桑色素及其衍生物在制备抗免疫毒性的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及桑色素及其衍生物在制备抗免疫毒性的药物中的应用。


背景技术：

2.伴随着工业化的快速发展，纳米材料因其自身较小粒径和较大比表面积等特性，越来越受到人们的关注和青睐。纳米金属氧化物作为纳米颗粒的一种，具有耐腐蚀性、耐高温和高反应活性等特点，被广泛地应用到工业生产，食品包装，化妆品和建筑业中。然而，频繁使用纳米金属氧化物导致了纳米颗粒在环境内存留。报道证明，纳米金属氧化物颗粒可以通过血脑屏障，血气屏障和胎盘屏障，而且与之相同的较大颗粒相比，具有更高的毒性潜力。据报道，过量纳米金属氧化铝或氧化铜可以影响免疫系统，造成免疫细胞功能障碍，而且能穿过血脑屏障进入大脑，损害动物的中枢神经系统，并损害学习和记忆能力从而产生免疫毒性。
3.中性粒细胞是哺乳动物血液中比例最高的白细胞，可以通过趋化、吞噬等作用进行杀灭病原微生物，保护机体进行免疫防御。2004年，brinkmann等人发现了中性粒细胞的一种新防御机制，即中性粒细胞能够释放中性粒细胞胞外诱捕网(nets)来捕获并杀灭病原微生物，其主要是由dna整体骨架结合多种活性蛋白酶如组蛋白酶、弹性蛋白酶以及髓过氧化物酶等构成。nets具有极高的杀灭微生物活性，然而nets释放过量或不及时清除也会造成机体多种免疫性疾病的发生与发展，例如动脉粥样硬化、血栓、痛风、关节炎等。禽类的异嗜粒细胞功能类似于哺乳动物的中性粒细胞，异嗜粒细胞能够释放类似nets的网状结构，被称为异嗜粒细胞胞外诱捕网(hets)，其在结构成分上与nets略有区别，如异嗜粒细胞胞外诱捕网中不含髓过氧化物酶和碱性磷酸酶等。研究发现，纳米氧化铝和纳米氧化铜均具有免疫毒性作用，会诱导异嗜粒细胞释放hets，且hets的过度释放直接导致禽类的肝和肾等实质组织损伤。因此，抑制纳米金属氧化物致hets过度释放对于防治和保障禽类的整体健康具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明提出桑色素及其衍生物在制备抗免疫毒性的药物中的应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
5.为克服上述技术问题，本发明的第一方面提供了桑色素及其衍生物在制备抗免疫毒性的药物中的应用。
6.具体的，桑色素是一种存在于自然界的黄酮化合物，可从多种桑树植物和多种草本植物中提取。本发明在纳米氧化铝作用下建立了鸡异嗜粒细胞和雏鸡染铝模型，观察并检测桑色素对纳米氧化铝诱导的异嗜粒细胞免疫毒性以及鸡体内hets形成、氧化应激和肝、肾组织病理损伤的作用。研究发现，桑色素能够抑制hets形成和活性氧(ros)的释放；桑色素还可抑制纳米氧化铝刺激后鸡血清中hets的形成，逆转血清和肝组织匀浆内的氧化和
抗氧化酶(包括mda、sod、cat和gsh
‑
px)的水平；桑色素同时还可降低纳米氧化铝诱导的ast、alt和cre、bun的释放，并进一步改善了肝脏和肾脏的病理损伤情况。
7.作为上述方案的进一步改进，所述桑色素的衍生物为其互变异构体或桑色素药学上可接受的盐。
8.优选的，所述桑色素药学上可接受的盐为其碱加成盐，选自钠、钾、钙、镁、铁、亚铁、铵或锌盐；或酸加成盐，选自硫酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或苯甲酸盐。具体的，所述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。
9.作为上述方案的进一步改进，所述免疫毒性为禽类免疫毒性。具体的，所述免疫毒性是指机体对自身组织成分或细胞抗原失去免疫耐受性，导致自身免疫效应细胞和自身抗体，对自身组织进行病理性免疫应答，引起组织结构的损伤。
10.作为上述方案的进一步改进，所述禽类包括鸡或鸭。
11.作为上述方案的进一步改进，所述免疫毒性为纳米金属氧化物所致。具体的，纳米金属氧化物所致的禽类免疫毒性主要表现为诱导异嗜粒细胞释放hets，而hets的过度释放直接导致禽类的肝和肾等实质组织损伤。
12.优选的，所述纳米金属氧化物包括纳米氧化铝或纳米氧化铜。研究发现，纳米氧化铝或纳米氧化铜均会导致免疫毒性作用。
13.本发明的第二方面提供了一种抗免疫毒性的药物。
14.具体的，一种抗免疫毒性的药物，所述药物包含桑色素和/或其衍生物。
15.作为上述方案的进一步改进，所述桑色素的衍生物为其互变异构体或桑色素药学上可接受的盐。
16.优选的，所述桑色素药学上可接受的盐为其碱加成盐，选自钠、钾、钙、镁、铁、亚铁、铵或锌盐；或酸加成盐，选自硫酸盐、醋酸盐、盐酸盐、磷酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或苯甲酸盐。具体的，所述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。
17.优选的，所述抗免疫毒性的药物还包括辅料，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。所述载体和赋形剂主要用于使片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的载体和赋形剂，如乳糖、淀粉、椰子油、淀粉、碳酸钙、高岭土等；所述载体和稀释剂主要用于注射剂形式的药物组合物，可使用本领域内任何常用的载体和稀释剂，如水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇等。
18.作为上述方案的进一步改进，所述药物的剂型选自口服剂或注射剂；优选的，所述口服剂选自片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊中的任意一种。
19.作为上述方案的进一步改进，所述药物中桑色素及其衍生物的给药浓度为20
‑
80μg/ml或10
‑
40mg/kg。具体的，分为体外、体内两种给药浓度，其中：通过体外细胞中的给药浓度为：20
‑
80μg/ml，而通过体内注射的给药浓度：10
‑
40mg/kg。
20.本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
21.本发明通过检测桑色素及其衍生物对纳米金属氧化物刺激的禽类的异嗜粒细胞毒性作用、hets形成和ros释放的影响，体内实验观察桑色素及其衍生物对禽类血清中hets形成、氧化应激以及肝、肾功能的作用效果来研究纳米金属氧化物对禽类免疫毒性的治疗
作用。经验证：桑色素及其衍生物对纳米金属氧化物引发的禽类免疫毒性具有良好的治疗效果，在鸡染铝模型中，桑色素显著地抑制了鸡血清中hets形成，逆转了氧化应激反应，并减轻了鸡的肝、肾损伤。因此，本发明证实了桑色素及其衍生物对纳米金属氧化物诱导的禽类异嗜粒细胞免疫毒性具有治疗效果，为开发桑色素及其衍生物的免疫治疗功能，以及发挥其经济价值提供重要理论指导和实验依据。
附图说明
22.图1为桑色素对纳米氧化铝刺激的异嗜粒细胞毒性作用；
23.图2为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡hets形成的形态学观察；
24.图3为图2中hets的放大图；
25.图4为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡hets形成及ros释放的定量分析；
26.图5为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中hets形成的定量分析；
27.图6为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡肝脏的mda和gsh
‑
px、血清中的sod和cat的影响；
28.图7为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中ast和alt及肝组织的影响；
29.图8为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中cre和bun及肾组织的影响。
具体实施方式
30.以下通过实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解，有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围，同时，下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品，未详细提及的工艺步骤或制备方法均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
31.实施例1
32.本实施例通过体外实验，检测桑色素对纳米氧化铝刺激的鸡异嗜粒细胞毒性作用、hets形成和ros释放的影响。
33.本实施例所采用的药品和试剂分别为：桑色素：索莱宝，货号：sm8320；鸡异嗜粒细胞分离试剂盒：索莱宝，货号：p4100；纳米氧化铝：西格玛奥德里奇贸易有限公司，货号：544833；无酚红1640培养基：索莱宝，货号：90022；ldh试剂盒：碧云天，货号：c0017；抗瓜氨酸化组蛋白h3一抗：abcam，货号：ab5103；抗弹性蛋白酶一抗：abcam，货号：ab68672；fitc标记羊抗兔二抗：ptg，货号：sa00003
‑
2；sytox orange：thermo；货号：c10493；pico green dsdna：thermo，货号：p11495。
34.1.异嗜粒细胞染铝模型建立
35.成年鸡翅下静脉处采集血液，差速离心分离鸡异嗜粒细胞，并用无酚红1640培养基进行稀释重悬。将细胞以104个/孔的密度接种到96孔细胞培养板，并分组为：正常组；模型组；桑色素低剂量组(20μg/ml)；桑色素中剂量组(40μg/ml)；桑色素高剂量组(80μg/ml)；阳性组，每组5个复孔。
36.2.桑色素对鸡异嗜粒细胞毒性检测
37.异嗜粒细胞104个/孔接种到96孔培养板中，在37℃培养箱内贴壁30min。然后加入纳米氧化铝(7.5μg/ml)和/或桑色素(20、40、80μg/ml)继续孵育2h。刺激完成后，400g离心5min。吸出上清并加入150μl ldh释放试剂，适当摇晃混匀，继续孵育1h。分别取各孔上清液120μl,加入到一新的96孔板中，进行样品细胞毒性检测。
38.如图1所示，其中：图中n表示无统计学显著性；al2o
3 nps为纳米氧化铝；morin为桑色素。ldh乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞毒性结果显示：与正常组(control)相比，纳米氧化铝(7.5μg/ml)和桑色素(20、40、80μg/ml)组对异嗜粒细胞产生的毒性作用不具有显著性，即说明桑色素对纳米氧化铝刺激的鸡异嗜粒细胞无毒性作用。
39.3.桑色素对纳米氧化铝诱导鸡hets形成的形态学鉴定
40.鸡异嗜粒细胞接种到醋酸处理后的圆玻片上，贴壁30min后，加入200μl不同处理试剂，分别是正常组更换无酚红1640培养基；模型组加入无酚红1640重悬的纳米氧化铝溶液(7.5μg/ml)；桑色素治疗组加入纳米氧化铝溶液和低、中、高三种剂量桑色素(20、40、80μg/ml)混合溶液；阳性组加入酵母聚糖溶液(1mg/ml)，继续刺激2h。用4％多聚甲醛固定20min，透化15min。加入3％山羊血清封闭3h。随后，将细胞与抗瓜氨酸化组蛋白h3(1：300，ab5103，abcam)和抗弹性蛋白酶抗体(1：300，ab68672，abcam)在4℃下孵育过夜，然后加入相应的羊抗兔二抗孵育。最后，用sytox orange(5μm)染色，并通过荧光显微镜观察样品的结果。
41.如图2所示，图中：箭头指示为形成的hets；green表示组蛋白酶和弹性蛋白酶；dna为染色质骨架；merge为染色质和组蛋白以及弹性蛋白酶叠加。荧光显微镜下进行hets形态学观察发现，纳米氧化铝(al2o
3 nps)显著诱导了hets形成，而桑色素(morin)显著抑制了纳米氧化铝诱导出的由dna为骨架，瓜氨酸化组蛋白h3以及弹性蛋白酶装饰的hets的形成，酵母聚糖(zymosan)作为阳性组显著诱导了hets形成。
42.图3为图2中形成的hets的放大图，其中图3a为纳米氧化铝(al2o
3 nps)诱导组中hets中染色质和组蛋白(cith3)以及弹性蛋白酶(ne)叠加放大图；图3b为酵母聚糖(zymosan)阳性诱导组中染色质和组蛋白(cith3)以及弹性蛋白酶(ne)叠加放大图，从图3hets的放大图可更明显看出hets的形成。
43.4.桑色素对纳米氧化铝诱导鸡hets形成的定量分析
44.异嗜粒细胞接种到96孔板内，加入不同处理组溶液200μl孵育2h，抽取上清100μl并与pico green dsdna核酸染料等比例混合，使用荧光酶标仪在485nm激发光和535nm接收光下定量分析hets形成。
45.如图4a(桑色素对纳米氧化铝诱导鸡hets形成的定量分析)所示，与正常组(control)组比较，纳米氧化铝(al2o
3 nps 7.5μg/ml)组显著诱导hets含量上升(***p<0.001)，而桑色素(morin，20、40、80μg/ml)组抑制了纳米氧化铝的这种作用(***p<0.001)，阳性对照酵母聚糖(zymosan)显著诱导hets形成(***p<0.001)。由此可见，桑色素能够抑制纳米氧化铝诱导的hets形成，从而抑制纳米氧化铝对异嗜粒细胞免疫毒性作用。
46.5.桑色素对纳米氧化铝诱导鸡异嗜粒细胞ros释放定量分析。
47.报道表明hets形成依赖于nadph氧化酶活化后形成的ros。我们检测纳米氧化铝诱导的异嗜粒细胞ros水平，以及桑色素对其影响。具体地，将异嗜粒细胞接种到96孔板，贴壁30min，然后加入不同组处理溶液，孵育90min,然后加入dcfh探针继续培养30min。使用荧光
酶标仪在485nm激发光和535nm接收光下定量分析异嗜粒细胞ros释放水平。
48.如图4b(桑色素对纳米氧化铝诱导鸡异嗜粒细胞ros释放定量分析)所示，与正常组(control)相比，纳米氧化铝(al2o
3 nps 7.5μg/ml)促使异嗜粒细胞ros释放增加(***p<0.001)，而与纳米氧化铝组比，桑色素(morin，20、40、80μg/ml)抑制了ros的升高(***p<0.001)，由此可见，桑色素可以抑制纳米氧化铝诱导的异嗜粒细胞ros的释放。
49.本实施例的实验结果表明，纳米氧化铝诱导了hets形成，而桑色素抑制了其作用，证明桑色素对纳米氧化铝引发的异嗜粒细胞免疫毒性具有治疗作用。
50.实施例2
51.本实施例通过体内实验，检测桑色素对纳米氧化铝刺激的鸡血清中hets形成、氧化应激以及肝、肾功能的作用效果。
52.本实施例所采用的药品和试剂分别为：桑色素：索莱宝，货号：sm8320；纳米氧化铝：西格玛奥德里奇贸易有限公司，货号：544833；pico green dsdna：thermo，货号：p11495；ast试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：c010
‑2‑
1；alt试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：c009
‑2‑
1；cre试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：c010
‑2‑
1；bun试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：c010
‑2‑
1；mda试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：a003
‑1‑
2；sod试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：a001
‑1‑
2；cat试剂盒：南京建成生物工程研究所，货号：a007
‑1‑
1。
53.本实施例的实验动物为健康的一日龄雏鸡，全部为雄性，选自广东省佛山市南海种鸡场。雏鸡被安置于适宜环境中(温度保持30℃
±
1℃,湿度控制于45
‑
80％)适应环境3天，该过程中给予充足的水源以及日粮颗粒。
54.1.雏鸡染铝模型建立
55.25只雏鸡随机分为5组，分别为：正常组(control)；模型组(al2o
3 nps)；桑色素(morin)低剂量组(10mg/kg)；桑色素(morin)中剂量组(20mg/kg)；桑色素(morin)高剂量组(40mg/kg)，每组5只。第一天时，除正常组和模型组腹腔注射无菌生理盐水外，其余各组腹腔注射等体积对应剂量桑色素。第二天时，正常组灌胃生理盐水，其他组均给雏鸡灌胃纳米氧化铝(200mg/kg)。1h后，正常组和模型组腹腔注射生理盐水，其余组再次注射对应剂量桑色素。24h后，使用1ml注射器心脏采集雏鸡血液，并采集肝脏以及肾脏组织。hets检测血清中hets含量、ast、alt、cre、bun、sod、cat以及肝匀浆中mda和gsh
‑
px水平。
56.2.血清中hets含量测定
57.雏鸡心脏采血，静置30min，以12000rpm/min离心10分钟，收集血清。将血清稀释5倍后与pico green dsdna核酸染料等比例混合加入到96孔细胞培养板中，使用荧光酶标仪在485nm激发光和535nm接收光下定量分析血清中hets含量。
58.如图5所示，与正常(control)组比较，纳米氧化铝(al2o
3 nps 200mg/kg)组使血清中hets含量显著升高(*p<0.05)，而桑色素(morin，10、20、40mg/kg)组治疗后均降低了纳米氧化铝诱导的血清hets含量(***p<0.001)，由此可见，桑色素能够抑制纳米氧化铝诱导的鸡血清中hets形成。
59.3.氧化应激指标的检测
60.取0.1g肝组织，加入0.9ml的生理盐水使用研磨仪将肝组织制成10％组织匀浆。按照试剂盒说明书操作，检测血清中sod、cat以及肝组织mda、gsh
‑
px的含量。
61.如图6所示，其中：图6a为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡肝脏mda的影响；图6b为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中sod的影响；图6c为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中cat的影响；图6d为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡肝脏gsh
‑
px的影响。由图6可知：与正常(control)组比，纳米氧化铝(al2o
3 nps 200mg/kg)组显著的诱导了肝脏匀浆中mda(*p<0.05)、gsh
‑
px(*p<0.05)以及血清中sod(***p<0.001)、cat(***p<0.001)的表达，而使用不同剂量桑色素(morin，10、20、40mg/kg)治疗后，显著的逆转了这些纳米氧化铝诱导的氧化应激指标的表达(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，由此可见，桑色素能够减轻纳米氧化铝引发的鸡氧化应激反应。
62.4.肝功能指标检测
63.检测血清中肝功能指标ast和alt水平。
64.如图7所示，其中：图7a为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中ast的影响；图7b为桑色素对纳米氧化铝诱导鸡血清中alt的影响。由图7可知：与正常(control)组比，纳米氧化铝(al2o
3 nps 200mg/kg)引起血清中肝功能指标ast(***p<0.001)和alt(**p<0.01)释放增加，而桑色素(morin，10、20、40mg/kg)治疗后，纳米氧化铝诱导的ast(***p<0.001)和alt(*p<0.05，***p<0.001)含量显著降低了，初步证明桑色素能够缓解纳米氧化导致的肝损伤。
65.5.肾功能指标检测
66.检测血清中肾功能指标cre和bun水平。
67.如图8a和8b所示，与正常(control)组比，纳米氧化铝(al2o3 nps 200mg/kg)引起血清中肾功能指标cre(***p<0.001)和bun(*p<0.05)释放增加，而桑色素(morin,10、20、40mg/kg)治疗后，纳米氧化铝诱导的cre(**p<0.01，*p<0.05，**p<0.01)和bun(**p<0.01，***p<0.001，***p<0.001)含量显著降低了，初步证明桑色素能够缓解纳米氧化导致的肾损伤。
68.6.肝、肾组织病理学检测
69.取雏鸡相同部位肝、肾组织，用10％甲醛固定，制作肝脏和肾脏的组织切片，通过he染色，在光学显微镜下观察组织病理变化。
70.如图7c(桑色素对纳米氧化铝诱导鸡肝组织的影响)所示，对肝组织进行病理学检测，其中：图7c
‑
a为正常组肝组织；图7c
‑
b为纳米氧化铝组肝组织；图7c
‑
c为10mg/kg桑色素治疗组肝组织；图7c
‑
d为20mg/kg桑色素治疗组肝组织；图7c
‑
e为40mg/kg桑色素治疗组肝组织。由图7c可知：纳米氧化铝显著引起了肝细胞破坏，炎性细胞浸润等(箭头所指)，而桑色素改善了肝组织的这些病理变化，进一步证实了桑色素能够治疗纳米氧化铝诱导的肝损伤。
71.如图8c(桑色素对纳米氧化铝诱导鸡肾组织的影响)所示，对肾组织进行病理学检测，其中：图8c
‑
a为正常组肾组织；图8c
‑
b为纳米氧化铝组肾组织；图8c
‑
c为10mg/kg桑色素治疗组肾组织；图8c
‑
d为20mg/kg桑色素治疗组肾组织；图8c
‑
e为40mg/kg桑色素治疗组肾组织。由图8c可知：纳米氧化铝显著引起了肾组织破坏，炎性细胞浸润(箭头所指)，而桑色素改善了肾脏的这些病理变化，进一步证实了桑色素同样能够治疗纳米氧化铝诱导的肾损伤。
72.本实施例的实验结果表明，通过雏鸡染铝模型的建立，纳米氧化铝诱导了鸡血清中hets形成，氧化应激反应，以及鸡的肝、肾损伤，而桑色素抑制了纳米氧化铝的这些不良
后果，达到治疗鸡免疫毒性作用。
73.显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。