中，泳道从左至右依次为pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622、pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2、marker）；图6为实施例4中茄子褐纹病菌8个菌株its序列比对保守区（图中，从上至下依次为pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622、pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2的保守区）；图7为实施例4中茄子褐纹病菌遗传进化分析结果；图8为实施例5中采用十字交叉法测定对峙培养的茄子褐纹病菌的生长照片。
具体实施方式
18.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
19.实施例1芽孢杆菌的分离纯化、初步鉴定1、方法：从不同地区采集土壤样品，利用土壤稀释法将样品涂布在含淀粉培养基，37℃培养1
‑
3d，观察菌落的形态特征。挑取灰白色边缘波纹状的疑似菌落接种于bpy琼脂平板上，37℃纯培养48h。利用革兰氏染色、接触酶反应、v
‑
p反应、淀粉酶反应初步鉴定细菌的分类。
20.具体地，将10%过氧化氢直接注入斜面，观察是否产生气泡。有气泡为阳性反应，无为阴性反应。
21.具体地，取分离菌培养液和40%naoh等量混合均匀，加少许肌酸(约0.5
‑
1.0mg)
后，剧烈摇晃，2
‑
10min后观察是否出现红色，若出现红色则为v
‑
p阳性反应。
22.具体地，取分离菌培养液加入淀粉生化试管中，置于30℃恒温培养中培养24h后，向淀粉生化管中滴加碘液，变蓝为阴性反应，不变蓝为阳性反应。
23.2、结果利用土壤稀释法获得菌株菌落表面粗糙不透明，白色或微黄色，在生长的下部形成盘状，淡红色系。
24.通过菌落形态、革兰氏染色反应、接触酶反应、v
‑
p反应、淀粉酶反应等初步判断获得菌株为芽孢杆菌。
25.实施例2芽孢杆菌16s
‑
rdna序列扩增及分析1、方法：利用初步鉴定获得的芽孢杆菌菌株，接种于lb液体培养基中，于37℃恒温培养箱培养，200rpm/min摇床培养24h。然后吸取菌液进行离心，反复进行直到产生一定的沉积物，利用细菌dna提取试剂盒（omega）提取芽孢杆菌总dna。
26.利用细菌16srna序列扩增引物对提取的芽孢杆菌总dna进行pcr扩增，获得的产物进行序列测定。测序结果通过blast进行同源性比对。
27.细菌16srna序列扩增引物包括eubac27f与eubac1492r；其中，引物eubac27f的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体为：5
’‑
agagtttgatcctgcctcag
‑3’
；其中，引物eubac1492r的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体为：5
’‑
ggataccttgttacgactt
‑3’
。
28.将枯草芽孢杆菌的测序结果在ncbi网站上进行序列比对，找出与待测菌株的dna片段序列最接近的序列，下载保存对应的dna序列，并记录菌株的学名和基因登记序列号。采用mega6构建发育树，根据系统发育树的构建结果来进一步确定各待测菌株的分类地位。
29.2、结果：以提取菌株的基因组dna为模板，用细菌16s
‑
rdna引物进行扩增，pcr产物进行跑胶检测，根据marker的相对位置初步判断待测目的片段的大小，部分待测菌株pcr产物的凝胶电泳检测结果如图1所示，pcr扩增获得的dna片段长度750
‑
1500bp之间，与细菌16srdna的目的片段长度相似。
30.通过blast比对，分离获得的7个菌株为芽孢杆菌（bacillussp.），利用dnaman比对发现7个中有一个完全保守的区域和一个相对较长的比较保守区域，而且这两个保守区域与ncbi上传的其他芽孢杆菌序列相同（如图2所示）。
31.通过建树获得7个芽孢杆菌的遗传进化关系（如图3所示）。ku
‑
52、ku
‑
53进化上属同枝，同源性达到98.55%；ku
‑
25、ku
‑
42进化上属同枝，同源性达到96.07%；ku
‑
34、ku
‑
81进化上属同枝，同源性达到96.51%（如图3a）。如图3b，只有ku
‑
25与ncbi上传序列遗传进化上较近，其他6个菌株同源性相差较远。
32.实施例3茄子褐纹病菌的分离培养、活化及形态学鉴定1、方法：从田间采集具有典型茄子褐纹病特点的病组织，利用组织分离法分离菌株（参考文献：李艳青等，山东寿光茄子褐纹病病原鉴定及药效试验[j].北方园艺,2017(9):106
‑
110）。在无菌的操作台中进行pda平板上接种，接种时要注意接完一个菌，就要对
接种针进行一次灭菌，后放在25℃电热恒温培养箱中，7
‑
14d后长出菌落。
[0033]
挑取分生孢子器置于载玻片上，并通过挤压使得分生孢子释放，并在光学显微镜下观察。根据周永力等在1998年发表文章《球壳孢目真菌个体发育研究ⅰ:壳二胞等四属》中关于phomopsis的描述，参照真菌鉴定手册（魏景超,1979）及中国真菌志（戚佩坤等,2007），观察褐纹病发生症状、菌落形态、分生孢子器和分生孢子的形态、大小、埋生情况及颜色，鉴定病菌为phomopsisvexans。并利用照相显微镜（奥林巴斯）进行分生孢子照片采集。
[0034]
2、结果通过对田间病叶样品的分离获得三个茄子褐纹病菌菌株pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2。结果如图4所示，图4中的a、b、c依次对应pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2。病菌在pda上菌落生长良好，菌丝乳白色，生长密集，有轮纹形状，边缘整齐，产生载孢体及分生孢子，初步判定为茄子褐纹病病菌。
[0035]
菌株pvvl
‑
12产生α、β型分生孢子，α型分生孢子具两个油球,产生量较少，β型分生孢子呈细线形，且在一端弯曲成钩，产生量较大。载孢体较小（<1cm）、黑褐色、表生（如图4a），产生的载孢体量较多。
[0036]
pvvl
‑
13、pvvl
‑
2菌株均产生α型分生孢子，具1
‑
2个油球（如图4b、c）。但其载孢体形态、大小及产生时间不同。相同培养时间、培养条件下pvvl
‑
13菌株α型分生孢子量较大，载孢体小（<1cm）、黑褐色、半埋生或表生、产生载孢体量较多（如图4b）。pvvl
‑
2菌株α型分生孢子产生量较少，分生孢子器较大（1
‑
2cm），黑褐色、半埋生（如图4c）。
[0037]
实施例4茄子褐纹病菌its序列的扩增、分析1、方法对实施例3获得的茄子褐纹病菌pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2以及pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622its序列的扩增、分析。
[0038]
pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622的分离鉴定见参考文献：李艳青,赵玉翠,潘好芹.山东寿光茄子褐纹病病原鉴定及药效试验[j].北方园艺,2017(9):106
‑
110。
[0039]
进行利用活化好的茄子褐纹病菌菌株及分离得到的菌株，刮取菌丝，利用振荡器充分研磨，利用植物总dna提取试剂盒（全式金）提取茄子褐纹病菌总dna。
[0040]
利用拟茎点霉属真菌5.8sr
‑
rna序列引物its1与its4（参考文献：jayaramaiahkm,mahadevakumars,charithrajap,janardhanagr.pcrbaseddetectionofphomopsisvexans(sacc.&syd.)
‑
thecausativeagentofleafblightandfruitrotdiseaseofbrinjal(solanummelongenal.)[j].internationaljournaloflifesciences,2013,7(1):17
‑
20），对已分离获得的茄子褐纹病菌rrna
‑
its区域进行pcr扩增。pcr产物进行测序后进行blast（ncbi）比对分析。
[0041]
其中，引物its1的核苷酸序列seqidno.3所示，具体为：5
’‑
cggatctcttggttctgg
‑3’
；其中，引物its4的核苷酸序列seqidno.4所示，具体为：5
’‑
gacgctcgaacaggcatgcc
‑3’
。
[0042]
将茄子褐纹病的测序结果进行blast比对分析，找出与待测菌株的dna片段序列最
接近的，把对应的dna序列下载保存，并记录菌株的学名和基因登记序列号。构建发育树，按照构建结果来进一步确定各待测菌株的进化关系。
[0043]
2、结果以提取菌株的基因组dna为模板，用rrna
‑
its引物进行扩增，pcr产物进行跑胶鉴定，根据marker的相对位置初步判断待测目的片段的大小，部分待测菌株pcr产物的凝胶电泳检测结果如图3所示。pcr扩增获得的dna片段长度500
‑
750bp之间，与真菌rdna
‑
its的目的片段长度相似。茄子褐纹病菌8个菌株rrna
‑
itspcr电泳图见图5。图5中，泳道从左至右依次为pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622、pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2、marker。
[0044]
通过blast比对，pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622、pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2有性态属于茄间座壳菌（diaporthevexans），无性态属于茄褐纹拟茎点霉（phomopsisvexans）。可以判定这8个菌株是茄子褐纹病菌，且无性态属于茄褐纹拟茎点霉，有性态属于茄间座壳菌。通过dnaman比对发现3段比较保守区域，且这3个保守区与ncbi上传的diaporthevexans及phomopsisvexans序列保守区相同。上述8个菌株的its序列比对保守区见图6。图6中，从上至下依次为pvvl
‑
3、pvvl
‑
5、pvvl
‑
211、pvvl
‑
621、pvvl
‑
622、pvvl
‑
12、pvvl
‑
13、pvvl
‑
2的保守区。
[0045]
通过建树，确定这8个菌株的进化关系。如图7a，pvvl
‑
5、pvvl
‑
211的遗传关系最近，同源性达到98.20%；其他菌株同源性差异较大；pvvl
‑
622在遗传进化上关系最远。如图7b，pvvl
‑
621、pvvl
‑
13进化关系较近；pvvl
‑
622、pvvl
‑
12进化上属于同一进化枝，但差异性较大。pvvl
‑
5与kf994977.1同源性较近；pvvl
‑
2与kt864239.1同源性较近，blast比对时主要通过这2个序列确定pvvl
‑
5及pvvl
‑
2属。
[0046]
实施例5枯草芽孢杆菌对茄子褐纹病防治测定1、方法利用前述获得的菌株，采用菌丝生长抑制法对其进行抑菌测定。
[0047]
在pda平板上利用十字法打孔，打四个孔，中心点到孔的距离为2.5cm；打孔部位培养基饼取出。在板的中心接种茄子褐纹病菌饼（0.5cm），四个孔内接种枯草芽孢杆菌菌液，做3次重复试验。设置空白对照。5
‑
7d后，利用十字交叉法测量茄子褐纹病菌饼的长度，并对数据进行计算分析。
[0048]
2、采用十字交叉法测定对峙培养的茄子褐纹病菌的生长，从前述分离出的芽孢杆菌中筛选出一株枯草芽孢杆菌ku
‑
42，经上述实验证明，获得了对茄子褐纹病菌的高效、广谱抑制作用，可应用于茄子褐纹病的防治，结果如表1和图8所示。该菌株经中国典型培养物保藏中心的鉴定，分类为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。图8为ku
‑
42对pvvl
‑
622的对峙培养照片，标注ck的培养皿为空白对照。
[0049]
表1枯草芽孢杆菌ku
‑
42对茄子褐纹病菌的抑菌作用（p<0.05）
通过表1可见，本发明分离鉴定的枯草芽孢杆菌ku
‑
42对8个菌株防治效果均超过50%，可应用于茄子褐纹病菌的防治。
[0050]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。