蜱传脑炎病毒衣壳蛋白C原核表达载体、重组菌株及其应用的制作方法

structural view[j].viruses,2018,10(7):350.；pukhovskaya n m,morozova o v,vysochina n p,et al.tick
‑
borne encephalitis virus in arthropod vectors in the far east of russia[j].ticks&tick
‑
borne diseases,2018,9(4).；zhang z，rong l,liy p.flaviviridae viruses and oxidative stress:implications for viral pathogenesis[j].oxidative medicine and cellular longevity,2019,2019:1
‑
17.)。
[0003]
黄病毒属整个家族的衣壳蛋白，相对分子质量约为12000，不同黄病毒的衣壳蛋白在氨基酸序列上同源性很低，在结构上具有一定的保守性，功能上具有多样性和灵活性，是病毒生命周期中必不可少的(tan t y,fibriansah g,kostyuchenko v a,et al.capsid protein structure in zika virus reveals the flavivirus assembly process[j].nature communications,2020,11(1).)。参与病毒核衣壳的组装是c蛋白的重要生物学功能，而且c蛋白对于病毒的复制、病毒与宿主细胞的相互作用甚至病毒的致病性都具有重要意义(mandl c w.flavivirus immunization with capsid
‑
deletion mutants:basics,benefits,and barriers.[j].viral immunology,2004,17(4):461.；poonsiri t,wright g s a,solomon t,et al.crystal structure of the japanese encephalitis virus capsid protein[j].viruses,2019,11(7).)。有研究表明，通过原核表达的方法可将yfv及denv的c蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，进一步讨论了黄病毒衣壳蛋白的结构以及功能(malx,jones c t,groesch t d,et al.solution structure of dengue virus capsid protein reveals another fold[j].proceedings of the national academy of sciences,2004,101(10).；byk l a,gamarnik a v.properties and functions of the dengue virus capsid protein[j].annual review of virology,2016,3(1):annurev
‑
virology
‑
110615
‑
042334.；schrauf s,mandl c w，bell
‑
sakyil,et al.extension of flavivirus protein c differentially affects early rna synthesis and growth in mammalian and arthropod host cells[j].journal of virology,2009.)。
[0004]
目前，商品化的森林脑炎抗体检测试剂盒中，抗原的使用均为全病毒或重组包膜e蛋白成分，以其制备的抗体检测试剂对黄病毒属病毒血清抗体检测特异性差，用于临床诊断、流行病学调查等辅助检测效果不佳。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体、重组菌株及其应用；本发明以tbev“森张”株衣壳蛋白为研究对象，构建原核表达载体pet
‑
32a
‑
c，在大肠杆菌表达系统中诱导表达c蛋白，鉴定其与tbev全病毒血清多克隆抗体的特异性反应；应用以重组c蛋白为包被抗原的间接elisa法，检测临床血清，初步评价其在tbev抗体检测上的应用价值，为tbe疾病诊断、血清流行病学调查及病毒蛋白研究奠定基础。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007]
本发明提供了蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体，包括初始载体和编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因。
[0008]
优选的，所述编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因连接在载体pet
‑
32a( )的bamhⅰ和salⅰ酶切位点之间。
[0009]
优选的，所述编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因的核苷酸序列如seq id no.1所
示。
[0010]
本发明提供了一种表达蜱传脑炎病毒衣壳蛋白的重组菌株，通过将所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体转化宿主细胞感受态获得。
[0011]
优选的，所述宿主细胞包括大肠杆菌bl21(de3)。
[0012]
本发明提供了一种蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
1)以森林脑炎病毒总rna反转录后的cdna为模板，进行pcr扩增获得编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因；
[0014]
2)将扩增获得的编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因插入到载体pet
‑
32a( )的bamhⅰ和salⅰ酶切位点之间获得原核表达载体；
[0015]
3)将所述原核表达载体转入宿主细胞进行诱导表达获得蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c。
[0016]
优选的，步骤1)中所述pcr扩增所用的引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq idno.3所示。
[0017]
本发明还提供了所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体或所述的重组菌株制备的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c在制备蜱传脑炎病毒感染血清学检测用试剂中的应用。
[0018]
本发明提供了一种诊断蜱传脑炎的试剂盒，包括所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体或所述的重组菌株制备的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c。
[0019]
优选的，所述试剂盒还包括elisa检测试剂。
[0020]
本发明的有益效果：本发明提供的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体经诱导表达，表达的目的蛋白(蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c)经western blot检测与tbev全病毒血清多克隆抗体检测，具有良好的反应原性；并以蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c为包被抗原，采用间接elisa方法测定了多份临床血清，测定结果显示本发明所述制备方法制备获得的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c用于tbev感染血清学检测具有较高特异性，并且与jev交叉反应低，表明了本发明所述制备方法制备获得的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c能够作为tbev特异性抗体检测候选抗原。
附图说明
[0021]
图1为不同黄病毒衣壳蛋白c多序列比对结果；
[0022]
图2为tbev c基因扩增鉴定，其中m：dna marker dl2000；1
‑
5：tbev c的pcr扩增产物；
[0023]
图3为重组质粒pet
‑
32a
‑
c的酶切鉴定，其中m：dna marker dl5000；1
‑
6：重组质粒pet
‑
32a
‑
c经bamhⅰ和salⅰ双酶切的产物；
[0024]
图4为tbev c蛋白sds
‑
page分析，其中m：蛋白marker；1.未诱导全菌体；2.诱导全菌体；
[0025]
图5为表达产物pet
‑
32a
‑
c的sds
‑
page鉴定，其中m：蛋白marker；1.未诱导全菌体；2.诱导全菌体；
[0026]
图6为亲和层析洗脱曲线图，其中1.流穿峰；2.20mol/l咪唑洗脱峰；3.200mol/l咪唑洗脱峰；4.500mol/l咪唑洗脱峰；
[0027]
图7为纯化产物的sds
‑
pagea分析，其中m:蛋白marker；1.未诱导菌体；2.诱导后全
菌体；3.纯化后的重组蛋白；
[0028]
图8为纯化产物纯度分析图；
[0029]
图9为重组蛋白的western blot鉴定，其中m:蛋白marker；1.未诱导菌体；2.诱导后全菌体；3.超声破碎后上清；4.超声破碎后沉淀；5.纯化后的重组蛋白。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体，包括初始载体和编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因。在本发明中，所述编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因优选连接在载体pet
‑
32a( )的bamhⅰ和salⅰ酶切位点之间。
[0031]
在本发明中，所述编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示：5
’‑
atgaaggccattctgaaaggaaaggggggcggtccccctcgacgagtgtcgaaagagaccgcgaggaagacgcgtcaatctagggtccaaatgccaaatggactcgtgttgatgcgcatgttggggattttatggcatgccgtggccggcaccgctagaagtcccgtgttgaagtctttctggaattcagtcccactgaaacaggccatggcagcactccggaaaattaaaaaggcagtgagcaccctgatggtaggtttgcaaagacgtggcaaaagaaggtcagcagcagactggacaagttggtaa
‑3’
。在本发明中，所述载体pet
‑
32a( )采用本领域市售产品即可。本发明对所述蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的酶切、连接的方法即可。
[0032]
本发明提供了一种表达蜱传脑炎病毒衣壳蛋白的重组菌株，通过将所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体转化宿主细胞感受态获得。在本发明中，宿主细胞优选为大肠杆菌bl21(de3)；本发明对所述大肠杆菌bl21(de3)的来源和制备方法没有特殊限定，采用本领域市售菌株即可。本发明对所述转化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转化方法即可。本发明在所述转化后，优选的还包括阳性克隆的筛选步骤，所述阳性克隆的筛选优选的通过将转化后的细胞在氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基上培养实现，所述氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基中氨苄青霉素的浓度优选为50μg/ml。在本发明中，能够在氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基中生长的克隆即为阳性克隆；本发明在筛选获得阳性克隆后，将所述阳性克隆接种于氨苄青霉素lb液体培养基中进行培养，然后诱导表达。
[0033]
本发明提供了一种蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的制备方法，包括以下步骤：1)以森林脑炎病毒总rna反转录后的cdna为模板，进行pcr扩增获得编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因；2)将扩增获得的编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因插入到载体pet
‑
32a( )的bamhⅰ和salⅰ酶切位点之间获得原核表达载体；3)将所述原核表达载体转入宿主细胞进行诱导表达获得蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c。
[0034]
在本发明中，以森林脑炎病毒总rna反转录后的cdna为模板，进行pcr扩增获得编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因。在本发明中，优选的在符合要求的生物安全环境中，用rna提取试剂盒提取森林脑炎病毒总rna，将其反转录为cdna。在本发明中，所述rna提取试剂盒优选为杭州博日科技有限公司simply p总rna提取试剂盒(货号：bsc52s1)。在本发明中，所述森林脑炎病毒优选的为长春生物制品研究所有限责任公司森林脑炎病毒灭活疫苗株“森张株”。在本发明中，所述反转录试剂优选为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为ae301
‑
3，在本发明中，所述pcr扩增所用的引物优选如seq id no.2和seq idno.3所示，seq id no.2：5
’‑
taggatccatgaaggccattctgaaaggaaa
‑3’
；seq id no.3：5
’‑
ctgtggacttaccaacttgtccagtctgc
‑3’
。在本发明中，所述pcr扩增的体系以50μl计，优选的包括以下组分：cdna模板1μl，10μm如seq id no.2和seq idno.3所示引物各1μl，5
×
fastpfu buffer 10μl，2.5mm的dntp 4μl，fastpfu dna聚合酶1μl和ddh2o 32μl。所述pcr的程序优选如下：95℃预变性2min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。本发明在所述pcr扩增结束后，优选的采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物；若出现目的大小的电泳条带则认为pcr扩增成功。
[0035]
本发明将扩增获得的编码蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c的基因插入到载体pet
‑
32a( )的bamhⅰ和salⅰ酶切位点之间获得原核表达载体。在本发明中，优选的将上述步骤获得的pcr扩增产物与载体pet
‑
32a( )分别进行双酶切后连接获得原核表达载体。在本发明中，所述双酶切采用bamhⅰ酶和salⅰ酶进行。在本发明中，所述双酶切的条件优选为37℃，30min。本发明在所述双酶切后优选的将所述双酶切获得的酶切基因片段和酶切载体进行连接，在本发明中，所述连接优选的采用t4dna连接酶，所述连接的条件为16℃，10～14h。本发明在获得连接产物后，优选的将所述连接产物转入感受态细胞中进行筛选和验证。在本发明中，优选的将连接产物转化至trans1
‑
t1 phage resistant感受态细胞。在本发明中，所述筛选优选的采用经氨苄青霉素抗性(50μg/ml)选择培养基进行培养，能够生长的单菌落即为阳性克隆，本发明在获得阳性克隆后，优选的挑取阳性单克隆菌落，并进行菌落pcr鉴定、bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。本发明对所述菌落pcr鉴定、bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的鉴定方法即可。在本发明中，优选的将鉴定正确的原核表达载体，送至生物测序公司进行测序，测序正确的命名为原核表达载体pet
‑
32a
‑
c。
[0036]
在本发明中，将所述原核表达载体转入宿主细胞进行诱导表达获得蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c。本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。在本发明中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。本发明在所述转化后，优选的还包括阳性克隆的筛选步骤，所述阳性克隆的筛选优选的通过将转化后的细胞在氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基上培养实现，所述氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基中氨苄青霉素的浓度优选为50μg/ml。在本发明中，能够在氨苄青霉素抗性的固体琼脂培养基中生长的克隆即为阳性克隆；本发明在筛选获得阳性克隆后，将所述阳性克隆接种于氨苄青霉素lb液体培养基中进行培养，然后诱导表达。在本发明中，所述培养的条件优选为36～38℃，180～220rpm，更优选为37℃，200rpm；在本发明中，所述诱导表达优选的通过添加iptg实现，优选的当培养的菌液的a
600
＝0.6～0.8时，添加iptg；所述iptg的终浓度优选为0.4～0.6mmol/l，更优选为0.5mmol/l；所述诱导表达的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述诱导表达的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。在本发明中，优选的采用sds
‑
page电泳鉴定诱导表达的蛋白。在本发明中，优选的还包括目的蛋白的纯化和目的蛋白的western blot鉴定；所述目的蛋白的纯化优选的采用scg纯化系统进行镍离子金属螯合亲和层析实现；本发明对所述western blot鉴定的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的western blot鉴定步骤即可。
[0037]
本发明还提供了所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体或所述的重组菌株制备的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c在制备蜱传脑炎病毒感染血清学检测用试剂中的应用。蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c用于tbev感染血清学检测具有较高特异性，并且与jev交叉反应低能够作为tbev特异性抗体检测候选抗原。
[0038]
本发明提供了一种诊断蜱传脑炎的试剂盒，包括所述的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c原核表达载体或所述的重组菌株制备的蜱传脑炎病毒衣壳蛋白c。
[0039]
在本发明中，所述试剂盒还包括elisa检测试剂。本发明对所述elisa检测试剂没有特殊限定，采用本领域常规的elisa检测试剂即可。
[0040]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0041]
实施例1
[0042]
质粒、菌株及病毒
[0043]
质粒pet
‑
32a( )购买自库美生物技术有限公司；大肠杆菌trans1
‑
t1 phage resistant和bl21(de3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；森林脑炎病毒“森张株”购自长春生物制品研究所有限责任公司，且在申请号为201110309442.0的专利中已公开。
[0044]
主要试剂及仪器
[0045]
限制性内切酶bamhⅰ、salⅰ、t4 dna连接酶、fastpfudna聚合酶、总rna提取试剂盒及质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；凝胶回收试剂盒购自日本takara公司；hrp标记的小鼠抗人igg购自武汉科源安博生物技术有限公司；hrp标记的山羊抗小鼠igg购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强型dab显示试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ni
‑
nta亲和层析填料购自美国ge公司。
[0046]
pcr仪、免疫印迹设备、凝胶成像分析仪及全自动酶标仪均购自bio
‑
rad(美国)公司；电泳仪购自北京六一公司；恒温摇床购自new brunswick scientific公司；高压均质机购自美国ats公司；scg纯化系统购自苏州赛普仪器公司。
[0047]
黄病毒c蛋白氨基酸序列比对
[0048]
利用dnaman软件，比对genbank上登录的tbev“森张”株(afj97025.1)c蛋白氨基酸序列与黄病毒属jev(aaa21436.1)、denv(np
‑
739591.2)、yfv(ago04419.1)及wnv(np
‑
776010.1)c蛋白氨基酸序列，分析黄病毒c蛋白氨基酸序列的一致性。
[0049]
引物设计与合成
[0050]
在genbank中查找tbev“森张”株基因序列(jq650523.1)，应用primer premier5.0软件，设计tbevc基因引物，上游引物序列：5
’‑
taggatccatgaaggccattctgaaaggaaa
‑3’
(seq id no.2；下划线部分为bamhⅰ酶切位点)，下游引物序列：5'
‑
ctgtcgacttaccaacttgtccagtctgc
‑
3'(seq id no.3；下划线部分为salⅰ酶切位点)，扩增片段大小约为309bp(5
’‑
atgaaggccattctgaaaggaaaggggggcggtccccctcgacgagtgtcgaaagagaccgcgaggaagacgcgtcaatctagggtccaaatgccaaatggactcgtgttgatgcgcatgttggggattttatggcatgccgtggccggcaccgctagaagtcccgtgttgaagtctttctggaattcagtcccactgaaacaggccatggcagcactccggaaaattaaaaaggcagtgagcaccctgatggtaggtttgcaaagacgtggcaaaagaaggtcagcagcagactggacaagttggtaa
‑3’
)。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。
[0051]
目的基因的扩增
[0052]
在符合相关要求的生物安全环境中，利用rna提取试剂盒提取森林脑炎病毒总rna，将其反转录为cdna(具体反应条件为：使用试剂盒随机引物进行反转录反应，25℃，10min；42℃，15min；85℃，10s，4℃保存备用)，并以其为模板进行pcr扩增。pcr反应体系为
50μl：cdna模板1μl，上、下游引物各1μl(10μm)，5
×
fastpfu buffer 10μl，2.5mm的dntp 4μl，fastpfu dna聚合酶1μl，补ddh2o32μl。pcr反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。
[0053]
重组表达质粒的构建
[0054]
胶回收鉴定正确的pcr产物与载体pet
‑
32a( )，分别经限制性内切酶bamhⅰ和salⅰ双酶切，回收目的基因片段及载体片段，以t4dna连接酶于16℃连接过夜；连接产物转化至trans1
‑
t1 phage resistant感受态细胞，经氨苄青霉素抗性(50μg/ml)选择培养，挑取单克隆菌落，并进行菌落pcr鉴定，将阳性克隆菌，提取质粒，进行bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，测序正确的重组表达质粒命名为pet
‑
32a
‑
c。
[0055]
重组蛋白的诱导表达
[0056]
将重组表达质粒pet
‑
32a
‑
c转化e.colibl21(de3)感受态细胞，具体步骤为：在1.5ml ep管中将pet
‑
32a
‑
c重组质粒和100μl感受态细胞混匀，冰浴20min；42℃，热激90s；插入冰浴中10min，然后加入lb培养基，37℃，200rpm，振摇45min；2000g离心10min，弃去上清，将菌体沉淀悬匀后，涂布于含有氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的固体琼脂培养平板上培养过夜，筛选阳性克隆，接种于氨苄青霉素lb液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1％的接种量，转接至200ml液体培养基中培养，当a
600
＝0.8时，加入终浓度为0.5mmol/l iptg诱导表达，诱导温度为25℃，转速为200rpm，过夜诱导表达目的蛋白，sds
‑
page电泳鉴定蛋白表达。
[0057]
目的蛋白的纯化
[0058]
将诱导表达的菌液，4℃，8000rpm，离心30min，收集菌体沉淀，按1：10(w/v)比例加入20mm/l tris
‑
cl(ph 10.0)重悬菌体，800bar条件下均质3次；将均质破碎后的菌液8000rpm，离心30min，分别收集上清和沉淀进行sds
‑
page鉴定。收集含有目的蛋白的上清液，用0.45μm滤膜抽滤，收集滤液。采用scg纯化系统进行镍离子金属螯合亲和层析纯化，经4个体积20mm/l tris
‑
cl(ph 10.0)平衡ni
‑
nta介质，上样流速为1ml/min，分别用含20mm、200mm、500mm咪唑的洗脱液梯度洗脱目的蛋白，经sds
‑
page鉴定，应用image lab3.0软件分析，条带检测灵敏度设置为25。
[0059]
重组蛋白的western blot鉴定
[0060]
纯化后的重组c蛋白经12％sds
‑
page分离蛋白后，转至pvdf膜，用10％脱脂牛奶封闭1h，pbst洗涤3次；加入tbev全病毒小鼠血清多克隆抗体(1：1000稀释)，室温孵育2h，pbst洗涤3次；加入hrp标记的山羊抗小鼠igg(1:5000稀释)，室温孵育1h，pbst洗涤5次，dab显色。
[0061]
间接elisa法测定临床血清
[0062]
用纯化后的重组c蛋白包被酶标板，5μg/ml，4℃包被过夜；加入含10％小牛血清的pbs，200μl/孔，4℃封闭16h。加入待检临床血清，10份tbe阳性临床血清来源于黑龙江森工总院、10份je阳性临床血清来源于成都生物制品研究所有限责任公司，及20份阴性对照临床血清(黑龙江森工总院)，100μl/孔，37℃孵育1h；用pbst洗涤3次，加入hrp标记的小鼠抗人igg(1：8000稀释)，100μl/孔，37℃孵育30min；用pbst洗涤5次，加入tmb底物，100μl/孔，
37℃孵育15min显色；加入终止液，50μl/孔，终止反应；用酶标仪测定a
450
值。
[0063]
实验结果
[0064]
黄病毒c蛋白氨基酸序列比对结果
[0065]
dnaman软件比对结果显示，tbev c蛋白氨基酸序列与jev、denv、yfv及wnv的氨基酸序列一致性分别为14.84％、9.38％、17.19％、14.06％，如图1所示，表明黄病毒属病毒种间c蛋白氨基酸序列具有较高的保守性，用于检测特异性高。
[0066]
目的基因pcr产物的鉴定
[0067]
tbev c基因的pcr产物片段，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约为300bp的目的基因条带，大小与理论值相符，见图2。
[0068]
重组表达质粒的鉴定
[0069]
重组表达质粒pet
‑
32a
‑
c菌落pcr结果可见约为300bp特异条带，大小与理论值相符，提取菌落pcr阳性克隆菌的质粒，进行bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定，经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见约为300bp目的基因片段和5900bp的载体基因片段，见图3所示；大小与预期相符，测序结果比对正确，表明重组质粒构建正确。
[0070]
表达产物的鉴定
[0071]
收集iptg诱导菌体，经离心，煮沸破菌后，进行sds
‑
page分析。结果显示，重组菌体25℃诱导过夜后，与诱导前相比重组菌在分子量约30000处有明显蛋白表达条带，大小与理论值一致，如图4所示。
[0072]
纯化产物的鉴定
[0073]
诱导后的重组菌体进行超声破碎，sds
‑
page结果显示超声破碎菌体上清和沉淀均可见目的蛋白条带，且可溶性表达水平明显高于包涵体形式，见图5。将可溶表达的上清液，经镍亲和层析进行纯化，200mm咪唑洗脱峰，含有目的蛋白，见图6。经sds
‑
page鉴定纯化的蛋白分子量约30000，大小与理论值相符，见图7；纯度为90.6％，见图8。
[0074]
重组蛋白的western blot鉴定
[0075]
纯化后的重组蛋白western blot结果显示，在分子量约30000处目的蛋白与tbev全病毒小鼠血清多克隆抗体反应，且无非特异性条带出现，说明纯化后的重组蛋白与森林脑炎病毒具有良好的一致性和反应原性，如图9所示。
[0076]
间接elisa法临床血清检测结果
[0077]
将重组c蛋白作为包被抗原测定10份tbe血清中阳性9份，阴性1份，敏感度90％；检测10份je血清中10份为阴性，20份阴性临床血清样本中19份为阴性，特异性96.7％。
[0078]
表1 c蛋白包被间接elisa法检测血清结果
[0079][0080]
通过dnaman软件分析比对黄病毒属c蛋白的氨基酸一级序列结构显示，衣壳蛋白
氨基酸序列存在较高种间保守性。因此，本发明构建tbev衣壳蛋白原核表达重组质粒，诱导表达，western blot检测与tbev全病毒血清多克隆抗体具有良好的反应原性；并以c蛋白为包被抗原，采用间接elisa方法测定了多份临床血清，测定结果显示其用于tbev感染血清学检测具有较高特异性，并且与jev交叉反应低，表明了衣壳c蛋白可以作为tbev特异性抗体检测候选抗原。
[0081]
综上所述，森林脑炎病毒重组c蛋白，具备良好的特异性和反应原性，可作为森林脑炎病毒抗体检测的一种特异性候选抗原，为森林脑炎及其它黄病毒感染临床血清学辅助诊断检测试剂的开发提供一种新的思路。
[0082]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。