一种Au-Pd/wtE.coli纳米材料的代谢组学分析方法与流程

一种au
‑
pd/wte.coli纳米材料的代谢组学分析方法
技术领域
1.本发明涉及纳米材料制备及代谢组学分析领域，特别是涉及一种 au
‑
pd/wte.coli纳米材料的代谢组学分析方法。


背景技术：

2.代谢组学作为一种具有典型特征和显著优势的现代检测和分析技术，其内在相关原理和实际应用目前已引起了研究者们的巨大的关注。该技术在揭示体内代谢过程与生命行为等领域显示出了显著优势，同时基于现代代谢组学的进一步技术创新和发展的研究也已经持续了多年且成果丰硕。目前代谢组学已成功实现了对数千种代谢物小分子(<1500da)结构和含量的检测分析，揭示了它们与生物体的固有联系。
3.由于代谢组学所具有的表型的生物相容性、高通量分析过程、低廉的检测成本和信息丰富的分析结果等优势，其已被广泛用于微生物，细胞，植物，哺乳动物和环境等各类生命体系，考察生命体内的代谢变化规律。同时，代谢组学在毒理学评价，新药物开发，临床诊断，疾病治疗，食品安全和环境化学等研究领域也取得了许多前沿而有意义的结果。
4.近期基于代谢组学的相关研究主要集中于技术改进和新型研究领域的开发，这对代谢物检测种类与灵敏度的发展提出了更高的要求。为了实现这一目标，将现代分析技术与化学计量学统计软件相结合的新型代谢组学研究平台成功实现了代谢物的有效检测以及后续数据的整合处理，并根据所得结果总结了内源性和异源性代谢过程。在现有的检测手段中，液相色谱
‑
质谱 (lc
‑
ms/ms)和解吸电喷雾电离
‑
离子化质谱成像(desi
‑
msi)技术成为了代谢组学研究的强大工具，二者兼具高灵敏度，样品处理简单，覆盖范围广，时间短等优点，在不同生物模型上实现了数千种代谢物的同时检测并被广泛利用。目前基于lc
‑
ms/ms，desi
‑
msi和数据统计软件的组学分析平台已被广泛用于联用代谢组学研究。该新型组学分析平台将为未来生命体内在变化的研究与技术优化发挥重要作用，为联用代谢组学的实际应用和技术改进提供了宝贵的理论与实践参考。然而，该联用平台与其他研究领域(如新型纳米材料)的进一步合作以进行更深层次的探索仍然是要解决的巨大挑战。
5.纳米材料是一类纳米尺度的新材料，由于其特殊的结构和尺寸而具有各种独特的性能。au
‑
pd核壳纳米颗粒在催化、生物、医疗和新能源等领域中有着广泛的应用。其中，通过细菌合成的au
‑
pd核壳纳米颗粒具有出色的协同作用和可修饰性，已成功应用于多个生物医学领域，光热治疗，生物催化，仿生酶，免疫传感，体内检测和抗菌作用。然而，在目前的研究中“生物体
ꢀ‑
au
‑
pd核壳纳米颗粒”相互作用体系的内在干预过程和分子机理仍然不清楚。而为了在生物医疗领域更好地对au
‑
pd核壳纳米颗粒进行应用，或者为优化筛选au
‑
pd核壳纳米颗粒的合成方法提供依据，人们通常需要根据au
‑
pd核壳纳米颗粒的应用场景针对性地研究“生物体
‑
au
‑
pd核壳纳米颗粒”相互作用体系的内在干预过程和分子机理。其中需要研究的问题包括不同生物体系(组织细胞不同)和不同条件下(比如温度、纳米材料的用量)下，au
‑
pd 核壳纳米颗粒对代谢通路的影响。针对该问题，代谢组学分析技术是一种非常好的选择。
6.然而，在代谢组学研究中，其中一个难题是如何从生物样品中分离出各种代谢物并进行有效的检测。通常，生物体的代谢产物化学成分复杂，且各种待分析的目标化合物存在多种杂质干扰，因而在进行检测前，通常需要特定的方法对生物样品进行处理和提取。且lc
‑
ms/ms、desi
‑
msi等检测条件也应当根据待检测目标代谢物的种类和含量进行设计。
7.目前对于au
‑
pd核壳纳米颗粒与生物体的相互作用认识还很少，其相互作用体系的内在干预过程和分子机理仍然不清楚的情况下，无法根据待检测的目标代谢物确定代谢组学分析方法中生物样品的处理条件、提取条件及检测条件。


技术实现要素：

8.针对现有技术中的问题，本发明提供一种au
‑
pd/wte.coli纳米材料的代谢组学分析方法。其目的在于：提供优选的生物样品的处理条件、提取条件及检测条件，使其适用于au
‑
pd/wte.coli纳米材料与生物体相互作用体系的代谢组学研究。为后续au
‑
pd/wte.coli纳米材料的合成条件优化、结构改进、改性与临床应用研究提供新的研究方法。
9.一种au
‑
pd/wte.coli纳米材料的代谢组学分析方法，所述方法包括以下步骤：
10.(1)对生物样品进行desi
‑
msi扫描，得到水溶性代谢物和脂溶性代谢物的desi
‑
msi检测结果；所述动物模型为给予了au
‑
pd/wte.coli纳米材料的动物模型；
11.其中，desi
‑
msi检测条件包括：正模式下，电压为4.5～5kv；负模式下，电压为
‑
4.5～
‑
5kv；空间分辨率为50～100μm；溶剂喷雾组成为90～95％甲醇水溶液；
12.(2)对所述desi
‑
msi检测结果进行空间代谢组学分析。
13.优选的，步骤(1)中，所述au
‑
pd/wte.coli纳米材料是以大肠杆菌作为载体与反应仓，依次以氯金酸和氯钯酸钾为前驱体，进行两步生物合成制备得到的；
14.和/或，所述生物样品为动物模型的组织或器官的冷冻切片，所述动物模型的动物选自大鼠或小鼠，优选为balb/c小白鼠或c57小黑鼠；将所述au
‑
pd/wte.coli纳米材料给予动物模型的方式为尾静脉注射；所述冰冻切片的制作时间是：所述动物模型被给予au
‑
pd/wte.coli纳米材料后至少作用48 小时。
15.优选的，步骤(1)中，desi
‑
msi检测条件包括：质荷比范围为50～1000；和/或，所述生物样品为肝组织的冰冻切片，所述空间分辨率为50～60μm；和/或，所述生物样品为肾组织或肺组织的冰冻切片，所述空间分辨率为 80～100μm；和/或，所述溶剂喷雾中还含有重量百分比0.1～0.5％的甲酸；和 /或，溶剂流速为2～4μl/min；和/或，鞘气为n2，压力为0.5mbar；和/或，所述冰冻切片表面与质谱进样口的距离为2～4mm，喷雾角度为60～70
°
，喷雾口与所述冰冻切片表面的距离为5～8mm。
16.优选的，步骤(2)包括如下步骤：
17.(2.1)将所述desi
‑
msi检测结果采用hdi软件进行分析，经过峰面积积分算法，得到处理后的水溶性和脂溶性代谢物desi
‑
msi谱图；
18.(2.2)根据人类代谢组数据库，采用r语言算法对处理后的水溶性和脂溶性代谢物desi
‑
msi谱图进行代谢物鉴定，得到空间代谢组学结果，筛选出特征代谢物。
19.优选的，所述分析方法还包括以下步骤：
20.(a)“au
‑
pd/wte.coli纳米材料
‑
生物样品”共培养：将au
‑
pd/wte.coli 纳米材料与生物样品共培养；
21.(b)代谢物提取与检测：对步骤(a)共培养后的生物样品进行代谢物提取，分别提取得到水溶性代谢物和/或脂溶性代谢物；
22.(c)进行液相色谱
‑
质谱检测：分别将步骤(b)所得水溶性代谢物和/ 或脂溶性代谢物进行液相色谱
‑
质谱检测，得到水溶性代谢物lc
‑
ms/ms谱图和/或脂溶性代谢物lc
‑
ms/ms谱图；
23.其中，进行水溶性代谢物检测时的色谱条件为：流动相由a相和b相组成，a相为5～10％乙腈水溶液，b相为90～95％乙腈水溶液，色谱柱填料为酰胺基亚乙基桥杂化颗粒；
24.进行脂溶性代谢物检测时的色谱条件为：流动相由a相和b相组成，其中，a相为60～70％乙腈水溶液，b相为90～95％异丙醇的乙腈溶液，色谱柱填料为c18硅胶颗粒。
25.优选的，步骤(a)中，所述生物样品为人血管内皮细胞、肝细胞或者肾细胞，和/或，所述共培养的时间大于等于24小时，优选为24～48小时。
26.优选的，步骤(b)中，所述水溶性代谢物的提取方法为：用磷酸缓冲液清洗步骤(a)共培养后的生物样品，加入胰蛋白酶消化，得到细胞悬浮液，用甲醇分离，取上清液，干燥，即得；
27.和/或，所述脂溶性代谢物的提取方法为：用磷酸缓冲液清洗所述生物样品，加入胰蛋白酶消化，得到细胞悬浮液，用甲醇和甲基叔丁基醚分离，取上清液，浓缩，即得。
28.优选的，步骤(b)中，所述水溶性代谢物的提取方法为：用磷酸缓冲液清洗所述生物样品，加入胰蛋白酶消化，得到细胞悬浮液，加入体积分数 75～80％的甲醇水溶液，超声处理20～30min，涡旋震荡20～30min， 10000～13000rpm离心5～10min，离心温度为3～4℃，取上清液，干燥，即得；
29.和/或，所述非靶向脂溶性代谢物的提取方法为：用磷酸缓冲液清洗所述生物样品，加入胰蛋白酶消化，得到细胞悬浮液，加入甲醇，涡旋震荡5～10min，依次加入甲基叔丁基醚和水，10000～13000rpm离心5～10min，离心温度为 3～4℃，取上清液，浓缩，即得；
30.和/或，步骤(c)中，进行水溶性代谢物检测时的色谱条件还包括：所述a相中还包含5～10mm乙酸铵和0.1～0.5wt.％乙酸，所述b相中还包含 5～10mm乙酸铵和0.1～0.5wt.％乙酸；和/或，流动相流速为200～300μl/min；和/或，色谱柱温度为35～40℃；和/或，进样量为2～5μl；和/或，洗脱方式为a相和b相的体积比1:(1～1.5)等度洗脱；
31.和/或，进行脂溶性代谢物检测时的色谱条件还包括：所述a相中还包含 10～15mm甲酸铵和0.1～0.5wt.％甲酸，所述b相中还包含10～15mm甲酸铵和0.1～0.5wt.％甲酸；和/或，流动相流速为200～260μl/min；和/或，色谱柱温度为40～45℃；和/或，进样量为2～5μl；和/或，洗脱方式为a相和b相的体积比1:(1～1.5)等度洗脱。
32.优选的，步骤(c)中，进行水溶性代谢物检测时：a相为5％乙腈水溶液，b相为95％乙腈水溶液；
33.和/或，进行脂溶性代谢物检测时：a相为60％乙腈水溶液，b相为90％异丙醇的乙腈溶液。
34.优选的，步骤(c)中，进行水溶性代谢物检测时的质谱条件为：扫描方式为正、负离子同时扫描，毛细管温度为350～400℃，鞘气流速为35～40 单位，辅助气流速为10～20单位，喷雾电压为3.5～4kv；
35.和/或，进行脂溶性代谢物检测时的质谱条件为：扫描方式为正、负离子同时扫描，
毛细管温度为320～350℃，鞘气流速为40～45单位，辅助气流速为8～10单位，喷雾电压为3.5～4kv。
36.优选的，步骤(c)得到的水溶性代谢物lc
‑
ms/ms谱图和/或脂溶性代谢物lc
‑
ms/ms谱图用于代谢途径的分析，所述代谢途径的分析包括如下步骤：
37.(d1)基于r语言算法对液相色谱
‑
质谱检测得到的结果进行代谢物分析与鉴定得到统计结果；
38.(d2)对统计结果归一化后，执行主成分分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析对代谢物进行分组；
39.(d3)通过r语言metaboanalyst进行代谢途径分析，以鉴别代表性的代谢途径。
40.本发明中，“au
‑
pd/wte.coli纳米材料”是指用大肠杆菌(wte.coli)作为载体与反应仓，以haucl4和k2pdcl4为前驱体，采用两步生物合成法制备的具有au
‑
pd核壳结构的二元贵金属复合纳米材料。“给予”是指将au
‑
pd/wte. coli纳米材料按照常规的给药方法给予实验动物的操作。
41.本发明中，混合溶液的浓度均为体积浓度，比例均为体积比例。
42.本发明的技术方案具有如下有益效果：
43.1、本发明通过优选的desi
‑
msi检测条件，实现了对au
‑
pd/wte.coli 纳米材料和生物体作用产生的代谢物的提取和准确的desi
‑
msi检测，首次实现了au
‑
pd/wte.coli纳米材料和生物体作用的空间代谢组学的分析。
44.2、在优选方案中，本发明实现了非靶向与空间代谢组学联用分析方法，在实现代谢物的组学测试的同时，有效对比评价了au
‑
pd/wte.coli纳米材料对于细胞或者小鼠代谢组学的影响规律，从而能够获得更加全面的信息。
45.3、在优选方案中，本发明构造了一个可靠的评价体系，使细胞在培养皿内处于“au
‑
pd/wte.coli浴”的氛围中，或者在小鼠体内形成“au
‑
pd/wte.coli 循环”的氛围中，二者能够充分接触，保证了相互作用的充分进行。避免了异常代谢与样品采集不均等副作用的发生，排除了测试过程的干扰因素。
46.4、本发明的au
‑
pd/wte.coli纳米材料生物响应特性的非靶向与空间代谢组学联用分析方法还具有操作方便，成本经济实惠，材料环保，对环境友好，设计简洁的优点。
47.5、采用本发明提供的非靶向与空间代谢组学联用分析方法，通过考察 au
‑
pd/wte.coli纳米材料与细胞或小鼠间的相互作用，对细胞或小鼠代谢物的检测与分析，考察au
‑
pd/wte.coli纳米材料作用下的细胞或小鼠代谢物种类含量与代谢路径，揭示了au
‑
pd/wte.coli纳米材料对于细胞或小鼠代谢组学的影响原理，为评估au
‑
pd/wte.coli纳米材料的生物特性提供了依据，应用前景广阔。
48.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
49.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
50.图1为本发明实施例1的流程示意图；
51.图2为本发明实施例1制备的au
‑
pd/wte.coli纳米材料的表征结果；
52.图3为本发明实施例1中非靶向代谢组学分析得到的au
‑
pd/wte.coli纳米材料诱导huvecs产生的差异代谢路径；
53.图4为本发明实施例1中空间代谢组学分析得到的差异代谢物在组织内的空间分布图。
具体实施方式
54.以下实施例中，所用试剂、材料和实验动物等均为市售品。
55.实施例1非靶向与空间代谢组学联用分析方法
56.本实施例具体步骤如图1所示，包括：
57.1、au
‑
pd/wte.coli纳米材料生物制备：
58.(1)试剂来源
59.大肠杆菌wte.coli(dh5α)菌株购自威斯康星州麦迪逊市的novagen。 huvecs从美国组织培养物保藏中心(atcc)。胰蛋白胨、酵母粉、nacl、 haucl4·
3h2o、k2pdcl4、hcoonh4、2,2,6,6
‑
四甲基哌啶和二甲基吡啶
‑
n
‑ꢀ
氧化物购于sigma
‑
aldrich(louis，mo，usa)。dulbecco's modified eaglemedium(dmem)、细胞培养板购自corning(ny,usa)。热灭活的胎牛血清(fbs)、青霉素
‑
链霉素溶液、磷酸缓冲盐(pbs)和胰蛋白酶购自gibco (thermo fisher,usa)。0.22μm的过滤器购自biosharp(anhui,china)。所用试剂均为分析纯，使用的水为二次蒸馏水。
60.(2)au
‑
pd/wte.coli的制备
61.5ml luria
‑
bertani(lb)培养基(含重量百分比1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉和1％nacl)和10μl冷冻保存的wte.coli在37℃下预培养12h。然后将上述200μl wte.coli转移到40ml lb培养基中，在37℃下扩增5h。将得到的悬液在600nm处的吸光度(od
600
)调整为0.25后，将wte.coli重悬于无菌水中。使用无菌水离心(4000rpm，4℃，5min)洗涤3次，以弃去lb 培养基。此后，将沉淀重悬于40ml无菌水中，然后添加300μl，0.375mmhaucl4。将得到的混合物在37℃下孵育48h。随后，加入300μl，0.375mmk2pdcl4，然后再将得到的混合物在37℃下反应24h。最后，将得到的悬浮液冲洗3次并重新分散在无菌水中，并用超声处理和0.22μm过滤器处理，即得au
‑
pd/wte.coli纳米材料。
62.(3)au
‑
pd/wte.coli纳米材料的表征
63.au
‑
pd/wte.coli纳米材料的表面结构使用扫描电子显微镜(sem,s
‑
4800, hitachi,japan)进行观察。au
‑
pd/wte.coli纳米材料的内部结构通过透射电子显微镜(tem,jem
‑
2010,jeol,japan)。结果如图2所示。
64.2、“au
‑
pd/wte.coli
‑
细胞/小鼠”模型构建
65.(1)“au
‑
pd/wte.coli
‑
细胞”模型构建过程为：所用细胞培养基为包含体积分数10％的胎牛血清和重量百分比1％青霉素
‑
链霉素溶液的dmem (dulbecco modified eagle medium)培养基，将接种有huvecs细胞的培养皿放于5％co2，37℃的培养箱中培养。每两天更换一次培养基，以维持细胞的活力。
66.待细胞生长到指数增长期，用磷酸缓冲液清洗huvec细胞，然后加入 1ml胰蛋白酶，得到细胞悬浮液。取2ml细胞悬浮液(细胞浓度为1
×
105个 /ml)分散，并接种到6孔板中。然后，将两种剂量的au
‑
pd/wte.coli纳米材料分别加入孔板，混合均匀，使孔板中au
‑
pd/wte.coli纳米材料的浓度分别为8μg/l和80μg/l，每种浓度六个孔。将加样后的培养皿在培养箱中继续培养48h。
67.(2)“au
‑
pd/wte.coli
‑
小鼠”模型构建过程为：所用小鼠为balb/c小白鼠或者c57小黑鼠，将小鼠饲养于饲养笼中，每笼6只，饲料和饮水充足，垫料每两天换一次。此后，将100μl，8μg/l和80μg/l两种剂量的au
‑
pd/wte. coli纳米材料分别以尾静脉注射的形式注射入小鼠体内，每天定点注射一次，将注射后的小鼠放入饲养笼中继续饲养，饲养过程持续48h。
68.3、非靶向代谢组学检测与分析
69.将上述共培养48h后的细胞用磷酸缓冲液清洗，然后加入1ml胰蛋白酶，得到细胞悬浮液。
70.(1)非靶向水溶性代谢物提取、检测与分析
71.取1/2体积的细胞悬浮液，加入1ml预冷的80％甲醇
‑
水溶液淬灭30min。此后，将该细胞悬浮液在冰浴中超声处理30min并涡旋震荡5min，然后离心处理(13000rpm，5min，4℃)，将上清液转移至新试管中，并真空干燥 3h。此后，加水进行复溶，离心除去沉淀，取上清液装瓶，进入lc
‑
ms/ms 进行检测。其中，lc设置条件为：流动相流速为300μl/min，流动相组成为(a)5％乙腈水溶液(包括5mm乙酸铵和0.1％乙酸)和(b)95％乙腈水溶液(包含5mm乙酸铵和0.1％乙酸)。洗脱方式为采用流动相a和流动相 b体积比1:1等度洗脱。色谱柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)温度设置为35℃。进样量为5μl。ms由加热电喷雾电离源(h
‑
esi)和orbitrap质量分析仪组成，设置条件为：正、负离子同时扫描，毛细管温度为350℃，鞘气流速为 35单位，辅助气流速为10单位，喷雾电压为3.5kv。测试完毕后，将 lc
‑
ms/ms谱图原始数据导入到progenesis qi软件中进行信息提取，采用r 语言算法对处理后的lc
‑
ms/ms谱图进行代谢物鉴定，通过r语言 metaboanalyst实现代谢途径分析，考察au
‑
pd/wte.coli纳米材料对细胞代谢组学的影响特性。
72.(2)非靶向脂溶性代谢物提取、检测与分析
73.取剩余1/2体积的细胞悬浮液，通过离心除去上清液，然后加入300μl 甲醇，涡旋震荡5min后，将体系与1ml甲基叔丁基醚混合并轻轻摇动。随后，加入250μl水，并缓慢摇动1h。然后离心处理(13000rpm，5min，4℃)，将上清液转移至新试管中，并用氮气流处理30min进行浓缩。此后，加甲醇和二氯甲烷复溶，进入lc
‑
ms/ms进行检测。其中，lc设置条件为：流动相流速为260μl/min，流动相组成为(a)60％乙腈水溶液(含有10mm甲酸铵和0.1％甲酸)和(b)90％异丙醇的乙腈溶液(包括10mm甲酸铵和0.1％甲酸)。洗脱方式为采用流动相a和流动相b体积比1:1等度洗脱。c30色谱柱(2.1mm
×
150mm，2.6μm)温度设置为45℃。进样量为2μl。ms由加热电喷雾电离源(h
‑
esi)和orbitrap质量分析仪组成，设置条件为：正、负离子同时扫描，毛细管温度为320℃，鞘气流速为45单位，辅助气流速为 8单位，喷雾电压为3.5kv。测试完毕后，将非靶向脂溶性代谢物的lc
‑
ms/ms 谱图原始数据导入到ms
‑
dial软件中进行信息提取，采用r语言算法对处理后的lc
‑
ms/ms谱图进行代谢物鉴定，考察au
‑
pd/wte.coli纳米材料对细胞代谢组学的影响特性。
74.非靶向代谢组学分析结果如图3所示。
75.4、空间代谢组学检测与分析
76.通过体内尾静脉注射au
‑
pd/wte.coli纳米材料以建立au
‑
pd/wte.coli
‑
小鼠相互作用模型后，取小鼠的肝、肾和肺组织用磷酸缓冲液清洗后放入液氮中保存，对小鼠的肝、肾和肺部分进行冰冻切片(厚度：8μm)并固定在玻璃显微镜载玻片上，并保持在
‑
80℃的温度。然后，通过使用desi
‑
msi扫描肝、肾和肺的冷冻切片的分子图像。将与ms(synapt g2
‑
si,waters,usa) 联用的desi(2d,prosolia,usa)源应用于肝、肾和肺成像。
77.desi
‑
msi以正向和负两种模式进行。在正模式下，电压为5kv，m/z 范围为50到1000。对于肝样品，空间分辨率为50μm，对于肾和肺样品，空间分辨率为80μm。溶剂配比为95％ch3oh/5％h2o和0.1％甲酸)，流速设置为2μl/min。在负模式下，电压为
‑
4.5kv，m/z范围为50到1000。对于肝样品，空间分辨率为50μm，对于肾和肺样品，空间分辨率为80μm。溶剂配比为95％ch3oh/5％h2o和0.1％甲酸)，流速设置为2μl/min。鞘气为n2，压力为0.5mbar。肝、肾和肺组织的冰冻切片被固定于水平的移动台上，并以带电的液滴喷雾在竖直方向上逐一扫描。切片表面与质谱进样口的距离为2mm，喷雾角度为60
°
，喷雾口与切片表面的距离为5mm。
78.此后，将desi
‑
msi检测结果，导入hdi软件，经过峰面积积分算法，得到处理后的水溶性和脂溶性代谢物desi
‑
msi谱图，然后根据人类代谢组数据库，采用r语言算法对处理后的水溶性和脂溶性代谢物desi
‑
msi谱图进行代谢物鉴定，得到空间代谢组学结果并筛选出特征代谢物。
79.空间代谢组学分析结果如图4所示。
80.5、分析结果
81.分析实验结果如图2，3和4所示：
82.由图2可知，本发明实施例中，悬浊液呈现深棕色并具有丁达尔效应(如图2的左上图所示)。sem图像(如图2的右上图所示)证明au
‑
pd/wte.coli 在细菌内部均匀分散且au
‑
pd/wte.coli形貌为颗粒结构。tem图像(如图2 的左下图所示)不仅证明了这些纳米颗粒分布均匀而没有明显的团聚现象，还进一步证明了这些纳米颗粒粘附在细胞的内表面。在hrtem图像中(如图2的右下图所示)，0.232nm的晶格间距对应于au的(111)晶面，而0.267 nm的晶格间距对应于pd的(111)pd的晶面。这表明经过生物制备法能够有效制备au
‑
pd/wte.coli纳米材料，且au
‑
pd/wte.coli纳米材料具有独特的形貌与分散状态。
83.由图3可知，本发明实施例中，au
‑
pd/wte.coli纳米材料会诱导huvecs 的一系列代谢路径发生变化。其中包括：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成；三羧酸循环；丙酮酸代谢；磷酸戊糖途径；氮代谢；烟酸盐和烟酰胺代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；糖酵解或糖异生；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢；谷胱甘肽代谢；谷氨酰胺和谷氨酸代谢；半胱氨酸和甲硫氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。
84.由图4可知，本发明实施例中，肝组织内差异代谢物主要包括二十碳五烯酸，tag(50:5),dag(o
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16:0),pe(36:3)；肾组织内差异代谢物主要包括琥珀酸，半胱氨酸，亮氨酸，二十碳五烯酸；肺组织内差异代谢物主要包括pc(32:0),pg(o
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37:4),ps(o
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36:3),cer(38:4)。
85.通过上述实施例可见，本发明提供了一种au
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pd/wte.coli纳米材料生物制备及非
靶向与空间代谢组学联用分析方法。相对于传统的化学制备或者分析技术，本发明中生物制备技术和非靶向与空间代谢组学联用技术能够分别从制备与分析两个角度全面考察au
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pd/wte.coli纳米材料的生化活性，兼顾了全面性与特殊性。本发明的分析方法操作方便，成本经济实惠，材料环保，对环境友好，设计简洁，适用于实验室研究及户外测试，便于实时进行。本发明为评估au
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pd/wte.coli合成技术与生物响应特性评价提供了依据，应用前景广阔。