一种砂连和胃胶囊的薄层色谱鉴别方法与流程

1.本发明涉及化合物鉴别与中成药质量控制技术领域，具体涉及一种砂连和胃胶囊的薄层色谱鉴别方法。


背景技术：

2.砂连和胃胶囊出自苗族验方，由紫萁贯众(麸炒)、黄连(酒炙)、砂仁、北沙参、陈皮和土木香六味药组成。紫萁贯众清热解毒、祛瘀止血；黄连清热燥湿，泻火解毒；北沙参养阴清肺，益胃生津；砂仁化湿开胃，温脾止泻；陈皮理气健脾，燥湿化痰；土木香健脾和胃，调气解郁，诸药合用具有清热养阴，理气和胃之功效。因而被应用于胃热阴伤，兼有气滞所致的胃脘疼痛、口臭、呃逆、胁痛等症，可显著改善患者反酸、嗳气腹胀、恶心呕吐、上腹疼痛等症状，且疗效肯定，是一种治疗慢性胃炎疗效较理想的药物。
3.目前砂连和胃胶囊被收录于国家中成药标准汇编内科脾胃分册，在现行的砂连和胃胶囊国家药品标准中，分别通过三种不同的薄层色谱方法来鉴定其中的三种成分—紫萁酮、盐酸小檗碱和橙皮苷，为此需要针对药品采用三种不同的提取方法：在鉴定紫萁酮时，胶囊内容物采用含1％盐酸的稀乙醇回流提取，滤液蒸干得到的残渣再用乙酸乙酯提取，提取物过硅胶柱收集乙酸乙酯的洗脱液，蒸干得到的残渣用甲醇溶解作为供试品溶液；在鉴定盐酸小檗碱时，胶囊内容物用甲醇回流提取，提取液作为供试品溶液；在鉴定橙皮苷时，胶囊内容物用甲醇回流提取，提取液浓缩后作为供试品溶液。三种成分的薄层色谱鉴定的硅胶薄板和展开剂各不相同：鉴定紫萁酮采用硅胶gf
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薄板，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
乙酸乙酯
‑
甲酸(6:4:0.1)为展开剂；鉴定盐酸小檗碱采用硅胶g薄板，以乙酸乙酯
‑
丁酮
‑
甲酸
‑
水(10:6:1:1)为展开剂；鉴定橙皮苷采用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶g薄层板，以乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
水(100:17:10)为展开剂，以1％三氯化铝乙醇溶液显色。
4.现行药品标准鉴别方法使用的提取方法与薄层色谱鉴定方法不仅较复杂，且鉴别成分仅三种，不能全面反映药品特征。薄层色谱鉴定方法是常见的中药材鉴别方法，具有设备简单、操作方便、灵敏度高、显色方式多，亦可大量制备的优点，然而对于组方较为复杂的中成药，则往往需要使用不同的薄层色谱鉴别方法对其中的成分分别进行鉴定，且有时为了鉴定出不同的成分还需要对药物进行多种不同的提取方法，上述方法严重阻碍了其在实际生产和药品监管中的应用发展。因而，为了更全面有效地控制砂连和胃胶囊临床用药的质量，使其安全性和疗效具有更好的保障，亟需开发新的更加全面稳定的砂连和胃胶囊中成药的质量鉴定方法。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，改进现有技术中砂连和胃胶囊的鉴别方法，本发明提供一种砂连和胃胶囊的薄层色谱鉴别方法，其包括取砂连和胃胶囊内容物制备供试品溶液，采用盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、橙皮苷、补骨脂素与土木香内酯标准品为对照，依次以展开剂1(正丁醇：乙酸：水体积比为7：1：2)和展开剂2(石油醚：乙酸乙酯体积比为10：1)进行两
次同向展开，展开后分别使用0.9
‑
1.1w/v％的三氯化铝乙醇溶液和4
‑
6％的茴香醛硫酸溶液进行显色，检测波长为310nm。
6.根据本发明，所述砂连和胃胶囊的薄层色谱鉴别方法包括如下步骤：
7.(1)溶液制备：取砂连和胃胶囊内容物制备供试品溶液；分别取盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、橙皮苷、补骨脂素与土木香内酯标准品，制备标准品溶液；所述标准品溶液，是5种标准品的每一种标准品溶液，和/或，5种标准品混合物的溶液；
8.(2)薄层展开：将溶液点样于硅胶g板，分两次分别使用展开剂1(正丁醇：乙酸：水体积比为7：1：2)和展开剂2(石油醚：乙酸乙酯体积比为10：1)进行同向展开，展开后分别使用0.9
‑
1.1w/v％的三氯化铝乙醇溶液和4
‑
6％的茴香醛硫酸溶液进行显色，在紫外灯310nm波长下检视；
9.本发明中，所述点样溶液的方式可以为：供试品溶液和5种标准品的每一种标准品溶液分别点样，或者，供试品溶液和标准品混合物的溶液分别点样，或者，供试品溶液、5种标准品的每一种标准品溶液和标准品混合物的溶液分别点样。
10.根据本发明，所述供试品溶液的制备方法为：取砂连和胃胶囊内容物，使用50
‑
95％，优选60
‑
85％的有机醇水溶液为溶剂，回流提取例如0.5
‑
2小时制得供试品溶液。所述有机醇可以是本领域中常用的天然化合物提取用有机醇，优选为乙醇或甲醇。
11.在本发明的一个实施方式中，使用75％的乙醇水溶液为溶剂，经回流提取制得所述供试品溶液。
12.溶剂的用量为每1ml溶剂中添加0.05g
‑
0.20g胶囊内容物。在本发明的一个实施方式中，每1ml溶剂中添加0.10g胶囊内容物。
13.根据本发明，所述标准品溶液制备方法为：取盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、橙皮苷、补骨脂素与土木香内酯标准品，分别制成5种标准品的标准品溶液。优选标准品溶液使用甲醇为溶剂。盐酸小檗碱标准品溶液浓度为0.03
‑
0.07mg/ml，例如0.05mg/ml。盐酸黄连碱标准品溶液浓度为0.10
‑
0.20mg/ml，例如0.15mg/ml。橙皮苷标准品溶液浓度为0.06
‑
0.15mg/ml，例如0.10mg/ml。补骨脂素标准品溶液浓度为0.03
‑
0.07mg/ml，例如0.05mg/ml。土木香内酯标准品溶液浓度为0.06
‑
0.15mg/ml，例如0.10mg/ml。
14.根据本发明，所述5种标准品混合物的溶液制备方法为：将称取的5种标准品混合，用溶剂溶解。优选使用甲醇为溶剂。
15.根据本发明，在所述5种标准品混合物的溶液中，盐酸小檗碱浓度为0.03
‑
0.07mg/ml，例如0.05mg/ml，盐酸黄连碱浓度为0.10
‑
0.20mg/ml，例如0.15mg/ml，橙皮苷浓度为0.06
‑
0.15mg/ml，例如0.10mg/ml，补骨脂素浓度为0.03
‑
0.07mg/ml，例如0.05mg/ml，土木香内酯浓度为0.06
‑
0.15mg/ml，例如0.10mg/ml。
16.根据本发明，优选供试品溶液的点样量为1
‑
5μl，示例性为3μl。
17.根据本发明，优选盐酸小檗碱标准品溶液、盐酸黄连碱标准品溶液、橙皮苷标准品溶液、补骨脂素标准品溶液和土木香内酯标准品溶液的点样量分别为2
‑
8μl，示例性为5μl。
18.根据本发明，优选标准品混合物的溶液点样量为2
‑
8μl，示例性为5μl。
19.根据本发明，优选1w/v％的三氯化铝乙醇溶液。
20.根据本发明，优选5％茴香醛硫酸溶液。本发明中的茴香醛硫酸溶液，可以使用硫酸浓度为70％以上的浓硫酸进行配制，配置方法参照药典记载，取4
‑
6ml茴香醛，加入100ml
浓硫酸。
21.根据本发明，优选第一次展开为3
‑
4cm。
22.根据本发明，优选第二次展开为7.5
‑
8.5cm。
23.在本发明中，“标准品”和“对照品”具有相同的含义，可以替换使用；“标准品溶液”和“对照品溶液”具有相同的含义，可以替换使用。
24.采用本发明的薄层色谱鉴别方法对砂连和胃胶囊进行鉴别检测时，制备供试品溶液和对照标准品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品色谱图中所显斑点的位置和颜色(或荧光)与标准物质色谱图的斑点一致。
25.本发明的有益效果:
26.(1)本发明通过优化不同药材的薄层色谱分析方法，并优化展开剂的组成及显色方式，实现了一次点样同时检测砂连和胃胶囊中四种药材5种不同成分的目的。
27.发明人通过研究意外发现，黄酮类活性成分会与金属盐络合后显色，因此三氯化铝乙醇溶液显色剂仅能使橙皮苷显色，而又不会影响茴香醛与其余四种成分的显色反应。本发明将三氯化铝和茴香醛作为显示剂组合使用，能实现在同一检测波长下使砂连和胃胶囊内容物中的五种成分分别且无互扰的进行显色。
28.(2)本发明通过薄层色谱鉴别方法对砂连和胃胶囊进行定性分析，取样量少、成本低、操作快速而简单。且本发明的薄层色谱鉴定方法中可以在一次薄层分析中同时鉴定砂连和胃胶囊内容物中五种不同的物质，具有分析周期短、效率高、化学试剂使用少、绿色环保等优点。
附图说明
29.图1为砂连和胃胶囊中五种成分的鉴定结果图，每张图中从左到右的泳道分别依次标注为a、b、c、d、e、f、g，分别依次对应为砂连和胃胶囊样品、5种标准品混合物的标准溶液、土木香内酯标准品、补骨脂素标准品、橙皮苷标准品、盐酸小檗碱标准品、盐酸黄连碱标准品。其中：左图为1w/v％的三氯化铝乙醇溶液显色后的结果图，右图为5％茴香醛硫酸溶液显色后的结果图。
30.图2为砂连和胃胶囊六批次的成分鉴定结果图，图中从左到右的泳道分别依次标注为s1、s2、s3、hb、s4、s5、s6，其中s1
‑
s6分别为样品s1
‑
s6六批砂连和胃胶囊的薄层色谱图，hb为混合标准品溶液的薄层色谱图。其中：左图为1w/v％的三氯化铝乙醇溶液显色后的结果图，右图为5％茴香醛硫酸溶液显色后的结果图。
具体实施方式
31.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
32.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
33.试验例1
34.本发明的发明人对砂连和胃胶囊内容物的提取方法进行了实验研究：
35.考察的提取溶剂包括：甲醇、75％甲醇、50％甲醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、纯水、石油醚、正丁醇。
36.考察的提取方式包括：超声提取，回流提取，以及搭配不同静置时间的上述提取方式。
37.考察的料液比(1g胶囊物和提取溶剂(ml)的用量比)包括：1g:5ml、1g:10ml、1g:20ml、1g:50ml。
38.通过大量实验研究发现，有机醇类的水溶液对砂连和胃胶囊内容物的提取效果优于纯水、纯的醇类溶剂和石油醚，且上述浓度的有机醇水溶液对砂连和胃胶囊内容物均具有较好的提取效果，为平衡不同目标化合物的斑点清晰度，并防止含量较高的化合物发生拖尾现象，最终选择浓度为50
‑
95％，优选60
‑
85％，更优选75％的有机醇水溶液进行提取。
39.在以一些含量较低的化合物为目标进行考察时，发现回流提取方法的提取效果优于超声提取方法。且在本发明限定的上述实验范围内的料液比中1g:5ml、1g:10ml、1g:20ml的提取效果接近，而优于料液比为1g:50ml时的提取效果。
40.综合考虑成本等因素后，最终确定的砂连和胃胶囊内容物提取条件为：1g:10ml的料液比，使用75％的乙醇水溶液，回流提取1h后，静置过夜，3000r/min离心取上清液。
41.试验例2
42.薄层色谱展开剂的实验研究：
43.考察展开剂体系包括：不同比例的正丁醇：乙酸：水；不同比例的石油醚：乙酸乙酯；不同比例的苯：乙酸乙酯：甲醇：异丙醇：氨水；不同比例的氯仿：水：乙酸乙酯；不同比例的石油醚：乙酸乙酯：甲酸、不同比例的乙酸乙酯：甲醇：水、不同比例的甲醇：氯仿；不同比例的环己烷
‑
乙酸乙酯
‑
异丙醇
‑
甲醇
‑
水
‑
三乙胺；不同比例的甲苯
‑
乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
水；不同比例的环己烷
‑
乙酸乙酯；以及上述展开剂的两两组合。
44.大量实验研究发现：采用单一的展开剂体系不能将所有的目标化合物分离，最终确定使用二次展开，展开方法为：先以正丁醇
‑
乙酸
‑
水(体积比为7：1：2)为展开剂，展开3.5cm左右(目的在于将极性较大的组分展开)，取出晾干。再使用石油醚
‑
乙酸乙酯(体积比为10：1)进行展开，展至8cm左右，取出晾干。
45.试验例3
46.薄层色谱显色剂的实验研究：
47.考察的显色剂为：5％的香草醛硫酸溶液、1％的香草醛硫酸溶液、5％的茴香醛硫酸溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液，以及按照不同的顺序使用的上述任意两种显色剂的组合。
48.大量实验研究发现：其中盐酸小檗碱、盐酸黄连碱与补骨脂素无需显色剂，在310nm波长下即可显色，而橙皮苷须使用1％的三氯化铝乙醇溶液进行显色，而土木香内酯需要5％的茴香醛硫酸溶液进行显色，同时意外发现1％的三氯化铝乙醇溶液并不会影响到盐酸小檗碱、盐酸黄连碱与补骨脂素的显色，且不会影响5％的茴香醛硫酸溶液对土木香内酯的显色反应。因此，最终选择1％的三氯化铝乙醇溶液与5％的茴香醛硫酸溶液联合使用，以分别实现对土木香内酯、补骨脂素、橙皮苷、盐酸小檗碱和盐酸黄连碱的鉴别。
49.试验例4
50.薄层色谱点样量的考察，根据展开后斑点的大小以及形状，对不同标准品与样品
的点样量进行考察，优选使用供试品溶液点样量为3μl，标准品混合物的溶液以及各标准品的溶液的点样量均为5μl。
51.实施例1
52.1.仪器与试药
53.1.1仪器
54.电热恒温水浴锅(型号：hh
‑
s4a，北京科伟永兴仪器有限公司)；电子天平(精度：万分之一赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；紫外透射仪(型号：zf
‑
90，上海顾村光电仪器)。
55.1.2试剂
56.乙醇(分析纯)，甲醇(分析纯)，正丁醇(分析纯)，乙酸(分析纯)，石油醚(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)[以上试剂均购自北京化工厂]
[0057]
1.3标准品
[0058]
盐酸黄连碱(批号：112026
‑
201802)、盐酸小檗碱(批号：110713
‑
202015)、橙皮苷(批号：110721
‑
202019)、补骨脂素(批号：110739
‑
201918)、土木香内酯(批号：110760
‑
201811)[以上对照品均购自中国食品药品检定研究院]
[0059]
1.4药物
[0060]
砂连和胃胶囊(0.42g
×
12粒
×
3板/盒，贵阳永乐药业有限公司)。具体批号见表1。
[0061]
表1砂连和胃胶囊测试样品批号
[0062][0063]
2.方法与结果
[0064]
2.1供试品溶液的配置：分别取6个批号的砂连和胃胶囊，取其各自内容物2.0g于50ml锥形瓶中，加入20ml 75％乙醇溶液，回流提取1h，静置过夜，3000r/min离心10分钟，取上清液，制备对应6个批号胶囊的供试品溶液。
[0065]
2.2对照品溶液配置：取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的标准品溶液；取盐酸黄连碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的标准品溶液；取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的标准品溶液；取补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的标准品溶液；取土木香内酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液。
[0066]
2.3混合对照品溶液配置：
[0067]
取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄连碱对照品、橙皮苷对照品、补骨脂素对照品、土木
香内酯对照品，加甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱0.05mg、盐酸黄连碱0.15mg、橙皮苷0.1mg、补骨脂素0.05mg、土木香内酯0.1mg的混合对照品溶液。
[0068]
2.4薄层色谱法试验：按照中国药典2020版通则0502薄层色谱法进行。吸取供试品溶液(批号s3)3μl，混合对照品溶液5μl，盐酸小檗碱标准品溶液、盐酸黄连碱标准品溶液、橙皮苷标准品溶液、补骨脂素标准品溶液和土木香内酯标准品溶液各5μl点于硅胶g板(购自青海海洋化工分厂)上，以正丁醇
‑
乙酸
‑
水(体积比为7：1：2)为展开剂，展开3.5cm左右，取出晾干。再使用石油醚
‑
乙酸乙酯(体积比为10：1)进行展开，展至8cm左右取出晾干，喷以浓度为1％的三氯化铝乙醇溶液，等待3
‑
5分钟后在紫外灯(310nm)下进行检视，色谱图如图1中(左图)所示，依次标记盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、橙皮苷和补骨脂素的位置。再喷以浓度为5％的茴香醛硫酸溶液，加热至土木香内酯显色，色谱图如图1中(右图)所示，标记其位置。
[0069]
2.5批次检测：吸取不同批次的砂连和胃胶囊供试品溶液，使用2.4中的方法进行薄层色谱法实验检测，点样顺序依次为s1、s2、s3、标准品混合物溶液、s4、s5、s6。结果如图2所示，图中结果表明，各批次砂连和胃胶囊供试品中均能检测到待测的五种物质，且斑点深浅大小一致，由此表明砂连和胃胶囊各批次之间具有均一性，且本发明的检测方法重现性高、适用性良好。
[0070]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。