一种同时测定消痞和胃胶囊中多组分含量的方法与流程

1.本发明属于中药质量分析技术领域，具体涉及一种同时测定消痞和胃胶囊中多组分含量的方法。


背景技术：

2.消痞和胃胶囊源于苗族，由隔山消、刺梨叶、柳枝和三七四味中药组成，具有理气和胃、消痞止痛、通脉活络的功效，可用于治疗脾胃气滞所致的胃脘灼热胀痛、泛吐酸水、痞满嘈杂等症。临床上还可用于治疗胃癌前病变、功能性消化不良等胃肠道疾病。隔山消，又称白首乌，归脾、胃、肾经，具有消食化积、养阴补虚、抗衰老、补血提气等药理活性。隔山消中主要的活性成分包括c21甾体皂苷类和苯乙酮类化合物，4
‑
羟基苯乙酮为代表性化合物。刺梨叶，归脾、肾、胃经，其主要含有氨基酸、酚酸类、黄酮类化合物，可用于治疗积食饱胀，疥痛金疮。柳枝，为杨柳科植物垂柳的枝条，归胃、肝经，常被用于治疗发烧、皮肤病、感染等慢性炎症，其镇痛、解热、抗炎的特性与其中的活性成分水杨苷及其衍生物密切相关；三七，为五加科植物三七的干燥根，专入胃、肝经，具有止血散血定痛的功效，三七总皂苷(包括三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1和人参皂苷re等组分)是三七的主要活性成分，其含量高达12％。
3.消痞和胃胶囊现收载于国家药品监督管理局国家药品标准中，本技术的发明人前期初步测定了消痞和胃胶囊中三七的主要活性成分三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的含量。但针对单味药成分的测定分析方法并不能反映中药复方整体的质量水平。


技术实现要素：

4.为了改善上述技术问题，本发明提供一种同时测定消痞和胃胶囊中多组分含量的方法，包括以下步骤：制备供试品溶液，采用hplc检测所述供试品溶液，hplc检测条件包括，c18色谱柱，以水相为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱。
5.根据本发明，所述检测方法测定的多种成分选自以下六种成分形成的组：水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1。
6.根据本发明，所述梯度洗脱程序为：
[0007][0008]
且流动相b的含量随时间而增加；
[0009]
优选地，所述梯度洗脱程序为：
[0010][0011]
更优选地，所述梯度洗脱程序为：
[0012][0013][0014]
根据本发明，色谱柱可以为symmetryshieldtmrp18或c18色谱柱，优选为c18色谱柱，示例性为c
18
柱[(1.5
‑
4.6)mmi.d.
×
(150
‑
250)mm，1.5
‑
5μm)]。
[0015]
根据本发明，所述检测波长为200～206nm；在本发明的一个实施方式中，检测波长为203nm。
[0016]
根据本发明，所述检测的进样量为2.0～8.0μl，在本发明的一个实施方式中为5.0μl。
[0017]
根据本发明，所述检测的流速为0.8
‑
1.3ml/min，在本发明的一个实施方式中为1.0ml/min。
[0018]
根据本发明，所述检测的柱温为20～40℃，在本发明的一个实施方式中为30℃。
[0019]
根据本发明，供试品溶液的制备方法包括：取消痞和胃胶囊的内容物，用溶剂提取。
[0020]
根据本发明，所述溶剂可以是本领域中常用于天然化合物提取的溶剂，包括但不限于醇或者醇的水溶液。在本发明的一些实施方式中，醇选自甲醇和/或乙醇。在本发明的一些实施方式中，提取溶剂例如选自60
‑
85％的甲醇水溶液，示例性为75％的甲醇水溶液。
[0021]
根据本发明，所述提取方法可以是本领域常用的天然化合物提取方法，包括但不限于超声提取或回流提取。在本发明的一些实施方式中，采用回流提取。所述回流提取的时间为0.5
‑
2h，示例性为0.5h、1h、2h。
[0022]
根据本发明，所述供试品溶液制备时胶囊内容物重量和加入提取溶剂的体积比为10～30mg胶囊内容物/ml，示例性为10mg胶囊内容物/ml、20mg胶囊内容物/ml、30mg胶囊内容物/ml。
[0023]
根据本发明，所述供试品溶液的制备方法还包括对提取液进行固液分离得到供试品溶液的操作。所述固液分离可以是本领域常用的分离手段，包括但不限于过滤和离心。在本发明的一个实施方式中，采用过滤，例如，采用0.45μm微孔滤膜过滤。
[0024]
根据本发明，所述检测方法还包括记录所述选自上述六种成分形成的组中各组分的峰面积，由各组分的线性回归方程分别计算供试品溶液中对应组分的含量。
[0025]
所述水杨苷含量的线性回归方程为：y＝0.3348x 0.0851，线性范围为4.36～21.8μg/ml；
[0026]
所述表儿茶素的线性回归方程为：y＝2.1946x 0.142，线性范围为1.608～8.04μg/ml；
[0027]
所述4
‑
羟基苯乙酮的线性回归方程为：y＝0.7299x 0.021，线性范围为1.332～6.66μg/ml；
[0028]
所述三七皂苷r1的线性回归方程为：y＝0.0376x 0.0057，线性范围为22.88～114.4μg/ml；
[0029]
所述人参皂苷rg1的线性回归方程为：y＝0.0452x 0.2183，线性范围为81.6～408μg/ml；
[0030]
所述人参皂苷rb1的线性回归方程为：y＝0.0333x 0.0577，线性范围为73.6～368μg/ml。
[0031]
上述线性回归方程中，y为相应组分的峰面积，x为所述组分的质量浓度(μg/ml)。
[0032]
本发明还提供一种同时测定消痞和胃胶囊中多组分含量方法的构建方法，包括以下步骤：制备系列浓度的对照品溶液，用hplc检测各浓度的对照品溶液，以各浓度的对照品溶液组分的色谱峰峰面积(y)为纵坐标，各对照品溶液组分的质量浓度(x，μg/ml)为横坐标，计算各组分线性回归方程，所述的hplc检测条件包括：c18色谱柱，以水相为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱。
[0033]
根据本发明，所述构建方法中的对照品选自以下6种成分形成的组：水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1。
[0034]
根据本发明，所述梯度洗脱程序为：
[0035][0036]
且流动相b的含量随时间而增加；
[0037]
优选地，所述梯度洗脱程序为：
[0038][0039]
更优选地，所述梯度洗脱程序为：
[0040][0041][0042]
根据本发明，色谱柱可以为symmetryshieldtmrp18或c18色谱柱，优选为c18色谱柱，示例性为c
18
柱[(1.5
‑
4.6)mmi.d.
×
(150
‑
250)mm，1.5
‑
5μm)]。
[0043]
根据本发明，所述检测波长为200～206nm；在本发明的一个实施方式中，检测波长为203nm。
[0044]
根据本发明，所述检测的进样量为2.0～8.0μl，在本发明的一个实施方式中为5.0μl。
[0045]
根据本发明，所述检测的流速为0.8
‑
1.3ml/min，在本发明的一个实施方式中为1.0ml/min。
[0046]
根据本发明，所述检测的柱温为20～40℃，在本发明的一个实施方式中为30℃。
[0047]
根据本发明，所述系列浓度的对照品溶液可以是6种对照品的每一种对照品的溶液，也可以是6种对照品中任意两种或两种以上对照品的混合物的溶液。
[0048]
根据本发明，所述系列浓度的对照品溶液的制备方法包括：分别取水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1，分别加入有机溶剂溶解，得到各对照品的溶液。
[0049]
根据本发明，所述系列浓度的对照品溶液的制备方法还可以包括：制备6种对照品中任意两种或两种以上对照品的混合物的溶液。例如，将上述任意两种或两种以上的对照品混合，加入有机溶剂溶解，得到相应对照品混合物的溶液。
[0050]
根据本发明，所述有机溶剂可以选自甲醇和/或乙醇，在本发明的一个实施方式中为甲醇。
[0051]
根据本发明，所述系列浓度的对照品溶液中，水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的浓度范围分别为4～25μg/ml、1～10μg/ml、1～10μg/ml、20～120μg/ml、70～420μg/ml、60～380μg/ml；每个对照品的系列浓度之间可以是等差递增，也可以是等比递增。
[0052]
在本发明的一个实施方式中，所述系列浓度的对照品溶液的制备方法包括：制备6种对照品混合物的溶液，所述溶液中水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的浓度分别为21.8μg/ml、8.04μg/ml、6.66μg/ml、114.4μg/ml、408μg/ml、368μg/ml；将所述溶液进行等差稀释，分别得到水杨苷的系列浓度分别为4.36μg/ml、8.72μg/ml、13.08μg/ml、17.44μg/ml、21.8μg/ml；表儿茶素的系列浓度分别为1.608μg/ml、3.216μg/ml、4.824μg/ml、6.432μg/ml、8.04μg/ml；4
‑
羟基苯乙酮的系列浓度分别为1.332μg/ml、2.664μg/ml、3.996μg/ml、5.328μg/ml、6.66μg/ml；三七皂苷r1的系列浓度分别为22.88μg/ml、45.76μg/ml、68.64μg/ml、91.52μg/ml、114.4μg/ml；人参皂苷rg1的系列浓度分别为81.6μg/ml、163.2μg/ml、244.8μg/ml、326.4μg/ml、408μg/ml；和人参皂苷rb1的系列浓度分别为73.6μg/ml、147.2μg/ml、220.8μg/ml、294.4μg/ml、368μg/ml。
[0053]
根据本发明，所述构建方法中还包括采用高效液相色谱法对制备得到的各对照品的溶液和对照品混合物的溶液进行分析，根据各对照品溶液的色谱峰对混合标样中的色谱峰进行定性，并绘制混合标样中各组分的浓度
‑
峰面积标准曲线。
[0054]
根据本发明，所述构建方法还包括对方法精密度、稳定性、重复性和/或加样回收率的验证步骤。
[0055]
根据本发明，在对方法的精密度、稳定性和重复性验证时，使用消痞和胃胶囊的供试品溶液进行，所述供试品溶液的制备方法同前述所述。
[0056]
根据本发明，所述同时测定消痞和胃胶囊中多组分含量的方法，包括以下步骤：
[0057]
(1)取水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1为对照品，分别制成各对照品溶液；
[0058]
(2)取消痞和胃胶囊内容物，加入75％甲醇，水浴回流，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；
[0059]
(3)分别吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪进行测定，色谱条件如下：采用c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)；流动相a相(水相)，b相为(乙腈)；梯度洗脱流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长为203nm，理论板数按人参皂苷rb1计算应不低于5000。
[0060]
本发明还提供前述的检测方法和/或构建方法在消痞和胃胶囊质量控制中的应用。
[0061]
本发明的有益效果:
[0062]
(1)本发明在同一色谱条件下建立消痞和胃胶囊多组分(水杨苷，表儿茶素，4
‑
羟基苯乙酮，三七皂苷r1，人参皂苷rg1和人参皂苷rb1)含量测定的质控方法，为消痞和胃胶囊全面质量标准的建立奠定基础。
[0063]
(2)本发明采用pda紫外检测器对含有6个成分的混合对照品进行全波长扫描。其中：三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1在203nm处有最大吸收；水杨苷、表儿茶素和4
‑
羟基苯乙酮分别在在267nm、279nm和275nm处有最大吸收波长，此外三者均存在紫外末端吸收。通过比较意外发现：水杨苷和表儿茶素在203nm处的色谱峰响应值均高于各自对应的最大吸收波长。而4
‑
羟基苯乙酮在203nm和275nm处色谱峰的响应值无明显差异。综合以上因素，本发明选择203nm为各组分的检测波长，各化合物的光谱信息见图1和图2。
[0064]
(3)本发明采用同一色谱条件同时检测消痞和胃胶囊中水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的含量，操作简便快捷，试剂消耗低，成本低；通过选择合适的检测条件，使得该方法测定消痞和胃胶囊中各组分含量的分离度、准确性、重复性、稳定性等都满足标准要求。
附图说明
[0065]
图1中a、b、c分别为水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮在200
‑
400nm波长范围的紫外吸收图。
[0066]
图2中d、e、f分别为三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1在200
‑
400nm波长范围的紫外吸收图。
[0067]
图3中a为消痞和胃胶囊供试品溶液的色谱图；图3中b为混合对照品溶液的色谱图(图中：1
‑
水杨苷；2
‑
表儿茶素；3
‑4‑
羟基苯乙酮；4
‑
三七皂苷r1；5
‑
人参皂苷rg1；6
‑
人参皂苷rb1)。
具体实施方式
[0068]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0069]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已
知方法制备。
[0070]
实施例1
[0071]
1.仪器与材料
[0072]
1.1仪器
[0073]
高效液相色谱仪(型号：u3000，赛默飞世尔科技有限公司)，电热恒温水浴锅(型号：hh
‑
s4a，北京科伟永兴仪器有限公司)；xs105型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；milli
‑
q超纯水纯化系统(北京五洲东方科技有限公司)。
[0074]
1.2材料
[0075]
水杨苷(纯度≥98％，批号y12s6s1，上海源叶生物科技有限公司)，表儿茶素(纯度≥98％，批号110878
‑
201703，中国食品药品检定研究院)，4
‑
羟基苯乙酮(纯度≥98％，批号t21j6c1，上海源叶生物科技有限公司)，三七皂苷r1(纯度≥98％，批号110745
‑
201921，中国食品药品检定研究院)，人参皂苷rg1(纯度≥98％，批号110703
‑
202034，中国食品药品检定研究院)，人参皂苷rb1(纯度≥98％，110704
‑
202129，中国食品药品检定研究院)；消痞和胃胶囊10批(批号s1
‑
s10)，批号分别为20200702，20200701，20190102，20200104，20200105，20200201，20200601，20200603，20200604，20200602，来源贵州永乐药业有限公司；色谱纯乙腈；色谱纯甲醇；超纯水。
[0076]
2.方法与结果
[0077]
2.1色谱条件
[0078]
采用c18色谱柱(4.6mm
×
150mm，5μm)；流动相a相为水相，b相为乙腈；梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温30℃；进样量5μl，检测波长为203nm。
[0079]
表1梯度洗脱方法
[0080][0081]
2.2对照品溶液制备
[0082]
分别取水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成含有水杨苷21.8μg/ml，表儿茶素8.04μg/ml，4
‑
羟基苯乙酮6.66μg/ml，三七皂苷r1 114.4μg/ml，人参皂苷rg1 408μg/ml和人参皂苷rb1 368μg/ml的混合对照品溶液。
[0083]
同时，分别取水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成水杨苷21.8μg/ml，表儿茶素8.04μg/ml，4
‑
羟基苯乙酮6.66μg/ml，三七皂苷r1 114.4μg/ml，人参皂苷rg1 408μg/ml和人参皂苷rb1 368μg/ml的各对照品的单一溶液。
[0084]
2.3供试品溶液制备
[0085]
取消痞和胃胶囊内容物适量，混匀，精密称取细粉约0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，水浴回流2h，放冷，称重，用75％甲醇补足重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
[0086]
2.4方法学考察
[0087]
2.4.1精密度试验
[0088]
取同一批号(20200702)的消痞和胃胶囊供试品，连续进样6次，分别记录峰面积。经计算：结果发现水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的峰面积的rsd值分别为1.53％、1.37％、1.22％、1.82％、0.89％和1.35％，由此表明本发明的测定方法精密度良好。
[0089]
2.4.2线性关系考察
[0090]
按上述“2.1”项下的色谱条件，取每个对照品的单一溶液进行色谱检测，再对对照品混合物的溶液进行色谱检测，对比单一对照品的色谱峰确认对照品混合物的各色谱峰归属，随后直接通过对照品混合物的溶液的色谱分析，同时测定六个组分并获得线性方程。
[0091]
精密量取混合对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成一系列浓度的混合对照品溶液，按上述“2.1”项下的色谱条件测定分析，记录液相色谱图。以各浓度的混合对照品溶液的色谱峰峰面积(y)为纵坐标，各混合对照品溶液的浓度(x，μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，计算各组分的回归方程及相关系数，见表1。
[0092]
表1 6种化学成分的回归方程、相关系数和线性范围
[0093][0094]
2.4.3稳定性试验
[0095]
取同一批号(20200702)的消痞和胃胶囊供试品，按照“2.1”项下色谱条件，分别在供试品溶液放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时进样进行分析，分别记录峰面积，计算得到水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的峰面积的rsd值为1.66％、1.25％、1.33％、1.77％、1.01％和0.91％，由此表明本发明的供试品溶液在24h内稳定。
[0096]
2.4.4重复性试验
[0097]
取同一批号(20200702)的消痞和胃胶囊供试品，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，分别记录峰面积，由各组分的线性回归方
程计算得到各组分含量分别为：水杨苷9.06μg/ml、表儿茶素3.44μg/ml、4
‑
羟基苯乙酮2.66μg/ml、三七皂苷r1 55.39μg/ml、人参皂苷rg1 206.98μg/ml和人参皂苷rb1 189.85μg/ml，峰面积rsd值分别为0.70％、1.36％、1.44％、0.92％、0.36％和1.00％，由此表明本发明方法的重复性良好。
[0098]
2.4.5加样回收率
[0099]
取已知含量的消痞和胃胶囊(20200702)，倾出内容物，精密称定0.25g，平行6份，分别加入含有水杨苷110μg/ml、表儿茶素40μg/ml、4
‑
羟基苯乙酮30μg/ml、三七皂苷r1 700μg/ml、人参皂苷rg1 2500μg/ml和人参皂苷rb1 2300μg/ml的混合对照品溶液1ml，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件进样分析，分别记录峰面积，由各组分的线性回归方程计算得到各组分的加样回收率，结果见表2。表2中“样品含有量”的计算方法为：将2.4.4项测得的各成分含量，乘以25ml除以2。
[0100]
表2消痞和胃胶囊6个成分的加样回收率结果(n＝6)
[0101]
[0102][0103]
2.4.6样品测定
[0104]
取10个批次的消痞和胃胶囊供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，分别记录各组分峰面积，由各组分的线性回归方程分别计算水杨苷、表儿茶素、4
‑
羟基苯乙酮、三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1的含量，结果如下表3所示。
[0105]
表3 10批消痞和胃胶囊6个成分含量测定结果(μg/ml，n＝3)
[0106][0107]
综上所述，本发明结合各系统适用性参数情况，并经方法学验证本发明的测定方法精密度、稳定性、重复性、回收率等指标均良好，提高了消痞和胃胶囊的质量控制标准，为其全面质量标准的建立提供参考依据。
[0108]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。