一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，特别是一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.肺纤维化（pulmonary fibrosis，pf）是一种慢性进展性肺疾病，病死率极高，诊断后患者平均生存期为3
‑
5年。pf发病机制尚不明确，以肺间质内细胞外基质过度沉积、肺泡大面积塌陷为特征，最终因呼吸衰竭而导致死亡。目前只有吡非尼酮（pirfenidone，pfd）和尼达尼布被批准用于pf治疗，虽然这两种药物能延缓肺活量下降的速度，但无法恢复肺功能。此外，肺作为人体与外界环境直接接触的器官，具有很强的防御系统以抵抗外来物侵害，其中肺表面活性剂层是外来物进入肺组织的主要屏障。因此，实现肺功能恢复及药物向肺组织高效转运对提高pf患者生存率具有重要意义。
3.肺泡作为肺内气体交换的主要场所，其微观结构直接影响着肺功能。但在pf发病过程中，由于细胞外基质过度沉积，肺泡大面积塌陷，导致气体交换受阻。因此，可以通过重建肺泡结构恢复肺功能。肺表面活性剂是维持肺泡结构稳定的主要因素，其由肺泡ⅱ型上皮细胞（type
ꢀⅱꢀ
alveolar epithelial cell，aec
ꢀⅱ
）合成、分泌。而在pf患者肺组织中，由于氧化应激，aec
ꢀⅱ
功能受损，无法合成肺表面活性剂。修复aec
ꢀⅱ
已成为肺功能恢复的一个常用手段。
4.随着纳米科学与技术的快速发展，纳米仿生技术在药物递送系统方面已取得了巨大进步。目前，这些仿生纳米粒主要通过内源性物质伪装，模拟生物体。这种仿生技术最大程度保留了生物体的特性，但极大受限于取材的难易度。肺表面活性剂是覆盖在肺泡表面的一层脂质蛋白复合物，很难从生物体内直接获取。同时肺表面活性剂又以多种形式存在于肺组织中，依据代谢过程可大致分为三类：管状髓磷脂（新分泌的肺表面活性剂直接转变而成，结构复杂）、多层结构（将继续在肺泡表面参与循环）、单层小体（肺泡表面使用过的肺表面活性剂形成）。其中模拟肺表面活性剂的多层结构，是纳米仿生体进入肺表面活性剂循环，实现药物向肺组织高效转运的一个有效技术途径。
5.因此采用纳米仿生技术，以肺表面活性剂功能性成分为原料，模拟肺表面活性剂在肺泡表面的多膜结构，构建肺表面活性剂纳米仿生体（psbs），作为向肺组织高效转运的药物递送载体。结合抗纤维化药物吡非尼酮（pfd）和活性氧清除剂虾青素（astaxanthin，ast）这两种药物的作用位点及肺表面活性剂循环特性，将pfd包载在psbs的水溶性内核中，ast负载在psbs的脂质膜中，得到psbs/ast@pfd。当psbs经吸入性给药到达肺泡后，因组成、结构与ps相似，psbs脂质膜逐渐与ps相融合，为肺泡补给功能性肺表面活性剂的同时，脂质膜负载的ast随着肺表面活性剂循环被逐渐转运至aecⅱ并修复其功能。与此同时，包裹在psbs内核中的pfd被原位释放至肺表面活性剂层内侧，成功跨过肺表面活性剂层，有效进入肺组织间质发挥疗效。但至今未见有公开道。


技术实现要素：

6.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法及其应用，可有效解决吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备及增强抗肺纤维化治疗提高疗效的用药问题。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法，采用纳米仿生技术，以肺表面活性剂功能性成分为材料，模拟肺表面活性剂在肺泡表面的多膜结构，利用薄膜分散法制备肺表面活性剂纳米仿生体（psbs），同时在其脂质层负载活性氧清除剂虾青素（ast），内核中包载抗肺纤维化药物吡非尼酮（pfd），构建具有修复、治疗一体化的纳米药物递送系统的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体，具体包括以下步骤：（1）将5～30mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、2～10mg胆固醇（cho）、3～20mg卵磷脂（pc）三种脂质材料分别溶于5～30ml氯仿中，然后将配制的溶液涡旋震荡混匀，保存放于4℃备用；称取5～10mg虾青素溶于氯仿，配制成浓度为2～3mg/ml虾青素溶液；（2）按照质量比dppc：cho：pc=6:1:3的比例取步骤（1）中配制好的相应脂质材料溶液以及虾青素溶液置入瓶中，在43℃、压强0.05
‑
0.06kpa的条件下进行旋蒸，除去溶剂，瓶内壁得到一层均匀的白色薄膜，加入2ml浓度为2mg/ml吡非尼酮（pfd）水溶液水化，将得到的溶液转移至离心管（ep管）；（3）将步骤（2）中离心管（ep管）内的溶液利用超声波细胞粉碎机进行冰浴探超处理，探超条件为：工作5s，间歇6s，总工作时间2min，功率100w，使其形成单层囊泡；（4）将步骤（3）得到的单层囊泡溶液中加入400～500
µ
l浓度为2mg/ml的ca
2
溶液，进行涡旋5min，再冰浴探超，冰上以100w功率，探超2min，两者交替进行1h，得肺表面活性剂纳米仿生体。
8.所述的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的粒径为150～200nm。
9.所述方法制备的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体在制备增强抗肺纤维化治疗提高疗效药物中的应用。
10.所述方法制备的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体作为载药系统在制备实现治疗、修复一体化药物中的应用。
11.本发明制备方法简单，所制备的纳米仿生体在修复肺泡ⅱ型上皮细胞功能的同时，及时向受损肺泡补给功能性肺表面活性剂，从而快速有效修复肺功能。另一方面，增强了吡非尼酮的治疗效果，使吡非尼酮成功跨过肺表面活性剂层，提高吡非尼酮向肺组织的高效转运。该递送系统协同增强肺纤维化治疗，有效增强吡非尼酮治疗效果，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
12.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
13.本发明在具体实施中，由以下实施例给出。
14.实施例1本发明一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法，包括以下步骤：（1）将17.5mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、6mg胆固醇（cho）、11.5mg卵磷脂（pc）
三种脂质材料分别溶于27.5ml氯仿中，然后将配制的溶液涡旋震荡混匀，保存放于4℃备用；称取7.5mg虾青素溶于氯仿，配制成浓度为2.5mg/ml虾青素溶液；（2）按照质量比dppc：cho：pc=6:1:3的比例取步骤（1）中配制好的相应脂质材料溶液以及虾青素溶液置入瓶中，在43℃、压强0.055kpa的条件下进行旋蒸，除去溶剂，瓶内壁得到一层均匀的白色薄膜，加入2ml浓度为2mg/ml吡非尼酮（pfd）水溶液水化，将得到的溶液转移至离心管（ep管）；（3）将步骤（2）中离心管（ep管）内的溶液利用超声波细胞粉碎机进行冰浴探超处理，探超条件为：工作5s，间歇6s，总工作时间2min，功率100w，使其形成单层囊泡；（4）将步骤（3）得到的单层囊泡溶液中加入450
µ
l浓度为2mg/ml的ca
2
溶液，进行涡旋5min，再冰浴探超，冰上以100w功率，探超2min，两者交替进行1h，得肺表面活性剂纳米仿生体。
15.实施例2本发明一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体载药系统的制备方法，包括以下步骤：（1）将20.3mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、5.8mg胆固醇（cho）、12.4mg卵磷脂（pc）三种脂质材料分别溶于5ml氯仿中，然后将配制的溶液涡旋震荡混匀，保存放于4℃备用；称取5.2mg虾青素溶于氯仿，配制成浓度为2.6mg/ml虾青素溶液；（2）按照质量比dppc：cho：pc=6:1:3的比例取步骤（1）中配制好的相应脂质材料溶液以及虾青素溶液置入茄形瓶中，旋转蒸发仪水浴锅在43℃、压强0.05
‑
0.06kpa的条件下进行旋蒸，除去溶剂，茄形瓶内壁得到一层均匀的白色薄膜，加入2ml浓度为2mg/ml吡非尼酮（pfd）水溶液水化，将得到的溶液转移至离心管（ep管）；（3）将步骤（2）中离心管（ep管）内的溶液利用超声波细胞粉碎机进行冰浴探超处理，探超条件为：工作5s，间歇6s，总工作时间2min，功率100w，使其形成单层囊泡；（4）将步骤（3）得到的单层囊泡溶液中加入400
µ
l浓度为2mg/ml的ca
2
溶液，进行涡旋5min，再冰浴探超，冰上以100w功率，探超2min，两者交替进行1h，得肺表面活性剂纳米仿生体。
16.实施例3本发明一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体载药系统的制备方法，包括以下步骤：（1）将18.7mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、5.1mg胆固醇（cho）、11.3mg卵磷脂（pc）三种脂质材料分别溶于5ml氯仿中，然后将配制的溶液涡旋震荡混匀，保存放于4℃备用；称取4.8mg虾青素溶于氯仿，配制成浓度为2.4mg/ml虾青素溶液；（2）按照质量比dppc：cho：pc=6:1:3的比例取步骤（1）中配制好的相应脂质材料溶液以及虾青素溶液置入茄形瓶中，旋转蒸发仪水浴锅在43℃、压强0.05
‑
0.06kpa的条件下进行旋蒸，除去溶剂，茄形瓶内壁得到一层均匀的白色薄膜，加入2ml浓度为2mg/ml吡非尼酮（pfd）水溶液水化，将得到的溶液转移至离心管（ep管）；（3）将步骤（2）中离心管（ep管）内的溶液利用超声波细胞粉碎机进行冰浴探超处理，探超条件为：工作5s，间歇6s，总工作时间2min，功率100w，使其形成单层囊泡；（4）将步骤（3）得到的单层囊泡溶液中加入400
µ
l浓度为2mg/ml的ca
2
溶液，进行涡
旋5min，再冰浴探超，冰上以100w功率，探超2min，两者交替进行1h，得肺表面活性剂纳米仿生体。
17.实施例4本发明一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体载药系统的制备方法，包括以下步骤：（1）将19.8mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、5.7mg胆固醇（cho）、11.2mg卵磷脂（pc）三种脂质材料分别溶于5ml氯仿中，然后将配制的溶液涡旋震荡混匀，保存放于4℃备用；称取5mg虾青素溶于氯仿，配制成浓度为2mg/ml虾青素溶液；（2）按照质量比dppc：cho：pc=6:1:3的比例取步骤（1）中配制好的相应脂质材料溶液以及虾青素溶液置入茄形瓶中，旋转蒸发仪水浴锅在43℃、压强0.05
‑
0.06kpa的条件下进行旋蒸，除去溶剂，茄形瓶内壁得到一层均匀的白色薄膜，加入2ml浓度为2mg/ml吡非尼酮（pfd）水溶液水化，将得到的溶液转移至离心管（ep管）；（3）将步骤（2）中离心管（ep管）内的溶液利用超声波细胞粉碎机进行冰浴探超处理，探超条件为：工作5s，间歇6s，总工作时间2min，功率100w，使其形成单层囊泡；（4）将步骤（3）得到的单层囊泡溶液中加入500
µ
l浓度为2mg/ml的ca
2
溶液，进行涡旋5min，再冰浴探超，冰上以100w功率，探超2min，两者交替进行1h，得肺表面活性剂纳米仿生体。
18.所述的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的粒径为150～200nm。
19.所述实施例1
‑
4方法制备的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体在制备增强抗肺纤维化治疗提高疗效药物中的应用。
20.所述实施例1
‑
4方法制备的吸入式肺表面活性剂纳米仿生体作为载药系统在制备实现治疗、修复一体化药物中的应用。
21.由上述可以看出，本发明的技术方案是，一种吸入式肺表面活性剂纳米仿生体的制备方法，采用纳米仿生技术，以肺表面活性剂功能性成分为材料，模拟肺表面活性剂在肺泡表面的多膜结构，利用薄膜分散法制备肺表面活性剂纳米仿生体（psbs），同时在其脂质层负载活性氧清除剂虾青素（ast），内核中包载抗肺纤维化药物吡非尼酮（pfd），构建具有修复、治疗一体化的纳米药物递送系统，协同增强肺纤维化治疗，并经实验，取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下（以实施例1为例）：实验1：psbs/ast@pfd纳米药物递送系统对人脐静脉内皮细胞的毒性实验体外细胞毒性试验以人脐静脉内皮细胞为研究对象，设置空白对照组、pfd组和psbs/ast@pfd组，用不同浓度的pfd对细胞进行处理，继续培养24h，通过cck
‑
8法考察其对血管内皮细胞的毒性。结果表明，psbs/ast@pfd纳米载体对血管内皮细胞的活性影响很小，能较安全的与肺泡表面肺表面活性剂融合发挥作用。
22.实验2：psbs纳米仿生体肺部分布形式实验以博来霉素诱导的肺纤维化小鼠作为给药动物模型，通过吸入性给药方式考察三种纳米载体的肺部分布形式。实验设置三组：1、单膜纳米囊泡组（uvs@dio）；2、阳离子纳米囊泡组（pvs@dio）；3、纳米仿生体组（psbs@dio）。采用市售雾化仪，按照15mg/kg的给药量对各组小鼠进行雾化给药。给药结束4h后避光解剖各组小鼠取肺组织，用镊子轻轻夹住肺组织用生理盐水清洗干净，放入锡箔纸包被的ep管中，放入
‑
80℃冰箱中保存送样。结果表明，
psbs@dio与其他两组相比，psbs在肺部荧光亮度强，肺部吸入量多，表明psbs更有可能借助肺表面活性剂循环分布在肺组织中。
23.实验3：psbs纳米仿生体转运pfd进入肺部能力考察实验以博来霉素诱导的肺纤维化小鼠作为给药动物模型，通过吸入性给药方式考察psbs携带抗纤维化药物pfd进入肺部的渗透能力。实验设置三组：1、单膜纳米囊泡组（uvs@rb）；2、阳离子纳米囊泡组（pvs@rb）；3、纳米仿生体组（psbs@rb）。采用市售雾化仪，按照15mg/kg的给药量对各组小鼠进行雾化给药。给药结束4h后避光解剖各组小鼠取肺组织，用镊子轻轻夹住肺组织用生理盐水清洗干净，放入锡箔纸包被的ep管中，放入
‑
80℃冰箱中保存送样。结果表明，psbs@rb与其他两组相比，psbs携带的rb肺部荧光亮度强。因此，psbs通过与肺泡表面的肺表面活性剂融合并借助肺表面活性剂循环，使pfd跨过肺表面活性剂层障碍，增强pfd向肺组织的高效转运。
24.实验4：psbs/ast@pfd纳米药物递送系统体内抗肺纤维化实验将小鼠麻醉后，采用口咽部滴入博来霉素诱导小鼠肺纤维化动物模型。建立模型10天后进行给药治疗。实验分组如下：1）空白健康小鼠组（normal）；2）博来霉素模型组（blm）；3）吡非尼酮组（pfd）；4）单膜囊泡组（uvs/ast@pfd）；5）阳离子纳米囊泡组（pvs/ast@pfd）；6）纳米仿生体组（psbs/ast@pfd）。每天给药1次，共连续给药14次。结束治疗取各组小鼠肺组织行h&e染色和masson染色，将切片置于显微镜下观察各组肺泡形态及胶原沉积量并拍照。实验结果表明，psbs/ast@pfd组肺泡间隔厚度和肺泡腔大小接近正常，胶原沉积量减少。psbs/ast@pfd具有良好的抗纤维化效果，提高生存率。
25.本发明除在做上述四个重复实验的同时，还对实施例2
‑
4给出的产品做了同样的实验，均取得了相同和相近似的结果，这里不一一列举，实验表明，方法稳定可靠，产品效果好，与现有技术相比，具有以下有益技术效果：（1）快速修复肺功能：采用“里应外合”的药物，纳米仿生体脂质层包载的ast中和氧化应激产物修复受损肺泡ⅱ型上皮细胞功能的同时，及时向受损肺泡补给功能性肺表面活性剂，从而实现对肺功能的快速双重修复；（2）具有精准靶向递送药物的作用：将ast与pfd分别包载在psbs脂质层与内核中，经吸入性给药到达肺泡后，ast随着肺表面活性剂循环被逐渐转运至肺泡ⅱ型上皮细胞，内核中的pfd被原位释放至肺表面活性剂层内侧，直接进入肺组织间质发挥疗效，提高了pfd的抗纤维化效果；（3）基于高度仿生肺表面活性剂并模拟肺表面活性剂在肺泡表面的多膜微观结构，使其参与肺表面活性剂循环，增强了药物向肺组织的高效转运。
26.（4）可实现治疗、修复一体化，为治疗肺纤维化提供了一种新的技术支持（药物），开拓了治疗肺纤维化药物的新途径，可提高5年以上的生存期1
‑
2倍，是治疗肺纤维化药物上的一大创新，经济和社会效益显著。