一种砂连和胃胶囊指纹图谱的检测方法与流程

1.本发明涉及中药质量检测技术领域，具体涉及一种砂连和胃胶囊指纹图谱的构建方法与检测方法。


背景技术：

2.砂连和胃胶囊出自苗族验方，由紫萁贯众(麸炒)、黄连(酒炙)、砂仁、北沙参、陈皮和土木香六味药组成。紫萁贯众清热解毒、祛瘀止血；黄连清热燥湿，泻火解毒；北沙参养阴清肺，益胃生津；砂仁化湿开胃，温脾止泻；陈皮理气健脾，燥湿化痰；土木香健脾和胃，调气解郁，诸药合用具有清热养阴，理气和胃之功效。因而被应用于胃热阴伤，兼有气滞所致的胃脘疼痛、口臭、呃逆、胁痛等症，可显著改善患者反酸、嗳气腹胀、恶心呕吐、上腹疼痛等症状，且疗效肯定，是一种治疗慢性胃炎疗效较理想的药物。
3.目前砂连和胃胶囊被收录于国家中成药标准汇编内科脾胃分册，在现行的砂连和胃胶囊国家药品标准中，以薄层色谱法鉴定紫萁酮、盐酸小檗碱和橙皮苷，以高效液相色谱测定盐酸小檗碱的含量作为质控指标。然而砂连和胃胶囊中成药原料多样、成分复杂，仅采用薄层色谱法进行指标成分的定性鉴别，并采用高效液相色谱法对其中单个指标成分进行定量测定，不足以全面反映砂连和胃胶囊的质量优劣。因而，为了更全面有效地控制砂连和胃胶囊临床用药的质量，使其安全性和疗效具有更好的保障，亟需开发新的更加全面稳定的砂连和胃胶囊中成药的质量鉴定方法。


技术实现要素：

4.为了改善上述技术问题，本发明提供砂连和胃胶囊指纹图谱的构建方法以及检测方法，包括取砂连和胃胶囊的供试品溶液进行hplc检测，hplc检测的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢盐水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱。
5.根据本发明，梯度洗脱的程序为：
[0006][0007]
且随时间增加，流动相b的含量增加。
[0008]
优选，梯度洗脱的程序为：
[0009][0010]
更优选，梯度洗脱的程序为：
[0011]
[0012][0013]
根据本发明，所述磷酸二氢盐水溶液的浓度为30mm～70mm；优选，磷酸二氢盐水溶液的浓度为40mm～60mm，更优选为45mm～55mm。
[0014]
根据本发明，所述磷酸二氢盐包括但不限于为磷酸二氢铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，优选为磷酸二氢铵。
[0015]
在本发明的一个实施方式中，使用50mm的磷酸二氢铵水溶液为流动相a。
[0016]
根据本发明，十八烷基硅烷键合硅胶可以采用本领域常用的c18填充柱，例如：waters xselect hss t3、waters symmetryshield rp18、waters atlantis c18、diamonsil c18、waters xbridge c18、waters sunfire c18，优选waters xselect hss t3。
[0017]
根据本发明，hplc检测中流速为0.8
‑
1.3ml
·
min
‑1；在本发明的一个实施方式中，流速为1.0ml
·
min
‑1。
[0018]
根据本发明，hplc检测中柱温为30
‑
45℃；在本发明的一个实施方式中，柱温为40℃。
[0019]
根据本发明，hplc检测中检测波长为295
‑
305nm；在本发明的一个实施方式中，检测波长为300nm。
[0020]
根据本发明，进样量为2.0～8.0μl；在本发明的一个实施方式中进样量为5μl。
[0021]
根据本发明，供试品溶液的制备方法，包括取砂连和胃胶囊内容物，加入有机溶剂提取。
[0022]
根据本发明，所述有机溶剂可以是本领域常用的天然化合物提取溶剂，包括但不限于醇类、氯代烷烃等，优选选择甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等中的任意一种或几种。
[0023]
在本发明的一个实施方式中，有机溶剂为甲醇。
[0024]
根据本发明，所述提取方法可以是本领域常用的天然化合物提取方法，包括但不限于超声提取或回流提取。
[0025]
在本发明的一个实施方式中，使用超声提取。所述超声提取的功率为大于等于140w，优选为150
‑
500w，示例性为150w、200w、300w、400w、500w。所述超声提取的频率为大于等于28khz，优选为30
‑
100khz，示例性为30khz、40khz、60khz、80khz、100khz。所述超声提取的时间为大于等于20min，优选25
‑
60min，示例性为20min、30min、40min。
[0026]
根据本发明，所述供试品溶液的制备方法，还包括对提取后的混合溶液进行固液分离得到供试品溶液的操作。所述固液分离可以采用本领域已知手段，包括但不限于离心或过滤。在本发明的一个实施方式中，采用离心，所述离心的转速为6000
‑
12000rpm，示例性为6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm、12000rpm；所述离心的时间为5
‑
20min，示例性为5min、6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min。
[0027]
根据本发明，所述供试品溶液制备时胶囊内容物重量和加入溶剂的体积比为0.05～0.20g胶囊内容物/ml，示例性为0.10g胶囊内容物/ml。
[0028]
根据本发明，为了提高胶囊内容物的提取效率，可以在提取之前对胶囊内容物进行粉碎处理，例如研磨。
[0029]
在本发明的砂连和胃胶囊指纹图谱构建方法中，还进一步包括对标准品溶液进行相同hplc条件的检测。
[0030]
根据本发明，所述标准品包括盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、橙皮苷、柚皮苷。
[0031]
根据本发明，所述标准品溶液可以是单一每个标准品的溶液，也可以是5种标准品混合物的溶液。
[0032]
根据本发明，所述构建方法还包括配置每个标准品的溶液，将每个标准品分别使用有机溶剂溶解。
[0033]
根据本发明，所述有机溶剂是本领域常用的有机溶剂，包括但不限于醇类等，优选选择甲醇和/或乙醇。在本发明的一个实施方式中，所述有机溶剂为甲醇。
[0034]
所述盐酸巴马汀标准品溶液浓度为350～400μg/ml，例如375μg/ml；所述盐酸黄连碱标准品溶液浓度为450～480μg/ml，例如468μg/ml；盐酸小檗碱标准品溶液浓度为550～580μg/ml，例如564μg/ml；橙皮苷标准品溶液浓度为235～255μg/ml，例如244μg/ml；柚皮苷标准品溶液浓度为73～93μg/ml，例如83μg/ml。
[0035]
根据本发明，所述构建方法还可以包括配置标准品混合物的溶液，将5种标准品混合后，使用有机溶剂溶解。所述标准品混合物的溶液中，盐酸巴马汀浓度为350～400μg/ml，例如375μg/ml；盐酸黄连碱浓度为450～480μg/ml，例如468μg/ml；盐酸小檗碱浓度为550～580μg/ml，例如564μg/ml；橙皮苷浓度为235～255μg/ml，例如244μg/ml；柚皮苷浓度为73～93μg/ml，例如83μg/ml。
[0036]
在本发明的砂连和胃胶囊指纹图谱构建方法中，还进一步包括对单味药对照品溶液进行相同hplc条件的检测。
[0037]
根据本发明，所述构建方法还可以包括配置单味药对照品溶液，分别取酒炙黄连、砂仁、陈皮、麸炒紫萁贯众、北沙参、土木香，分别加入有机溶剂提取得到单味药对照品溶液。所用有机溶剂与供试品溶液制备所用有机溶剂相同或不同，优选使用相同的有机溶剂。
[0038]
优选提取方法与供试品溶液制备中砂连和胃胶囊内容物的提取方法和固液分离操作相同。在本发明的一个实施方式中，使用超声提取。所述超声提取的功率为大于等于140w，优选为150
‑
500w，示例性为150w、200w、300w、400w、500w。所述超声提取的频率为大于等于28khz，优选为30
‑
100khz，示例性为30khz、40khz、60khz、80khz、100khz。所述超声提取的时间为大于等于20min，优选25
‑
60min，示例性为20min、30min、40min。在本发明的一个实施方式中，采用离心的固液分离操作方法，所述离心的转速为6000
‑
12000rpm，示例性为
6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm、12000rpm；所述离心的时间为5
‑
20min，示例性为5min、6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min。
[0039]
所述单味药对照品溶液制备时单味药重量和加入溶剂的体积比为：所述麸炒紫萁贯众对照品为0.01～0.06g麸炒紫萁贯众/ml，例如为0.03g麸炒紫萁贯众/ml；所述酒炙黄连对照品为0.01～0.05g酒炙黄连/ml，例如为0.02g酒炙黄连/ml；所述砂仁对照品为0.007～0.03g砂仁/ml，例如为0.015g砂仁/ml；所述北沙参对照品为0.007～0.03g北沙参/ml，例如为0.015g北沙参/ml；所述陈皮对照品为0.005～0.025g陈皮/ml，例如为0.01g陈皮/ml；所述土木香对照品为0.005～0.025g土木香/ml，例如为0.01g土木香/ml。
[0040]
根据本发明，所述构建方法中使用不同批次砂连和胃胶囊样品进行指纹图谱构建，所述不同批次至少为5个批次；更优选为至少10个批次。
[0041]
利用本发明提供的液相色谱指纹图谱构建方法得到的砂连和胃胶囊指纹图谱有17个共有特征峰，4号峰归属于麸炒紫萁贯众，3、5、11、14、16、17号峰归属于酒炙黄连，1、6、7、9、10号峰归属于陈皮，2号峰归属于土木香，12、15号峰归属于北沙参，8、13号峰归属于砂仁，9号峰为柚皮苷，10号峰为橙皮苷，14号峰为盐酸黄连碱，16号峰为盐酸巴马汀，17号峰为盐酸小檗碱。
[0042]
以10号橙皮苷的色谱峰为参照峰(s)，各共有特征峰的相对保留时间依次为：0.3189～0.3074(1号峰)、0.4935～0.4924(2号峰)、0.5547～0.5541(3号峰)、0.6783～0.6774(4号峰)、0.7013～0.7007(5号峰)、0.8215～0.8197(6号峰)、0.8557～0.8551(7号峰)、0.8717～0.8702(8号峰)、0.9383～0.9295(9号峰)、1.0000～1.0000(10号峰，s)、1.2994～1.2602(11号峰)、1.3295～1.2917(12号峰)、1.3549～1.3213(13号峰)、1.3877～1.3419(14号峰)、1.6707～1.6669(15号峰)、1.7689～1.7198(16号峰)、1.8434～1.7898(17号峰)。
[0043]
在本发明的一些具体实施例中，指纹图谱17个共有特征峰的相对保留时间为0.3117、0.4928、0.5544、0.6779、0.7010、0.8206、0.8554、0.8709、0.9318、1、1.2747、1.3071、1.3339、1.3603、1.6687、1.7400、1.8125。
[0044]
以10号橙皮苷的色谱峰为参照峰(s)，各共有特征峰的相对峰面积依次为：0.1192～0.2414(1号峰)，0.0559～0.1548(2号峰)，0.3059～0.4679(3号峰)，0.0444～0.0945(4号峰)，0.2739～0.3393(5号峰)，0.0237～0.0659(6号峰)，0.2325～0.3154(7号峰)，0.3054～0.3891(8号峰)，0.062～0.1294(9号峰)，1(10号峰，s)，0.1667～0.2303(11号峰)，0.1803～0.3121(12号峰)，0.1655～0.2692(13号峰)，0.3275～0.5753(14号峰)，0.04～0.0512(15号峰)，0.522～0.7818(16号峰)，1.8037～2.7734(17号峰)。
[0045]
根据本发明的砂连和胃胶囊指纹图谱的检测方法，依据前述hplc检测条件，以及供试品溶液制备方法，将待测砂连和胃胶囊制成供试品溶液，进行hplc检测，将检测待测砂连和胃胶囊得到的指纹图谱与本发明构建的砂连和胃胶囊指纹图谱进行比较，各共有峰的相对保留时间应在规定值的
±
5％之内，对待测样品的指纹图谱与构建的砂连和胃胶囊指纹图谱进行相似性评价，相似度大于0.8，优选大于0.90，为合格产品。
[0046]
根据本发明，所述砂连和胃胶囊指纹图谱的构建方法，包括下列步骤：
[0047]
(1)标准品溶液的制备：
[0048]
取盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、橙皮苷和柚皮苷为对照品，分别制成各
标准品溶液，任选进一步制备5种标准品混合物的溶液；
[0049]
(2)供试品溶液的制备：
[0050]
将不同批次砂连和胃胶囊分别制为供试品溶液；
[0051]
任选包括单味药对照品溶液的制备：取麸炒紫萁贯众、酒炙黄连、陈皮、土木香、北沙参与砂仁，分别按砂连和胃胶囊制法制为单味药胶囊内容物，再分别制为单味药供试品溶液；
[0052]
(3)高效液相测定：将制得的各种溶液分别注入高效液相色谱仪中进行分析，波长选择300nm，得到不同批次砂连和胃胶囊色谱图、各标准品的色谱图，任选单味药材色谱图，任选5种标准品混合物的色谱图；
[0053]
(4)生成指纹图谱：通过标准品色谱图与任选单味药色谱图指认色谱峰，以不同批次的砂连和胃胶囊色谱图制作砂连和胃胶囊指纹图谱。
[0054]
本发明还提供如上所述构建方法得到的砂连和胃胶囊指纹图谱。
[0055]
根据本发明的实施方案，所述砂连和胃胶囊指纹图谱基本上如图3所示。
[0056]
本发明还提供一种砂连和胃胶囊指纹图谱检测方法，其包括上述指纹图谱构建方法。
[0057]
本发明还提供上述指纹图谱构建方法和/或检测方法在砂连和胃胶囊质量控制中的应用。
[0058]
在本发明中，“任选”、“任选地”或“任选存在”是指随后描述的事件或情形可以但不一定出现，并且该描述包括其中所述事件或情形出现的情况和不出现的情况。
[0059]
在本发明中，“包含”和“包括”均为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。应当理解，“包含”和“包括”可以涵盖封闭式的含义，即“由
……
组成”。
[0060]
本发明的有益效果:
[0061]
中药指纹图谱可以整体、宏观地表征药品主要化学成分的特征，是目前公认的最适合中药材及中成药化学成分质量控制的手段之一，与现代分析技术相结合的中药指纹图谱，用能体现中药药效物质基础的化学物质群来综合评价中药质量，在中药质量标准制定中被广泛应用。基于此，本发明提供一种砂连和胃胶囊指纹图谱的构建方法和检测方法，有利于更全面、更有效地控制砂连和胃胶囊临床用药的质量，使其安全性和疗效得到更好的保障。
[0062]
本发明的液相色谱指纹图谱检测方法系统适应性良好、专属性强、精密度高、稳定性好、可重复性强，符合构建指纹图谱的要求，应用于砂连和胃胶囊的质量控制，可靠性高，简捷易行。
附图说明
[0063]
图1为十批砂连和胃胶囊色谱图的叠加图，图中从下到上依次为s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10的样品的谱图。
[0064]
图2为每个标准品的色谱图的叠加图。
[0065]
图3为砂连和胃胶囊的指纹图谱。
具体实施方式
[0066]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0067]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0068]
实施例1
[0069]
提取方法的考察：考察的提取溶剂包括甲醇、70％甲醇、50％甲醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、纯水、石油醚、正丁醇。实验结果显示：石油醚与正丁醇的极性过小，从而无法提出目标化合物，而甲醇较乙醇具有更优异的提取效果，且纯甲醇对于不同批号的砂连和胃胶囊的提取均具有较好的提取效果，适用性强。
[0070]
考察的提取方式包括超声提取，回流提取，以及搭配不同静置时间的上述提取方式，发现回流与超声的提取效能相似，但回流的操作较为复杂，经过静置处理后含量并无明显变化。考察的料液比(每g胶囊内容物加入的提取溶剂(ml)的用量比)包括：1g:5ml、1g:10ml、1g:20ml、1g:50ml。实验结果显示：随着料液比的增大，目标化合物特征峰的峰高显著提升，但1g:5ml与1g:10ml二者并无明显差异。
[0071]
根据提取效果综合考虑后，优选使用提取条件为：1g:10ml的料液比，使用甲醇超声提取30min。
[0072]
液相条件考察：使用pda检测器考察检测波长，流动相中有机相考察甲醇和乙腈，以及添加了0.1％甲酸与0.1％磷酸的上述溶液，水相考察了添加多种浓度的三乙胺、磷酸、甲酸、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾以及上述溶液的组合。根据分离效果，优选确定流动相为50mm磷酸二氢铵水溶液(可以通过每1l加入1ml三乙胺和3ml磷酸配置得到)(a)
‑
乙腈(b)为流动相。考察的柱温为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃。实验结果显示：温度升高时，各峰的分离度显著改善。因此，优选选择40℃的柱温。
[0073]
考察色谱柱包括waters xselect hss t3(5μm，4.6
×
150mm)、waterssymmetryshield rp18(5μm，4.6
×
150mm)、waters atlantis c18(3μm，2.1
×
150mm)、diamonsil c18(5μm，4.6
×
150mm)、waters xbridge c18(5μm，4.6
×
150mm)、waters sunfire c18(5μm，4.6
×
150mm)，优选选择waters xselect hsst3(5μm，4.6
×
150mm)为色谱柱。
[0074]
1仪器与试药
[0075]
1.1仪器
[0076]
高效液相色谱仪(型号：u3000，赛默飞世尔科技有限公司)；电热恒温水浴锅(型号：hh
‑
s4a，北京科伟永兴仪器有限公司)；电子天平(精度：万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；milli
‑
q超纯水仪(北京五洲东方科技有限公司)。
[0077]
1.2试剂
[0078]
乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)[以上三种试剂均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、超纯水(经milli
‑
q advantage a10超纯水系统制得)
[0079]
1.3标准品
[0080]
盐酸巴马汀(批号：110732
‑
201913)、盐酸黄连碱(批号：112026
‑
201802)、盐酸小
檗碱(批号：110713
‑
202015)、橙皮苷(批号：110721
‑
202019)、柚皮苷(批号：110722
‑
201815)[以上对照品均购自中国食品药品检定研究院]。
[0081]
1.4药物
[0082]
砂连和胃胶囊(0.42g
×
12粒
×
3板/盒贵阳永乐药业有限公司)。具体批号见表1。
[0083]
表1砂连和胃胶囊测试样品批号
[0084][0085]
酒炙黄连、砂仁、陈皮、麸炒紫萁贯众、北沙参、土木香(上六味药物均由贵阳永乐药业有限公司提供)。
[0086]
2方法与结果
[0087]
2.1色谱条件
[0088]
高效液相采用色谱柱waters xselect hss t3(5μm，4.6
×
150mm，milford，ma，usa)，以50mm磷酸二氢铵水溶液(每1l加入1ml三乙胺和3ml磷酸)(a)
‑
乙腈(b)为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序见下表：
[0089]
表2液相梯度
[0090][0091]
体积流量为1.0ml
·
min
‑1，柱温为40℃，检测波长为300nm，进样量为5μl。
[0092]
2.2溶液制备
[0093]
2.2.1标准品溶液的配制
[0094]
分别精密称取盐酸巴马汀375μg、盐酸黄连碱468μg、盐酸小檗碱564μg、橙皮苷244μg、柚皮苷83μg，至1ml容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线，摇匀，即得各标准品溶液。
[0095]
2.2.2供试品溶液的制备
[0096]
取各批次砂连和胃胶囊，去除胶囊壳，置于研钵中研匀，精密称取5g，置于50ml锥形瓶，精密加入色谱级甲醇50ml，摇匀，超声(功率：200w，频率：40khz)30min，放冷后用甲醇补足失重，12000r/min离心15min取上清液得到供试品溶液。
[0097]
2.2.3单味药对照品溶液的配制
[0098]
将酒炙黄连、砂仁、陈皮、麸炒紫萁贯众、北沙参、土木香六味药材分别打成粉末，过40目筛，根据砂连和胃胶囊的配方制成单药胶囊内容物粉末(共有六种)，按2.2.2方法制得六种单味药对照品溶液。
[0099]
2.3指纹图谱建立
[0100]
2.3.1共有峰匹配：测定10批砂连和胃胶囊得到色谱图，将10个批号的砂连和胃胶囊色谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，进行色谱峰匹配得到其共有的特征峰，结果如图1所示。以10号峰为参照确定17个共有峰为构成砂连和胃胶囊指纹图谱的共有峰，10批砂连和胃胶囊共有峰的相对保留时间与相对峰面积见表3。
[0101]
表3各批次共有峰相对保留时间与相对面积
[0102][0103]
续表3
[0104][0105][0106]
2.3.2峰指认：对标准品溶液和单味药溶液采用2.1的方法检测各自的色谱图。对比供试品溶液中、标准品溶液和单味药溶液相同保留时间的峰，4号峰归属于麸炒紫萁贯众，3、5、11、14、16、17号峰归属于酒炙黄连，1、6、7、9、10号峰归属于陈皮，2号峰归属于土木香，12、15号峰归属于北沙参，8、13号峰归属于砂仁，9号峰为柚皮苷，10号峰为橙皮苷，14号峰为盐酸黄连碱，16号峰为盐酸巴马汀，17号峰为盐酸小檗碱。
[0107]
2.3.3指纹图谱生成：以十批样品为参照生成砂连和胃胶囊的指纹图谱，结果如图3所示。
[0108]
2.4方法学考察
[0109]
2.4.1精密度试验：精密称取砂连和胃胶囊粉末按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以10号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的rsd<0.34％，相对峰面积的rsd<2.64％，由此表明本发明检测方法仪器精密度良好。
[0110]
2.4.2重复性试验：精密称取同一批砂连和胃胶囊粉末6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以10号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的rsd<0.18％，相对峰面积的rsd<2.49％，表明本发明检测方法重复性良好。
[0111]
2.4.3稳定性试验：取砂连和胃胶囊供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0h、2h、4h、6h、12h、24h时进样测定，以10号色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间的rsd<0.21％，相对峰面积的rsd<2.67％，表明本发明的供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0112]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。