慈姑提取物的新用途和用于延缓晶状体混浊的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及中药应用领域，尤其是慈姑提取物的新用途和用于延缓晶状体混浊的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.中国是白内障致盲人数最多的国家。年龄相关性白内障(arc)是白内障最常见类型，其患病率随着年龄增加而上升。如果不加以治疗，最终会发展为严重的视力障碍甚至失明，给社会带来巨大的健康问题和经济负担。
3.目前治疗arc的唯一有效方法是手术治疗，但是手术有成本效益，其存在巨大经济负担，特别是发展中国家偏远贫困的农村地区医疗资源匮乏，白内障手术可获性较差，加之手术本身也存在一定风险和并发症，因此，寻找经济有效且副作用小的非手术措施，来防治arc的发生发展，以应对人口老龄化的严峻现状意义重大。
4.我国中草药资源丰富，对现有中草药进行提取并对其进行特定筛选，实现早期延缓晶状体混浊的功效，将具有非常重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种慈姑提取物的新用途。
6.本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种用于延缓晶状体混浊的组合物。
7.本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述用于延缓晶状体混浊的组合物的制备方法。
8.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
9.慈姑提取物在制备用于延缓晶状体混浊的药物方面的应用。
10.慈姑提取物在制备用于防治白内障的药物方面的应用。
11.优选的，上述慈姑提取物的应用，所述白内障为年龄相关性白内障(arc)。
12.上述慈姑提取物是由水提醇沉方法得到的具有慈姑多糖成分的提取物，具体制备方法为发明专利zl201610640684.0中所记载的方法。
13.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成，按其重量份数计慈姑提取物50
‑
70份、熟地提取物5
‑
15份、生地提取物5
‑
15份、枸杞子提取物5
‑
15份、白芨提取物5
‑
15份、玄参提取物5
‑
15份、升麻提取物5
‑
15份、泽泻提取物5
‑
15份。
14.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，按其重量份数计慈姑提取物60份、熟地提取物10份、生地提取物10份、枸杞子提取物10份、白芨提取物10份、玄参提取物10份、升麻提取物5份、泽泻提取物5份。
15.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述熟地提取物是由水提醇沉法提取得到的，提取物中含有环烯醚萜类化合物和熟地多糖。
16.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述生地提取物是由水提醇沉法提取得到的，提取物中含有环烯醚萜类化合物和生地多糖。
17.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述枸杞子提取物是由水提醇沉法提取得到的，提取物中含有枸杞多糖。
18.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述白芨提取物是由水提醇沉法提取得到的，提取物中含有白芨多糖等多种活性物质。
19.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述玄参提取物是由醇提法提取得到的，提取物中含有环烯醚萜类及苯丙素类等多种活性物质。
20.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述升麻提取物是由醇提法提取得到的，提取物中含有酚酸类物质。
21.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，所述泽泻提取物是由醇提法提取得到的，提取物中含有萜类化合物。
22.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，还包括稀释剂、助悬剂、抗氧化剂、乳化剂、崩解剂、黏合剂和/或稳定剂。
23.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物，剂型为颗粒剂或胶囊剂。
24.上述用于延缓晶状体混浊的组合物的制备方法，具体制备步骤如下：
25.(1)按组方量称取慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物为原料；
26.(2)各组分混合均匀，即得。
27.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物的制备方法，所述步骤(2)所得混合物通过造粒成型、干燥得到颗粒剂。
28.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物的制备方法，以乳糖作为辅料，所述步骤(2)所得混合物与乳糖的重量比为1：2，乙醇浓度为80％(v/v)，所得颗粒剂的颗粒成型性好、溶化速度快且静置后无沉淀、休止角小于40
°
，并且易成粒不粘连。
29.优选的，上述用于延缓晶状体混浊的组合物的制备方法，所述步骤(2)所得混合物通过干燥、过筛放入胶囊中，得到胶囊剂。
30.上述用于延缓晶状体混浊的组合物的用量为60kg成人5g/天。
31.本发明的有益效果是：
32.上述慈姑提取物在延缓晶状体混浊以及防治白内障方面具有显著治疗效果，可用于制备用于延缓晶状体混浊或防治白内障的药物，具有重要的临床应用价值。
33.上述用于延缓晶状体混浊的组合物，各组分协同作用，延缓晶状体混浊的效果显著；其制备方法简单，使用方便，适合规模化工业生产的需要。
附图说明
34.图1为不同浓度ssp对细胞活力的影响。
35.图2为h2o2最佳造模浓度及ssp最佳保护浓度测定。
36.a:不同浓度h2o2(100、200、400、800、1600μm)干预hleb3细胞24h后细胞活力情况；b：利用400μm h2o2分别干预细胞不同时间段(2、6、12、24、48h)后细胞活力情况；c：提前给予1mg
·
ml
‑1ssp干预不同时间段(2、6、12、24h)后再予400μm h2o2干预24h进行氧化损伤造模
后的细胞活力情况；d：提前给予不同浓度ssp(0.5、1mg
·
ml
‑1)进行保护24h后再予400μm h2o2干预24h进行氧化损伤造模后的细胞活力情况。a：与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；b：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
37.图3为ssp对hleb3细胞中gsh(a)、sod(b)及mda(c)表达的影响。
38.a：与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；b：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
39.图4为ssp对hleb3细胞中ros释放的影响。
40.研究利用活性氧检测试剂盒结合流式细胞术检测细胞中ros的表达。图4(a
‑
d)为流式细胞术检测结果，图4e为该结果的量化柱状图。
41.图5为ssp对hleb3细胞中nrf2表达的影响。
42.图5a为western blot对各组hleb3细胞中nrf2的检测结果；图5b为蛋白定量检测结果的量化柱状图。#：与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；a：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
43.图6为h2o2延缓兔子离体晶状体混浊的时效及量效作用。
44.用浓度为200、400、800、1600及3200μm的h2o2分别干预晶状体24h(a)和48h(b)后的晶状体混浊情况。
45.图7为ssp对h2o2诱导的兔子离体晶状体混浊的作用。
46.a：为各组晶状体经过处理后的混浊情况图片；b：为3200μm h2o2干预24h后晶状体相对灰度值的情况；c：为3200μm h2o2干预48h后晶状体相对灰度值的情况。a：与模型组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
47.图8为光学显微镜下ssp对兔子离体晶状体混浊的影响(200
×
)。
48.a：正常对照组(48h)，b：400μm h2o2处理组(48h)，c：3200μm h2o2处理组(48h)，d：治疗组(1mg
·
ml
‑1ssp，3200μm h2o2干预48h)。
49.图9为ssp对h2o2诱导的大鼠离体晶状体混浊的改善作用。
50.a：正常对照组、模型组及治疗组晶状体在0、12、24和36h的状态照片；b：各组晶状体在各个时间段相对灰度值的统计柱状图。
51.图10为ssp对大鼠晶状体作用的病理结果。
52.箭头表示细胞肿胀、破裂及空泡化(400
×
)。a：正常对照组，b：损伤模型组(400μm h2o2)，c：慈姑提取物治疗组(400μm h2o2 1mg
·
ml
‑1ssp)，d：慈姑提取物对照组(1mg
·
ml
‑1ssp)。
53.图11为ssp对大鼠晶状体中nrf2表达的影响。
54.a：正常对照组、模型组及治疗组nrf2的western blot结果；b:各组相对灰度值的量化柱状图。#:与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；a：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
55.图12为ssp对大鼠晶状体中keap1及ho
‑
1表达的影响。
56.a：为正常对照组、模型组以及治疗组中keap1和ho
‑
1的western blot结果，b、c分别为keap1和ho
‑
1相对灰度值的量化柱状图。#:与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；a：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
57.图13为ssp对大鼠晶状体中tnf
‑
α、bax及bcl2表达的影响。
58.a：为正常对照组、模型组以及治疗组中tnf
‑
α、bax及bcl2的western blot结果，b、c、d分别为tnf
‑
α、bax及bcl2相对灰度值的量化柱状图。#:与正常对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)；a：与模型组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。
59.图14为大鼠离体晶状体的混浊情况。
60.图15为晶状体相对灰度值的计算结果。
具体实施方式：
61.下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
62.下述实施例中各组分的获得方法如下：
63.慈姑提取物是由下述方法获得的：(详见发明专利zl201610640684.0)
64.(1)市售云南产新鲜慈姑，削皮切片55℃烘干，慈姑干(片)加10倍水煎煮提取3次(各1.5、1、0.5h)，80目尼龙网过滤除渣；滤液加热浓缩至煎煮水体积的15％后离心后取上清液，沉淀加上清液一半体积的水煮沸保温30min后再次离心取上清液，合并两上清液；
65.(2)上清液加热浓缩至原体积的15％后加5倍重量硅胶(80
‑
100目)拌匀，真空干燥(60℃，
‑
0.08兆帕)干燥后装柱；
66.(3)依次用95％乙醇(煎煮水体积的15％)和85％乙醇(煎煮水体积的12％)洗脱，合并洗脱液并减压抽干(78℃，
‑
0.08兆帕)，加水(煎煮水体积的0.2％)溶解，再用95％乙醇稀释到水溶液体积的12倍(乙醇含量低于85％)，静置过夜，倾出上清液，得少量未精制慈姑组合物；
67.(4)样品柱先用水(煎煮水体积的25％)洗脱，再用60
‑
70℃热水(煎煮水体积的12.5％)洗脱，合并洗脱液并加热浓缩至原体积的7％，得未精制慈姑组合物溶液；
68.(5)将步骤(3)与步骤(4)所得未精制慈姑组合物溶液合并，放入分液漏斗，并加入合并液体积30％的氯仿及合并液体积6％的正丁醇震荡混匀，静置过夜；
69.(6)取分液漏斗下层及中间乳化层离心，用80目尼龙网过滤除去固体(蛋白质)后，液相再次倒回分液漏斗震荡混匀，静置过夜(此步骤重复3次)；
70.(7)最终过滤液加热浓缩至粗多糖合并溶液体积的40％，趁热加入10倍体积95％乙醇静置过夜，倾出上清液得精制慈姑组合物；倾出的上清液减压抽干(78℃，
‑
0.08兆帕)，加水(煎煮水体积的0.2％)溶解，再用95％乙醇稀释到水溶液体积的12倍(乙醇含量低于85％)，静置过夜，再次倾出上清液，得少量精制慈姑组合物；合并两部份精制慈姑组合物，真空干燥(60℃，
‑
0.08兆帕)得慈姑组合物产品(慈姑干的2.3％)；利用苯酚
‑
硫酸法对精制慈姑组合物含量进行测定：测定波长490nm，多糖换算因子f＝1.82；在范围20μg
‑
100μg内呈良好线性关系，r＝0.9992。结果表明，供试溶液在2h内显色稳定，重现性好，平均回收率为104％，rsd＝4.72(n＝5)，多糖含量为34.31％。
71.熟地提取物是由下述方法获得的：
72.熟地黄药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。水提醇沉提取工艺如下：以10倍于熟地体积的纯化水将熟地饮片浸泡30min，80℃煎煮2次，每次1h，煎煮时间从沸腾后开始计时；过滤，使滤液浓缩至原体积的1/2，缓慢加入质量百分比为95％的乙醇溶液使滤液中乙醇浓度为质量百分比75％，加入乙醇溶液的同时快速搅拌；静置24h，过滤，沉淀挥发至无乙醇味；真空干燥，粉碎，过120目筛，得熟地提取物。
73.生地提取物是由下述方法获得的：
74.生地黄药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。水提醇沉提取工艺如下：以10倍于生地体积的纯化水将生地饮片浸泡30min，80℃煎煮2次，每次1h，煎煮时间从沸腾后开始计时；过滤，使滤液浓缩至原体积的1/2，缓慢加入质量百分比为95％的乙醇溶液使滤液中乙醇浓度为质量百分比75％，加入乙醇溶液的同时快速搅拌；静置24h，过滤，沉淀挥发至无乙醇味；真空干燥，粉碎，过120目筛，得生地提取物。
75.枸杞子提取物是由下述方法获得的：
76.枸杞子，市售中国宁夏银川市中宁县产枸杞干果。水提法提取工艺如下：将干的枸杞子洗涤5次后，在室温下在双蒸馏水(ph＝7)中浸泡2h，然后压碎。将浸泡过的浆果粉料加入8倍的中性水，均匀混合，并在沸腾温度下煎煮两次，煎煮时长分别为2.0h和1.5h。合并的浓缩汤剂通过中空纤维膜过滤。将以上滤液合并，并在真空下于45℃蒸发干燥，冻干粉碎，过120目筛，得枸杞子提取物。
77.白芨提取物是由下述方法获得的：
78.白芨药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。水提醇沉提取工艺如下：将白芨饮片研磨成粉末，取100g加入1l去离子水超声提取30min；过滤，取滤液浓缩干燥，或者滤液浓缩后加入3
‑
4倍体积乙醇，静置醇沉6
‑
24h，取沉淀并干燥，粉碎，过120目筛，即得白芨提取物。
79.玄参提取物是由下述方法获得的：
80.玄参药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。醇提法提取工艺如下：将玄参饮片研磨成粉末，按玄参粉末质量的10
‑
20倍加入浓度70％
‑
95％的乙醇水溶液，70
‑
90℃热回流提取1
‑
2h；将提取液趁热进行抽滤，随后在50
‑
70℃、60
‑
90kpa条件下浓缩至体积不再变化，干燥，粉碎，过120目筛，即得玄参提取物。
81.升麻提取物是由下述方法获得的：
82.升麻药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。溶剂提取法提取工艺如下：将升麻饮片研磨成粉末，根据升麻粉末质量的10
‑
20倍加入70
‑
95％乙醇，70
‑
90℃热回流提取1
‑
2h；将提取液趁热进行抽滤，随后在50
‑
70℃、60
‑
90kpa条件下浓缩至体积不再变化，干燥，粉碎，过120目筛，得到升麻提取物。
83.泽泻提取物是由下述方法获得的：
84.泽泻药材，购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。醇提法提取工艺如下：将泽泻饮片研磨成粉末，然后加入乙醇进行浸泡提取，浸提后将浸提液与泽泻渣分离，分离后将浸提液进行浓缩，浓缩至无溶剂残留，干燥，粉碎，过120目筛，即为泽泻提取物。
85.实施例1
86.体外细胞实验确定慈姑提取物(ssp)有助于保护过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞hleb3的损伤
87.1实验材料
88.1.1实验细胞
89.人晶状体上皮细胞株hleb3细胞株(浙江大学医学院附属第二医院惠赠)。hleb3细胞接种于含10％胎牛血清、100u
·
ml
‑1青霉素及100u
·
ml
‑1链霉素的dmem高糖培养基中，于37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中静置培养，0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的
细胞用于实验。
90.1.2实验药物
91.慈姑提取物
92.1.3实验试剂与仪器
93.1.3.1实验试剂
94.过氧化氢(h2o2)(北京索莱宝公司)、胰蛋白酶、青链霉素、pbs(武汉赛维尔生物科技有限公司)；dmem高糖培养基、胎牛血清(biological industries公司)；dmso、cck
‑
8、nrf2抗体(proteintech)；活性氧检测试剂盒(ros assay kit，碧云天)；超氧化物歧化酶sod检测试剂盒、丙二醛mda检测试剂盒、谷胱甘肽gsh检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
95.1.3.2实验仪器
96.细胞培养箱(日本sanyo公司)；超净工作台(日本sanyo公司)；高压锅(日本sanyo公司)；酶标仪(美国biored)；倒置显微镜、荧光显微镜(日本olymupus公司)；恒温水浴锅(瓯龙温度仪表厂)；高速离心机(iec)；电子分析天平(德国sartorius公司)；生化培养箱(国华电器)、蛋白质免疫印迹系统(bio
‑
rad)。
97.2实验方法
98.2.1细胞分组
99.取生长状态良好的hleb3细胞接种于培养瓶中，置37℃，5％co2的培养箱内培养，24h后，hleb3细胞全部贴壁生长，用于实验。实验随机分成7组：正常对照组(h2o2‑
/慈姑提取物
‑
)、模型组(h2o2 /慈姑提取物
‑
)、不同浓度治疗组(h2o2 /慈姑提取物0.125、0.25、0.5、1、2mg
·
ml
‑1)。
100.2.2给药方法
101.正常对照组中含细胞及正常培养液；模型组为细胞及含400μm h2o2的培养液；不同浓度治疗组提前给予浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预24h后，弃去培养基后再加入含400μm h2o2的培养液继续培养24h。
102.2.3观察指标和方法
103.2.3.1细胞活力的检测
104.取生长状态良好的hleb3细胞以细胞浓度5
×
104个
·
ml
‑1接种于96孔细胞培养板中，每孔体积100μl，每组设置6个平行孔。置37℃，5％co2的培养箱内培养24h后，hleb3细胞全部贴壁生长。随后根据实验需要对细胞进行处理，经处理后细胞，每孔加入10μl cck
‑
8溶液，再次置于培养箱中孵育1
‑
4小时，随后用酶标仪于450nm处检测每孔的吸光度，重复3次，计算细胞活力。
105.细胞活力＝(实验组od值
‑
空白组od值)/(正常对照组od值
‑
空白组od值)。
106.2.3.2细胞中gsh、sod及mda的检测
107.将细胞随机分为正常对照组(h2o2‑
/慈姑提取物
‑
)、模型组(h2o2400μm/慈姑提取物
‑
)及治疗组(h2o
2 400μm/慈姑提取物1mg
·
ml
‑1)，根据2.2的给药方法进行处理后，提取细胞中的蛋白质，并采用相关试剂盒，检测细胞中抗氧化物gsh和sod，以及脂质过氧化指标mda的表达水平。
108.2.3.3细胞中活性氧的释放
109.利用活性氧检测试剂盒(ros assay kit)，结合流式细胞术检测细胞中ros的释放水平。
110.2.3.4抗氧化关键靶点nrf2的表达
111.采用western blot检测细胞中nrf2的表达。
112.2.4统计学方法
113.统计学分析采用spss 25.0统计软件，所有实验均重复3次以上，2个独立样本组间均数比较用t检验，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用lsd法，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。
114.3结果
115.3.1慈姑提取物对细胞活力无明显影响
116.由图1可知，hleb3细胞用慈姑提取物浓度为0.125、0.25、0.5、1、2mg
·
ml
‑1处理后，利用cck
‑
8法检测细胞活力发现，各组细胞的细胞活力均无明显变化。
117.3.2h2o2最佳造模浓度及慈姑提取物最佳保护浓度测定
118.由图2(a.b)可看出，为明确h2o2对hleb3细胞的时效和量效作用，细胞贴壁后，各组细胞分别用浓度为100、200、400、800、1600μm的h2o2进行干预，24h后利用cck
‑
8对细胞活力进行检测可发现，h2o2浓度为100、200、400μm的干预组别，其细胞活力在50％以上，浓度为800、1600μm的h2o2组别细胞活力大大降低，因此拟以h2o
2 400μm作为造模最佳浓度。而利用400μm的h2o2分别处理细胞2、6、12、24、48h后，利用cck
‑
8法检测细胞活力可发现，处理时间为24h及以内组别的细胞活力均大于50％，而处理时间为48h的hleb3细胞其活力大大降低。综合上述结果，拟采用400μm的h2o2干预hleb3细胞24h作为造模的最佳浓度和时间。
119.由图2(c.d)可看出，为探索慈姑提取物的最佳保护浓度和干预时间，在hleb3细胞贴壁后提前给予0.5、1mg
·
ml
‑1慈姑提取物处理，24h分别加入400μm的h2o2处理24h构建细胞氧化损伤模型，随后利用cck
‑
8检测细胞活力发现，两组细胞活力均大于50％，且1mg
·
ml
‑1慈姑提取物细胞活力更强。随后利用1mg
·
ml
‑1慈姑提取物分别处理hleb3细胞2、6、12、24h后检测其细胞活力情况，发现保护时间为24h的组别保护作用显著提升，细胞活力大于50％。综合上述结果，拟采用提前给予1mg
·
ml
‑1慈姑提取物干预hleb3细胞24h作为最佳保护浓度和时间。
120.3.3慈姑提取物可以提高hleb3细胞中gsh及sod的水平，并降低mda的含量
121.由图3可看出，400μm的h2o2可降低细胞中抗氧化物gsh和sod的表达，上调脂质过氧化物mda的表达，而提前给予1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预可提高细胞gsh和sod同时降低mda的表达，提示提前给予慈姑提取物干预hleb3细胞可通过改善细胞的抗氧化能力来保护hleb3细胞，减少其因h2o2诱导产生的氧化损伤。
122.3.4慈姑提取物可减少hleb3细胞中ros的表达
123.活性氧(ros)是细胞中一种性质活泼的含氧原子或原子团，正常情况下，其表达可被细胞进行调节，因而可在细胞周期、基因表达火鹤体内平衡调节过程中充当信使，但当其大量产生聚集，超过细胞的调节能力，可诱使细胞发生氧化应激，进而触发氧化损伤机制，最终或会导致细胞凋亡的发生。因此，对于hleb3细胞中ros释放水平的检测有助于评定细胞的氧化损伤水平。本研究利用活性氧检测试剂盒，如图4所示，通过对正常对照组、模型组、慈姑提取物治疗组以及ros阳性组细胞中ros进行检测发现，模型组中ros表达较正常对
照组和慈姑提取物治疗组高，提示提前给予1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物对细胞进行保护干预，可有效降低hleb3细胞中ros的释放和聚集，纠正细胞的氧化损伤水平。
124.3.5慈姑提取物可上调nrf2的表达
125.nrf2是细胞中重要的抗氧化靶点，通过对nrf2水平的检测有助于评定细胞的抗氧化能力。通过对正常对照组(h2o2‑
/慈姑提取物
‑
)、模型组(h2o2 /慈姑提取物
‑
)、慈姑提取物治疗组(h2o2 /慈姑提取物 )以及慈姑提取物模型组(h2o2‑
/慈姑提取物 )中nrf2含量进行检测可发现，模型组中nrf2水平明显降低，而提前给予慈姑提取物干预保护hleb3细胞可恢复并上调细胞中nrf2的表达，提示慈姑提取物对hleb3的保护作用或与调控nrf2的表达，提高hleb3细胞的抗氧化能力相关。
126.实施例2
127.晶状体体外离体培养实验确定慈姑提取物有助于延缓过氧化氢诱导的晶状体混浊
128.1实验材料
129.1.1实验组织
130.兔子晶状体(日本大耳白兔，普通级，雌雄各半)，大鼠晶状体(sd大鼠，雌雄各半)。所获晶状体置于含5k u
·
l
‑1青霉素、50k u
·
l
‑1链霉素的m
‑
199培养基，并于37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中静置培养。取材培养24h后选取透明晶状体用于后续实验。
131.1.2实验药物
132.慈姑提取物
133.1.3实验试剂与仪器
134.1.3.1实验试剂
135.过氧化氢(h2o2)(北京索莱宝公司)、二氧化碳、青链霉素、pbs、眼球固定液、(武汉赛维尔生物科技有限公司)；med ium199(m
‑
199)培养基、hank’s试剂(biological industries公司)；复方托吡卡胺滴眼液(参天制药株式会社)；nrf2抗体、keap1抗体、ho
‑
1抗体(proteintech)；bax抗体、bcl2抗体(abcam)。
136.1.3.2实验仪器
137.恒温培养箱(日本sanyo公司)；超净工作台(日本sanyo公司)；高压锅(日本sanyo公司)；酶标仪(美国biored)；倒置显微镜(日本olymupus公司)；恒温水浴锅(瓯龙温度仪表厂)；高速离心机(iec)；电子分析天平(德国sartorius公司)；蛋白质免疫印迹系统(bio
‑
rad)；手持数字化裂隙灯显微镜(苏州康捷医疗股份有限公司)。
138.2实验方法
139.2.1晶状体取材
140.兔子和大鼠均用复方托吡卡胺滴眼液散瞳后于裂隙灯显微镜下检查晶状体的透明性，选择晶状体透明的兔子/大鼠进行实验。兔子采取二氧化碳吸入法处死，大鼠采用颈椎脱臼法处死。随后用体积分数为75％的乙醇擦拭双眼睑周围，摘出眼球后将其置于hank’s试剂中清洗血液，漂洗两次后在超净工作台上，于无菌环境下用灭菌的显微剪刀在角巩膜后缘约0.2mm处剪开并小心分离晶状体，并在hank’s试剂中剥离残存玻璃体组织，随后所得完整的晶状体放入5k u
·
l
‑1青霉素、50k u
·
l
‑1链霉素的m
‑
199培养基，并于37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中静置培养，培养24h后选取透明晶状体用于后续实验。所有透明晶状体
按照实验需求随机分组，如正常对照组(h2o2‑
/慈姑提取物
‑
)、模型组(h2o2 /慈姑提取物
‑
)、不同浓度治疗组(0.5、1、2mg
·
ml
‑1)。
141.2.2给药方法
142.2.2.1兔子离体晶状体给药方法
143.正常对照组中含有晶状体及正常培养基；不同浓度h2o2处理组为晶状体及含200、400、800、1600及3200μm h2o2的m
‑
199培养基；不同浓度慈姑提取物治疗组为晶状体及含0.5、1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物，慈姑提取物干预24h后，弃去培养基，加入含3200μm h2o2的m
‑
199培养基继续培养48h。
144.2.2.2大鼠离体晶状体的给药方法
145.正常对照组中含有晶状体及正常培养基；模型组含晶状体及400μm h2o2的m
‑
199培养基；治疗组晶状体经1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预治疗24h后，加入含400μm h2o2的m
‑
199培养基继续培养36h。
146.2.3观察指标和方法
147.2.3.1晶状体透明度观察及量化
148.将所观察晶状体分别于12、24、48h在光学显微镜下观察，以白底黑色“井”状为背景，观察晶状体的混浊程度，并拍摄照片。利用image j软件分析图像中黑色“井”字交叉点的灰度和邻近交叉点白色背景的灰度值，两者之差即为相对灰度值。
149.2.3.2显微形态观察
150.实验各组中，随机选取晶状体并用眼球专用固定液进行固定，并进行苏木精
‑
伊红染色，随后于显微镜下观测晶状体上皮细胞和皮质层的病理变化。
151.2.3.3晶状体中nrf2的检测
152.nrf2是晶状体中重要的抗氧化物,通过检测其蛋白的表达有助于评定晶状体的抗氧化水平，拟采用western blot检测晶状体中nrf2的表达。
153.2.3.4晶状体中抗氧化物相关指标的检测
154.血红素加氧酶1(ho
‑
1)为nrf2依赖的抗氧化通路下游重要的抗氧化物酶，而keap1为nrf2的负调控因子，采用western blot检测其表达可辅助说明晶状体的抗氧化水平变化。
155.2.3.5凋亡相关蛋白bax、bcl2和炎症因子tnf
‑
α的检测
156.b淋巴细胞瘤
‑
2基因(bcl2)及其同源的水溶性相关蛋白bax是凋亡中重要的两个蛋白。肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)是炎症反应中一类重要的促炎因子。采用western blot检测上述三类蛋白的表达可辅助说明慈姑提取物对晶状体的氧化损伤的保护作用。
157.3结果
158.3.1慈姑提取物可延缓h2o2诱导的兔子离体晶状体混浊发生
159.3.1.1 h2o2延缓晶状体混浊的时效及量效作用
160.由图6可看出，与正常对照组相比，h2o2浓度越高，对晶状体透明度的影响越大。当用不同浓度h2o2干预离体晶状体24h时，除正常对照组，各组晶状体均出现轻度混浊现象，且h2o2浓度为800、1600及3200μm干预的晶状体表面粗糙，培养基中含有少量碎屑。当h2o2干预时间为48h时，与正常对照组相比，不同浓度h2o2干预组的晶状体出现明显的混浊，200、400及800μm h2o2处理的晶状体中心混浊较周围明显，而1600及3200μm h2o2处理的晶状体出现
整体混浊，且晶状体外观有明显裂痕，培养基有较多碎屑。提示h2o2浓度越高，干预时间越长，对晶状体透明度的影响越大。
161.3.1.2慈姑提取物对晶状体的保护作用
162.图7(a)为兔子离体晶状体的混浊情况，可发现提前给予0.5、1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预保护慈姑提取物处理组晶状体混浊程度改善。当加入h2o2干预24h时，慈姑提取物处理组晶状体可见轻度混浊，晶状体外形无明显变化，而模型组除有轻度混浊，晶状体表明出现轻微裂痕，培养基有少量碎屑。当h2o2干预48h时，模型组晶状体整体混浊，且晶状体外观破裂，而慈姑提取物处理组晶状体中心部出现混浊，混浊程度由中心向四周减轻，且1mg
·
ml
‑1慈姑提取物干预的晶状体混浊程度较0.5mg
·
ml
‑1慈姑提取物处理组要轻。从两个时间段各组晶状体相对灰度值的计算结果也可看出，提前给予慈姑提取物处理可有效延缓晶状体混浊的发展，且1mg
·
ml
‑1慈姑提取物提前干预24h的保护效果更为理想。
163.3.1.3光学显微镜下慈姑提取物对晶状体混浊的影响
164.由图8可见，正常对照组(a)透明正常，隐约可见紧密排列的晶体纤维；而400μm h2o2处理组(b)在晶状体内可见明显的云雾状混浊，透光性较差；3200μm h2o2处理组(c)完全混浊，透光性差；而治疗组(d)可见云雾状混浊，但较400μm h2o2处理组明显减轻，且仍见部分区域透光性良好。可见提前给予慈姑提取物可有效改善h2o2诱导的兔子离体晶状体混浊的发生发展。
165.3.2慈姑提取物对大鼠离体晶状体混浊的改善作用
166.从图9(a)可看出，与正常对照组相比，当400μm h2o2干预时间为24h时，模型组的晶状体已出现轻度混浊，而治疗组晶状体同正常对照组一样仍保持清澈透明。当干预时间持续至36h，模型组晶状体整体混浊，而治疗组晶状体仅有轻微混浊出现。在前述兔子离体晶状体培养的实验基础上，利用大鼠离体晶状体进一步证明了提前给予慈姑提取物(1mg
·
ml
‑1)干预晶状体可有效延缓晶状体混浊的发生发展。
167.3.3大鼠晶状体病理情况
168.晶状体是由晶状体囊膜、晶状体上皮细胞层、晶状体皮质层以及晶状体核组成的透明、无血管组织。晶状体囊是一层富于弹性无细胞的透明薄膜，而晶状体上皮细胞是晶状体中唯一具有活性的细胞，皮质层以及晶状体核的细胞均为晶体纤维细胞，因此观察晶状体细胞的形态变化，有助于判定晶状体的代谢状态。
169.如图10所示，利用显微镜观察正常对照组(a)的he染色病理切片，结果可看出晶状体囊膜完整，上皮细胞中相邻细胞排列紧密，皮质层纤维排列整齐，细胞膜结构清晰完整，细胞核呈蓝色且结构完整，细胞质呈红色且均匀，核部纤维细胞间结合紧密，轮廓清晰；损伤模型组(b)可见晶状体囊膜破裂，并有明显的晶状体上皮细胞溶解破坏，视野中未见上皮细胞层部位有蓝色细胞核，细胞排列不规则，细胞大小不一，胞质呈红色但不均匀，且部分皮质纤维严重肿胀甚至破裂，部分细胞膜溶解破坏，近周边部可看到大量空泡化；慈姑提取物治疗组(c)可见晶状体囊膜完整，上皮细胞排列紧密，细胞间的连接接近正常，并且细胞质呈红色分布均匀，细胞核呈蓝色且结构完整，晶状体皮质层纤维细胞结合紧密，排列较整齐，部分晶体纤维及晶体上皮细胞出现轻微肿胀，未见空泡化现象；慈姑提取物对照组(d)中晶状体囊膜完整，上皮细胞排列紧密整齐，细胞膜及细胞核完整，无细胞肿胀以及细胞空泡化现象出现，晶状体整体与正常对照组无异。
170.可见，提前给予慈姑提取物干预保护可有效保护晶状体上皮细胞层被破坏，维持晶状体代谢稳定，防止晶状体上皮细胞或纤维细胞出现排列不规则、肿胀、破裂甚至空泡化现象，进而延缓晶状体混浊的发生发展。且慈姑提取物对照组的he染色切片结果提示其晶状体上皮细胞层以及晶体纤维均与正常对照组无异。
171.3.4慈姑提取物可上调晶状体中nrf2的表达量
172.图11可看出，与正常对照组相比，h2o2可导致晶状体中nrf2的表达下降，而提前给予1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预保护可恢复细胞nrf2的表达，提示慈姑提取物对晶状体混浊的改善作用或与调控nrf2的表达相关。
173.3.5慈姑提取物可下调keap1并上调晶状体中ho
‑
1的表达
174.keap1是nrf2的负调控因子，而ho
‑
1是受nrf2调控的、抗氧化通路中一类重要的抗氧化酶。由图12可看出，与正常对照组相比，h2o2可导致晶状体中keap1的表达下降，说明h2o2可导致晶状体发生氧化损伤，下调的keap1提示nrf2依赖的抗氧化系统被激活；而提前给予1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预保护可恢复细胞keap1的表达，说明慈姑提取物的保护作用与调控nrf2的表达相关。此外，较正常对照组，模型组ho
‑
1的表达较高，提示为抵抗晶状体的氧化损伤，晶状体细胞提高了自身的抗氧化水平，也提示nrf2下游抗氧化系统的激活，而治疗组相较模型组，ho
‑
1的表达水平更高，提示治疗组晶状体的抗氧化水平较模型组更高，这有助于辅助说明慈姑提取物对晶状体的保护作用与提升晶状体抗氧化能力相关。
175.3.6慈姑提取物可上调晶状体中bcl2并下调bax、tnf
‑
α的表达
176.tnf
‑
α是细胞中一类炎症因子，一般与细胞的炎症反应相关，而bax和bcl2为细胞凋亡相关蛋白，有助于阐述细胞凋亡情况。由图13可看出，与正常对照组相比，h2o2可导致晶状体中tnf
‑
α及bax表达升高，bcl2表达水平下降，提示炎症反应及细胞凋亡情况增强；而提前给予1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预，可一定程度下调tnf
‑
α及bax的表达，提高bcl2的表达，提示慈姑提取物对晶状体的保护作用或与调控晶状体细胞炎症反应以及细胞凋亡相关。
177.实施例3
178.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成。其中，慈姑提取物60kg、熟地提取物10kg、生地提取物10kg、枸杞子提取物10kg、白芨提取物10kg、玄参提取物10kg、升麻提取物5kg和泽泻提取物5kg。
179.上述具有延缓晶状体混浊功能的组合物的制备方法，具体制备步骤如下：
180.(1)按组方量称取慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物为原料；
181.(2)各组分混合均匀即得。
182.实施例4
183.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成。其中，慈姑提取物70kg、熟地提取物15kg、生地提取物15kg、枸杞子提取物15kg、白芨提取物5kg、玄参提取物5kg、升麻提取物5kg和泽泻提取物5kg。
184.制备方法同实施例3。
185.实施例5
186.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成。其中，慈姑提取物70kg、熟地提取物5kg、生地提取物5kg、枸杞子提取物5kg、白芨提取物15kg、玄参提取物15kg、升麻提取物15kg和泽泻提取物5kg。
187.制备方法同实施例3。
188.实施例6
189.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成。其中，慈姑提取物70kg、熟地提取物15kg、生地提取物15kg、枸杞子提取物15kg、白芨提取物15kg、玄参提取物15kg、升麻提取物10kg和泽泻提取物10kg。
190.制备方法同实施例3。
191.实施例7
192.一种用于延缓晶状体混浊的组合物，有效成分由慈姑提取物、熟地提取物、生地提取物、枸杞子提取物、白芨提取物、玄参提取物、升麻提取物和泽泻提取物组成。其中，慈姑提取物50kg、熟地提取物5kg、生地提取物5kg、枸杞子提取物5kg、白芨提取物5kg、玄参提取物5kg、升麻提取物5kg和泽泻提取物15kg。
193.制备方法同实施例3。
194.实施例3
‑
7之一所述各组分用量按照相同比例增加或减少，所得各组分的重量份数关系均属于本发明的保护范围。
195.组方分析：
196.慈姑(sagittaria sagittifolia l)药食兼用，又名茨菇、燕尾草和剪刀草等，为原产于我国的泽泻科水生草本植物的球茎，其资源丰富、价格低廉。慈姑性味苦甘，性微寒，无毒，归肺、肝、脾、膀胱经，具有滋养强身、清热解毒、清肺止咳及消肿散结的功效，对其植物化学分析发现，慈姑含有多糖、酚类、萜类和黄酮等活性成分。其中，慈姑多糖(sagittaria sagittifolin polysaccharide,ssp)是实施例中慈姑提取物的主要活性成分，近年来报道具有明显的抗氧化、保肝、免疫调节、抗肿瘤和降脂降糖的作用。经实施例1、2证实慈姑含有保护晶状体的活性成分和丰富的抗氧化营养素，在延缓晶状体混浊、防治白内障方面功效显著。
197.熟地提取物取自熟地黄。熟地黄入肝、肾经，具有补血滋阴、益精填髓的作用，符合老年白内障发病过程中肝、肾虚损，精、气、血不能上荣于目的特点。
198.生地提取物取自生地黄。生地黄入心、肝、肾经，具有养阴生津。是多种以滋阴补肾为治法的治疗白内障方药中的重要组分。
199.枸杞子提取物取自枸杞子。枸杞子入肝、肾经，具有填补肝肾，益精明目的作用。可配合诸药以滋补肝肾、调养精血进而消障退翳。
200.白芨提取物取自白芨。白芨入肺、肝、胃经，具有收敛止血，消肿生肌作用。老年白内障患者肝肾不足，肺金瘀滞，白芨可逐肺金之瘀，延缓其积聚。
201.玄参提取物取自玄参。玄参入肺、胃、肾经，具有凉血滋阴，泻火解毒作用。可助肾水滋生以防止晶状体混浊。
202.升麻提取物取自升麻。升麻入肺、脾、胃、大肠经，具有升阳，发表，透疹，解毒作用。
与诸药相合，载药上行，生水逐瘀以达到明目退翳之功。
203.泽泻提取物取自泽泻。泽泻入肾经、膀胱经，具有利湿泻浊之功，与诸药相合，补中有泻，共奏滋阴补肾，生水逐瘀以明目退翳的作用。
204.上述各组分相互协同作用，延缓晶状体混浊的效果显著。
205.实验例
206.晶状体体外离体培养实验确定慈姑组合物有助于延缓过氧化氢诱导的晶状体混浊
207.1实验材料
208.1.1实验组织
209.大鼠晶状体(sd大鼠，雌雄各半)。所获晶状体置于含5k u
·
l
‑1青霉素、50k u
·
l
‑1链霉素的m
‑
199培养基，并于37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中静置培养。取材培养24h后选取透明晶状体用于后续实验。
210.1.2实验药物
211.上述慈姑提取物、实施例3所述慈姑组合物。
212.1.3实验试剂与仪器
213.1.3.1实验试剂
214.过氧化氢(h2o2)(北京索莱宝公司)、二氧化碳、青链霉素、pbs、眼球固定液、(武汉赛维尔生物科技有限公司)；medium199(m
‑
199)培养基、hank’s试剂(biological industries公司)；复方托吡卡胺滴眼液(参天制药株式会社)。
215.1.3.2实验仪器
216.恒温培养箱(日本sanyo公司)；超净工作台(日本sanyo公司)；高压锅(日本sanyo公司)；手持数字化裂隙灯显微镜(苏州康捷医疗股份有限公司)。
217.2实验方法
218.2.1晶状体取材
219.大鼠晶状体取材方式如前实施例2。
220.大鼠用复方托吡卡胺滴眼液散瞳后于裂隙灯显微镜下检查晶状体的透明性，选择晶状体透明的大鼠进行实验。大鼠采用颈椎脱臼法处死。随后用体积分数为75％的乙醇擦拭双眼睑周围，摘出眼球后将其置于hank’s试剂中清洗血液，漂洗两次后在超净工作台上，于无菌环境下用灭菌的显微剪刀在角巩膜后缘约0.2mm处剪开并小心分离晶状体，并在hank’s试剂中剥离残存玻璃体组织，随后所得完整的晶状体放入5k u
·
l
‑1青霉素、50k u
·
l
‑1链霉素的m
‑
199培养基，并于37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中静置培养，培养24h后选取透明晶状体用于后续实验。所有透明晶状体按照实验需求随机分组，如正常对照组(h2o2‑
/慈姑提取物
‑
/慈姑组合物
‑
)、模型组(h2o2 /慈姑提取物
‑
/慈姑组合物
‑
)、慈姑提取物组(h2o2 /慈姑提取物 /慈姑组合物
‑
)、慈姑组合物组(h2o2 /慈姑提取物
‑
/慈姑组合物 )。
221.2.2给药方法
222.正常对照组中含有晶状体及正常培养基；模型组含晶状体及400μm h2o2的m
‑
199培养基；慈姑提取物治疗组晶状体经1mg
·
ml
‑1的慈姑提取物干预治疗24h后，加入含400μm h2o2的m
‑
199培养基继续培养24h；慈姑组合物治疗组晶状体经1mg
·
ml
‑1的慈姑组合物干预
治疗24h后，加入含400μm h2o2的m
‑
199培养基继续培养24h。
223.2.3晶状体透明度观察及量化
224.将所观察晶状体分别于24、48h在光学显微镜下观察，以白底黑色“井”状为背景，观察晶状体的混浊程度，并拍摄照片。利用image j软件分析图像中黑色“井”字交叉点的灰度和邻近交叉点白色背景的灰度值，两者之差即为相对灰度值。
225.3.结果
226.如图14
‑
15所示，可发现提前给予慈姑提取物或者慈姑组合物干预，晶状体混浊程度均得到明显改善。当加入h2o2干预24h时，慈姑提取物组以及慈姑组合物处理组的晶状体均可见轻度混浊，慈姑提取物处理组晶状体混浊程度更明显，两组外形无明显变化，而模型组出现明显混浊，且培养基有少量碎屑。当h2o2干预48h时，模型组晶状体整体混浊，而慈姑提取物处理组和慈姑组合物组的晶状体混浊程度稍微增强，仍可看清黑色网格线，且慈姑组合物组的混浊程度更轻。
227.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。