分析方法及试剂盒与流程

分析方法及试剂盒
【技术领域】
1.本发明的实施方式涉及分析方法及试剂盒。


背景技术：

2.近年，关注microrna(mirna)和疾病的关系。报告了mirna具有调节基因表达的功能，在各种疾病中其种类或表达量从初期的阶段改变。即，在具有某疾病的患者中，特定的mirna量与健康者比较而增加或减少。因此，研究从受试者采集的试样中的该mirna的量成为知晓患者罹患该疾病与否的手段。
3.【发明的概要】
4.【发明要解决的课题】
5.本发明要解决的课题是提供可简便地判定对象中有无罹患癌的分析方法、试剂盒、引物组及检测装置。
6.【用于解决课题的手段】
7.根据实施方式，提供判定对象中有无罹患癌的分析方法，其包括对于对象来源的试样中的hsa
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mir
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3p进行定量。
8.【附图的简单的说明】
9.【图1】图1是显示第1实施方式的分析方法的一例的流程图。
10.【图2】图2是显示第2实施方式的分析方法的一例的流程图。
11.【图3】图3是显示第3实施方式的定量工序的一例的流程图。
12.【图4】图4是显示第3实施方式的定量工序的一例的模式图。
13.【图5】图5是显示实施例1的实验结果的箱形图。
14.【图6】图6是显示实施例1的实验结果的箱形图。
15.【图7】图7是显示使用实施例2的引物组a时的实验结果的箱形图。
16.【图8】图8是显示实施例2的实验结果的箱形图。
17.【图9】图9是显示实施例2的实验结果的箱形图。
18.【图10】图10是显示使用实施例2的引物组j时的实验结果的箱形图。
19.【图11】图11是显示实施例2的实验结果的箱形图。
20.【图12】图12是显示实施例2的实验结果的箱形图。
【具体实施方式】
21.接下来，参照附图对于实施方式的分析方法及试剂盒进行说明。
22.·
第1实施方式
23.(分析方法)
24.根据第1实施方式的分析方法是判定对象中有无罹患癌的方法，如图1的(a)所示，包括对于对象来源的试样中的hsa
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mir
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3p进行定量(定量工序(s1))。
25.癌是指恶性肿瘤、恶性新生物、癌及肉瘤。癌无限定，含例如，前列腺癌、乳腺癌、大
肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、食道癌、肝脏癌、脑肿瘤、膀胱癌、肉瘤、子宫体癌、子宫肉瘤、间皮肿、咽头癌、上颚癌、口腔癌、舌癌、口唇癌、喉头癌、甲状腺癌、神经肿瘤、神经谬肿、神经母细胞瘤、肾细胞癌、精巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肿瘤、白血病、恶性淋巴及多发性骨髓瘤等。
26.癌还含任何病期，例如，含癌停留在原发处的器官内的状态、癌进一步到达周边的组织的状态、癌进一步转移到淋巴节的状态、及有癌转移到进一步远离的器官的状态等。
27.对象是在本方法中供于分析的动物、即，提供试样的动物。对象可为具有某些疾病的动物，也可为健康的动物。例如，对象也可为有罹患癌的可能性的动物、或者过去罹患癌的有的动物等。
28.对象优选为人。或者，对象也可为其他动物。其他动物，例如是哺乳动物，含例如，猴等的灵长类、小鼠、大鼠或豚鼠等的啮齿类、狗、猫或兔等的伴侣动物、马、牛或猪等的家畜动物、或者属于展示动物等的动物。
29.对象来源的试样含从对象采集的试样或对于其进行适合地处理的试样等。试样优选为血清。试样也可为此外的体液、例如，血液、血浆、白细胞、间质液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽头粘膜、咳痰、消化液、胃液、淋巴液、髓液、泪液、母乳、羊水、精液或阴道液等。或者，试样可为组织或细胞等，也可为从对象采集、培养的组织或细胞、或者其上清。
30.以下，对于第1实施方式的分析方法的程序的一例进行说明。
31.首先，准备对象来源的试样。试样可使用根据其种类的一般的方法采集。试样可采集后直接使用，也可以不抑制用于核酸的定量的反应的状态或由反应成为适宜的状态的方式处理。处理，例如是细切、均化、离心、沉淀、提取和/或分离等，可由公知的任何手段进行。
32.例如，提取也可使用市售的核酸提取试剂盒进行。作为核酸提取试剂盒，可使用例如，nucleospin(注册商标)mirna plasma(宝生物制)、quick
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cfrna serum&plasma kit(zymo research制)、mirneasy serum/plasma试剂盒(qiagen制)、mirvana paris isolation kit(thermofisher制)、purelinktm total rna blood kit(thermofisher制)、plasma/serum rna purification kit(norgen biotech制)、microrna extractor(注册商标)sp kit(和光纯药)、high pure mirna isolation kit(sigma
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aldrich制)等。或者，也可不使用市售的试剂盒，而例如，通过将试样用缓冲液稀释，进行80～100℃的加热处理，离心分离，采集其上清而进行提取。
33.接下来，进行试样中的hsa
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mir
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3p的定量(定量工序(s1))。hsa
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mir
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3p是具有下述的序列的mirna：
34.uugcagcugc cugggaguga cuuc(seq id no:1)
35.以下，将hsa
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mir
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3p也称为“目标mirna”。
36.定量工序(s1)可使用用于对于rna、特别mirna等的短链的rna进行定量的一般的方法进行。其方法无限定，优选例如，逆转录目标mirna，对于cdna进行扩增，对于扩增产物进行检测及定量。在扩增中，可使用例如，pcr法、qpcr法、lamp法等。检测及定量可扩增之后进行，也可扩增中经时进行。检测及定量可使用例如，使用基于浊度或吸光度的信号的测定法、使用光学信号的测定法或使用电化学信号的测定法、或这些的组合等。例如，可从对应于扩增产物量得到的上述信号的强度或变化量、或者信号达阈值为止的时间(开始时间)或
使用pcr法时是循环数(开始循环数)等的检测结果进行目标mirna的定量。
37.目标mirna的定量值可使用表示上述信号的检测结果和目标mirna的存在量的关系的校准曲线来确定。校准曲线可通过对于以不同的已知的浓度含目标mirna的多个标准试样而进行信号的检测来制成。通过对此校准曲线和对于对象来源的试样得到的信号的检测结果进行比较，可算出试样中的目标mirna的存在量。例如，试样中的目标mirna的存在量可作为试样的每单位量的目标mirna的拷贝数得到。
38.定量工序(s1)也可例如，使用市售的试剂盒进行。市售的试剂盒的例是taqman(注册商标)advanced mirna assays(thermofisher制、id：477827_mir)、mircury lna mirna pcr assays(qiagen制、产品目录no.yp02103132)、sybr(注册商标)green qpcr microrna检测系统(原点technologies制)等，可与特异性地扩增目标mirna的引物一同使用。
39.对于更优选的定量工序(s1)的例，在第3实施方式中进行说明。
40.在定量工序(s1)中得到的目标mirna的定量值可用于判定对象中有无罹患癌。
41.例如，第1实施方式的分析方法，如图1的(b)所示，可还含定量工序(s1)之后可进行的判定工序(s2)。在判定工序(s2)中，在目标mirna的定量值高时，判定为对象罹患癌。相反，在定量值低时，可判定为对象未罹患癌。定量值的高低，例如，以预先得到的对照中的目标mirna的定量值或阈值等作为基准而判定。例如，在定量值比它们高时，可判定为对象罹患癌。
42.对照是指例如，健康体。健康体是指至少未罹患癌的个体。健康体优选为不具有疾病或异常的健康的个体。作为对照选择的个体也可为与本方法中分析的对象不同的个体，属于相同的种的个体、即当对象是人时，优选为人。另外，对照的年龄、性别及身高体重等的身体的条件或人数无特别限定，身体的条件优选为与本分析方法中受检查的对象相同或类似的。
43.在对照中的目标mirna的定量值，例如是使用对照来源的相同的或类似的试样，使用与在定量工序(s1)中使用的相同的方法而得到的目标mirna的定量值。
44.阈值是可例如，区分罹患癌的对象中的定量值和未罹患癌的对照中的定量值的目标mirna的定量值。阈值可使用例如，含已知罹患癌与否的标准对象来源的相同的或类似的试样或癌的株化细胞的试样等，从由与定量工序(s1)中使用的同样的方法得到的目标mirna的定量值确定。阈值无限定，可根据使用的定量方法、试样的种类及测定条件等而确定。
45.或者，阈值也可每对象确定。例如，在监测在健康诊断等中定期地测定的对象的健康之时的目标mirna定量值时，通过以其作为阈值使用，在定量值比其高时可发出有罹患癌的可能性的警报。阈值可每个人不同。例如，通常，在目标mirna的定量值以约103拷贝推移的对象a中，可在某时成为104拷贝时设为有癌的可能性。另一方面，在以约102拷贝推移的对象b中，可在某时成为103拷贝时设为有癌的可能性。
46.在对照中的定量值或阈值也可从文献等的过去的见解确定。
47.其中，罹患还包括罹患的可能性高。相反，未罹患还包括罹患的可能性低。
48.根据进一步的的实施方式，判定为罹患癌还含判定对象中的癌的预后或再发。例如，分析方法，如图1的(c)所示，在定量工序(s1)之后含从定量的结果判定对象中的癌的预后或再发的有无的判定工序(s3)。在判定工序(s3)中，例如，在定量值高时，能判定为对象
中的癌的预后不良，或者癌再发，或者其可能性高。在预后、再发的判定中也可使用上述对照中的定量值、阈值。特别是，可也有优选使用每对象确定的阈值的情况。
49.另外，判定工序(s2)和/或判定工序(s3)之后，还能根据判定结果而选择用于适用于对象的治疗法的种类或药剂的种类。例如，分析方法，如图1的(d)所示，判定工序(s2)和/或判定工序(s3)之后，含从判定结果选择用于适用于对象的治疗法的种类或药剂的种类的选择工序(s4)。其中，治疗法或药剂用于癌的治疗。治疗法的种类或药剂的种类含治疗法或药剂的使用量、时机或期间。
50.根据以上说明的第1实施方式的分析方法，通过对于1种目标mirna(hsa
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3p)进行定量，能简便地判定对象中有无罹患癌。换言之，根据本方法，可简单地区别罹患癌的对象和未罹患癌的对象。
51.特别是，实施方式的分析方法，由于能使用可在健康诊断等中容易地采集的血清，从而可早期发现癌。通过使用血清等，由于可与细胞学诊断等比较而大大减轻对象的肉体的及经济的负担的同时，程序容易，对于检查者的负担也少。另外，血清由于其中所含的mirna浓度稳定，能进行更正确的检查。
52.根据进一步的的实施方式，还提供用于辅助判定对象中有无罹患癌的分析方法，包括对于对象来源的试样中的目标mirna进行定量(定量工序(s1))。
[0053]“辅助判定”含例如，取得对象罹患癌的可能性相关信息。“信息”可为例如，在定量工序(s1)中得到的定量值。根据本方法，可取得用于进行对象中有无罹患癌判定、预后判定、再发的有无判定、或者适用于对象的治疗法或药剂的选择等的精度更高的信息。
[0054]
根据进一步的的实施方式，本分析方法还可在不是对象来源的试样中的癌细胞的检测等中使用。例如，在人工制造癌细胞时，还可在确认制造的含有细胞的溶液中存在癌细胞与否时等中使用。
[0055]
(标志物)
[0056]
根据第1实施方式，提供癌检测用标志物，其含hsa
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mir
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3p。
[0057]
其中，“标志物”是指可通过检测试样中的其有无或浓度来判定试样和/或成为其来源的对象是特定的状态与否的物质。
[0058]
第1实施方式的癌检测用标志物通过例如，对于对象来源的试样中的其存在量(定量值)进行测定，可进行如上所述对象中有无罹患癌判定、预后判定、再发的有无判定、或者适用于对象的治疗法或药剂的选择等。
[0059]
(试剂盒)
[0060]
根据第1实施方式，提供癌检测用试剂盒。
[0061]
所述试剂盒含选自用于逆转录hsa
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3p的逆转录用(rt)引物、用于延伸hsa
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3p的延伸用(el)引物、用于扩增hsa
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3p的扩增用引物组及用于检测hsa
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3p的核酸探针的至少1种核酸。
[0062]
rt引物是用于得到目标mirna的cdna的引物。rt引物含与目标mirna的至少1份的序列互补的序列。rt引物也可还含附加到使扩增目标mirna的cdna变得容易的cdna的人工序列。
[0063]
el引物是为了使对于目标mirna的cdna进行扩增变得容易而用于在cdna附加人工序列的引物。el引物可含与目标mirna的cdna的至少1部分的序列互补的序列和为cdna的延
伸用附加的序列。
[0064]
扩增用引物组是例如pcr法用，含至少正向引物和反向引物。或者扩增用引物组是lamp法用，含至少fip引物及bip引物。根据需要，也可含f3引物、b3引物和/或环引物。
[0065]
扩增用引物组中所含的各引物可以与目标mirna的cdna或其互补序列结合的方式设计，也可以与由rt引物和/或el引物附加的人工序列结合的方式设计。对于rt引物、el引物及扩增用引物组的优选的序列，在第3实施方式中进行说明。
[0066]
核酸探针可具有目标mirna、其cdna、或者其扩增产物的至少1部分的序列或其互补序列。
[0067]
试剂盒中所含的上述核酸也可个别地或任何几个组合而与适合的载体一同收容在容器中而提供。适合的载体是例如，水、生理性溶液或缓冲液等。容器是例如，管或微量滴定板等。或者，这些核酸也可固定于微流体芯片等的固相而提供。
[0068]
试剂盒也可除了上述核酸之外，含在逆转录、延伸和/或扩增中使用的试剂、例如酶、底物和/或在检测中使用的发生光学信号或电化学信号的标记物质等。标记物质是例如，sybr green或eva green、syto 82等的荧光染料、电流检测时是钌六胺等的金属络合物等的指示剂。
[0069]
试剂盒可在例如，如上所述对象中有无罹患癌判定、预后判定、再发的有无判定、治疗法的种类或药剂的种类的选择等中使用。
[0070]
根据进一步的的实施方式，癌检测用试剂盒作为癌的诊断用组合物或诊断药提供。另外，根据实施方式，还提供上述核酸的至少1种用于制造癌的诊断用组合物或癌的诊断药的用途。
[0071]
·
第2实施方式
[0072]
(分析方法)
[0073]
第2实施方式的分析方法是如图2的(a)所示，含对于对象来源的试样中的hsa
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3p进行定量(定量工序(s11))的，判定对象中的选自乳腺癌、大肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、食道癌、肝脏癌、脑肿瘤、膀胱癌、前列腺癌、肉瘤及子宫体癌的至少1种的罹患的有无的方法。
[0074]
将乳腺癌、大肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、食道癌、肝脏癌、脑肿瘤、膀胱癌、前列腺癌、肉瘤及子宫体癌以下综合也称为“目标癌”。
[0075]
定量工序(s11)可与第1实施方式的定量工序(s1)同样地进行，扩增可使用lamp法进行。对象及试样可设为与第1实施方式同样，对象也可为有罹患目标癌的至少1种的可能性的动物、或者过去罹患目标癌的至少1种的动物等。
[0076]
在定量工序(s11)中得到的目标mirna的定量结果可用于检测对象中的目标癌的至少1种。
[0077]
例如，根据第2实施方式的分析方法，如图2的(b)所示，可还含定量工序(s11)之后可进行的判定工序(s12)。在判定工序(s12)中，在目标mirna的定量值高时，可判定为对象罹患目标癌的至少1种。定量值的高低，例如，以预先得到的对照中的目标mirna的定量值或阈值等作为基准而判定。
[0078]
在第2实施方式中对照是指例如，未罹患任何目标癌的个体。对照虽然也可为健康体或罹患其他疾病的个体，但优选为罹患其他癌的个体。其他癌是分类为目标癌以外的癌。
其他癌例如是子宫肉瘤。
[0079]
阈值是例如，可区分罹患目标癌的对象中的定量值和未罹患目标癌的对照中的定量值的目标mirna的定量值，优选为可区分罹患目标癌的对象中的定量值和罹患子宫肉瘤的对照中的定量值的定量值。阈值，例如，可从自已知罹患癌与否或罹患的癌的种类的标准对象来源的相同的或类似的试样或含目标癌的株化细胞的试样等得到的目标mirna定量值确定。阈值无限定，可根据使用的定量方法、试样的种类及测定条件等而确定。
[0080]
在对照中的定量值或阈值也可从文献等的过去的见解确定。
[0081]
在定量工序(s11)中得到的定量值高时，判定为对象罹患的不是子宫肉瘤，可罹患目标癌的至少1种。换言之，根据本分析方法，能区别罹患目标癌的对象和罹患子宫肉瘤的对象或未罹患癌的对象。
[0082]
通过将判定工序(s12)以子宫肉瘤的对照的定量值和/或用于区分目标癌和子宫肉瘤的阈值作为基准进行，可将目标癌的罹患的有无与子宫肉瘤癌更正确地区别判定。
[0083]
根据以上说明的第2实施方式的分析方法，通过对于1种目标mirna(hsa
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3p)进行定量，能简便地判定对象中的目标癌的至少1种的罹患的有无。
[0084]
第2实施方式的分析方法也可如图2的(c)所示，定量工序(s11)之后，含从定量结果判定对象中的目标癌的预后或再发的有无的判定工序(s13)。另外，也可在判定工序(s12)和/或判定工序(s13)之后，含根据结果选择用于适用于对象的治疗法的种类或药剂的种类的选择工序(s14)。
[0085]
根据进一步的的实施方式还提供用于辅助对象中的目标癌的至少1种的罹患的有无的判定的分析方法，其包括对于对象来源的试样中的目标mirna进行定量(定量工序(s11))。根据本方法，可取得用于进行对象中的目标癌的罹患的有无判定、预后判定、再发的有无判定、或者适用于对象的治疗法或药剂的选择等的精度更高的信息。
[0086]
根据第2实施方式，还提供含hsa
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3p的目标癌检测用标志物。
[0087]
根据第2实施方式，还提供目标癌检测用试剂盒。第2实施方式涉及的试剂盒含与第1实施方式中说明的同样的核酸，引物组可为lamp法用。试剂盒也可还含对于定量工序必要的试剂。第2实施方式涉及的试剂盒也可作为用于检测目标癌的至少1种的诊断用组合物或诊断药提供。另外，根据第2实施方式，还提供上述核酸的至少1种用于制造所述诊断用组合物或诊断药的用途。
[0088]
由lamp法得到的hsa
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mir
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3p的定量值可用于通用检测目标癌。例如，在从对象得到的细胞中，在hsa
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mir
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1301
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3p的定量值是阈值以上时，可判定为对象罹患目标癌的至少1种。再者，通过对于对各目标癌具有特异性的其他标志物进行定量，也能进一步正确地判定对象罹患目标癌之中的哪一种。
[0089]
其他标志物是例如，用于检测目标癌的至少1种的hsa
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mir
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1301
‑
3p以外的标志物。
[0090]
例如，可联用在前列腺癌表达量多的hsa
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mir
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92a
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3p。hsa
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mir
‑
92a
‑
3p是具有以下的序列的mirna：
[0091]
uauugcacuu gucccggccu gu(seq id no:2)
[0092]
在目标mirna和hsa
‑
mir
‑
92a
‑
3p的两方的定量值高时，可判定为对象罹患前列腺癌。
[0093]
另外，可联用在胰腺癌表达量多的hsa
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mir
‑
122a
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5p。hsa
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mir
‑
122a
‑
5p是具有以下的序列的mirna：
[0094]
uggaguguga caaugguguu ug(seq id no:3)
[0095]
在目标mirna和hsa
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mir
‑
122a
‑
5p的两方的定量值高时，可判定为对象罹患胰腺癌。
[0096]
其他标志物的定量值优选用与定量工序(s1)同样的方法取得。
[0097]
其他标志物不限于上述的，还能使用作为用于检测目标癌中的哪一种的标志物知晓的任何标志物。其他标志物可不为mirna，也可为dna、肽或蛋白质等。
[0098]
在此例中的试剂盒也可还含用于检测上述其他标志物的rt引物、el引物、扩增用引物组和/或核酸探针。
[0099]
·
第3实施方式
[0100]
在第3实施方式中，对于对目标mirna进行定量的工序的优选的一例进行说明。在此例中，特异性地逆转录目标mirna，附加人工序列而延伸，将延伸产物由lamp法扩增，检测得到的扩增产物。以下，将目标mirna的序列(seq id no:1)也称为“第1序列”。
[0101]
定量工序(s1)包括例如，图3中所示的以下的工序：
[0102]
(s1
‑
1)使与目标mirna的第1序列杂交的第1引物部及含第1lamp识别序列的逆转录用(rt)引物的第1引物部与第1序列杂交，逆转录第1序列，得到含目标mirna的cdna(第1a的序列)的逆转录产物的逆转录工序、
[0103]
(s1
‑
2)使逆转录产物和目标mirna解离的解离工序、
[0104]
(s1
‑
3)使与第1a的序列杂交的第2引物部及含第2lamp识别序列的延伸用(el)引物的第2引物部与逆转录产物的第1a的序列杂交，使el引物及逆转录产物以互相作为模板延伸而得到含第1a的序列5的互补序列(即，与第1序列相对应的dna序列)的延伸产物的延伸工序、
[0105]
(s1
‑
4)将延伸产物由lamp反应扩增，得到扩增产物的扩增工序、及
[0106]
(s1
‑
5)检测得到的扩增产物的检测工序。
[0107]
以下，对于各工序，使用图4详细地进行说明。
[0108]
在逆转录工序(s1
‑
1)中，使用含例如，rt引物3、逆转录酶、盐及脱氧核苷三磷酸(dntp)等的底物(根据需要，作为反应试剂的增稠剂、ph调制用缓冲材、表面活性剂、使退火特异性增大的离子和/或成为逆转录酶的辅因子的离子)等的逆转录溶液。作为逆转录酶，可使用例如，m
‑
mulv逆转录酶、amv逆转录酶、transcriptor逆转录酶、superscript(注册商标)transcriptor逆转录酶、或者multiscribe逆转录酶等。
[0109]
rt引物3含第1引物部4a及第1lamp识别序列4b。第1引物部4a是作为用于与第1序列2杂交，逆转录第1序列2而生成cdna(第1a的序列5)的引物活动的核酸序列。第1引物部4a，例如，具有含第1序列2的3'末端的连续的至少5个碱基序列的互补序列。
[0110]
第1lamp识别序列4b是含扩增工序(s1
‑
4)中结合有扩增用引物的序列(识别序列)的核酸碱基序列。识别序列一般也可在lamp扩增用的引物中使用。例如，第1lamp识别序列4b也可以第1引物部4a侧至5'末端的顺序含b1序列、b2序列、b3序列和/或lb序列。
[0111]
在逆转录溶液中的rt引物3的浓度优选为5～50nm。通过是此浓度范围，可进一步提升反应的特异性及效率。
[0112]
在逆转录工序(s1
‑
1)中，优选将逆转录溶液和试样混合，维持在例如约10℃～55℃。由此，第1引物部4a与第1序列2杂交，逆转录第1序列2，得到了含目标mirna1的cdna(第1a的序列5)的逆转录产物6。
[0113]
解离工序(s1
‑
2)可例如，通过将逆转录后的反应液加热到80℃～100℃来进行。通过维持在此条件而逆转录产物6和目标mirna1解离。
[0114]
在延伸工序(s1
‑
3)中，含逆转录产物6的延伸溶液使用例如，el引物7、dna聚合酶、盐及dntp等的底物(根据需要增稠剂、ph调制用缓冲材、表面活性剂及离子)等。
[0115]
el引物7含第2引物部8a、及第2lamp识别序列8b。第2引物部8a是作为用于与第1a的序列5杂交而生成其互补序列9的引物活动的核酸序列。第2引物部8a，例如，具有含第1a的序列5的3'末端的连续的至少5个碱基序列的互补序列。
[0116]
第2lamp识别序列8b是含扩增工序(s1
‑
4)中结合有扩增用引物的序列(识别序列)的核酸碱基序列。例如，第2lamp识别序列8b也可以第2引物部8a侧至5'末端的顺序含f1序列、f2序列、f3序列和/或lf序列。
[0117]
在延伸溶液中的el引物7的浓度优选为5～100nm。通过是此浓度范围，可进一步提升反应的特异性及效率。
[0118]
在延伸工序(s1
‑
3)中，优选将延伸溶液和含解离工序后的逆转录产物6的反应液混合而维持在约10℃～80℃。由此，el引物7的第2引物部8a与逆转录产物6的第1a的序列5杂交，el引物7及逆转录产物6以互相作为模板延伸，得到了含第1a的序列5的互补序列9(即，与第1序列相对应的dna序列)的延伸产物10。
[0119]
第1引物部4a、第2引物部8a可仅由dna构成，也可含lna和/或pna。越多含这些，可使杂交的结合力变强。从而，lna和/或pna的数根据与杂交的序列的期望的tm值而确定即可。例如，当使含lna和/或pna时，可在更高的温度进行逆转录工序(s1
‑
1)及延伸工序(s1
‑
3)，能抑制非特异性的结合。结果，能更高精度地将目标mirna逆转录及延伸。
[0120]
第1lamp识别序列4b及第2lamp识别序列8b优选以下述的(1)～(7)的组合含识别序列。其中，下述的各识别序列的顺序是第1引物部4a或第2引物部8a侧至5'末端的顺序。“c”是指如刚记载的序列的互补序列。例如，“lbc序列”是指lb序列的互补序列。“虚拟序列”是具有与第1a的序列、f2序列、f1序列、lf序列、b1序列、b2序列、lb序列及其互补序列不同的碱基序列的核酸序列。
[0121]
(1)第1lamp识别序列4b含b2序列，
[0122]
第2lamp识别序列8b含b1c序列、f1序列及f2序列。
[0123]
(此时，以第1a的序列的互补序列9的至少1部分作为lb序列。)
[0124]
(2)第1lamp识别序列4b含lbc序列及b2序列，
[0125]
第2lamp识别序列8b含b1c序列、f1序列及f2序列。
[0126]
(3)第1lamp识别序列4b含虚拟序列及b2序列，
[0127]
第2lamp识别序列8b含b1c序列、f1序列及f2序列。
[0128]
(4)第1lamp识别序列4b含b1序列及b2序列，
[0129]
第2lamp识别序列8b含f1序列、lfc序列及f2序列。
[0130]
(5)第1lamp识别序列4b含b2序列，
[0131]
第2lamp识别序列8b含f1序列、lfc序列及f2序列。
[0132]
(6)第1lamp识别序列4b含lbc序列及b2序列，
[0133]
第2lamp识别序列8b含f1序列及f2序列。
[0134]
(7)第1lamp识别序列4b含b1序列及b2序列，
[0135]
第2lamp识别序列8b含lfc序列及f2序列。
[0136]
在rt引物3的第1引物部4a和第1lamp识别序列4b之间、el引物7的第2引物部8a和第2lamp识别序列8b之间、和/或各lamp识别序列所含的各识别序列之间，也可存在间隔物序列。间隔物序列与第1a的序列、各识别序列及它们的互补序列的序列不同，并且不给后述的延伸产物的扩增反应不良影响的核酸序列。间隔物序列可仅由dna构成，也可含lna和/或pna。例如，间隔物序列是1个碱基～16个碱基，优选为聚t序列或聚a序列等。
[0137]
扩增工序(s1
‑
4)使用lamp法进行。在此工序中，使用含例如，扩增用引物组、锁取代型dna聚合酶、盐及dntp等的底物(根据需要增稠剂、ph调制用缓冲材、表面活性剂及离子)等的扩增溶液。
[0138]
扩增用引物组的种类及序列根据第1lamp识别序列4b及第2lamp识别序列8b的序列而选择。例如，扩增用引物组含与第1lamp识别序列4b及第2lamp识别序列8b的序列相对应的fip引物及bip引物。如果需要，也可还含f3引物、b3引物和/或lf引物或lb引物等的环引物。
[0139]
在以rt引物3、及el引物7的lamp识别序列的组合作为上述(1)～(7)时，扩增用引物组优选设为以下的组合。再者，下述(1)～(7)与上述(1)～(7)各自相对应。
[0140]
(1)含f2序列及f1c序列的fip引物、
[0141]
含b2序列及b1c序列的bip引物、及
[0142]
含第1a的序列的互补序列9的lb引物。
[0143]
(2)含f2序列及f1c序列的fip引物
[0144]
含b2序列及b1c序列的bip引物、及
[0145]
含lb序列的lb引物。
[0146]
(3)含f2序列及f1c序列的fip引物
[0147]
含b2序列及b1c序列的bip引物、及
[0148]
含第1a的序列的互补序列9的lb引物。
[0149]
(4)含b2序列及b1c序列的fip引物
[0150]
含f2序列及f1c序列的bip引物、及
[0151]
含lf序列的lf引物。
[0152]
(5)含f2序列及f1c序列的fip引物
[0153]
含b2序列及第1a的序列的互补序列9的bip引物、及
[0154]
含lf序列的lf引物。
[0155]
(6)含f2序列及f1c序列的fip引物
[0156]
含b2序列及第1a的序列的互补序列9的bip引物、及
[0157]
含lb序列的lb引物。
[0158]
(7)含f2序列及第1a的序列5的fip引物
[0159]
含b2序列及b1c序列的bip引物、及
[0160]
含lf序列的lf引物。
[0161]
更优选设为上述(1)的组合时。另外，在设为上述(1)的组合时，作为rt引物3、el引物7、扩增用引物组，优选使用例如，以下的表1中所示的引物组a～d或引物组j。
[0162]
【表1】
[0163][0164][0165]
特别是，优选使用引物组a或j。这些引物组比其他引物组稳定性特别优良。引物组
j稳定性更优良，更优选的。稳定性优良是指，进行多次检测时结果难以发生偏差，另外，难以发生非特异性扩增，得到了可靠性更高的结果。
[0166]
各引物的序列不限于上述表中所示的，还可使用上述序列之中有1或2个碱基的缺失、取代、附加或插入的。
[0167]
fip引物、bip引物、lb引物的扩增溶液中的浓度是，fip引物、bip引物优选为0.8μm～2.4μm、lb引物优选为0.4μm～1.2μm。通过是此浓度范围，可进一步提升反应的特异性及效率。
[0168]
在扩增工序(s1
‑
4)中，在等温扩增反应条件下维持含延伸产物10的溶液和扩增溶液的混合物。例如，等温扩增条件以温度50～75℃的等温作为30～90分钟等即可，温度优选为60～70℃。由此，延伸产物10被扩增，得到了含目标mirna1的cdna(第1a的序列5)及其互补序列的扩增产物。
[0169]
检测工序(s1
‑
5)优选检测对应于扩增工序(s1
‑
4)中经时扩增产物的增加而改变的信号，对于信号的开始时间进行测定，结果，进行目标mirna的定量。经时是指，可连续，也可以期望的时间间隔在多个时间点检测。
[0170]
作为信号，优选使用自例如反应液的浊度、或者反应液的光学信号或电化学信号等。在使用光学信号时，例如，优选在发生对应于扩增产物的增加而改变的光学信号的标记物质的存在下进行扩增反应。此时，标记物质是例如荧光试剂或嵌入剂等的指示剂。在使用电化学信号时，例如，优选在发生对应于扩增产物的增加而改变的电化学信号的标记物质的存在下进行扩增反应。此时，标记物质是例如氧化还原探针等。
[0171]
检测优选例如，使用检测用装置进行。检测用装置含例如芯片。芯片是对于目标mirna进行扩增，检测扩增产物的扩增检测部，例如，具备基板和配备在基板之一面上的1个以上的检测区域。例如，可在上述1个面上进行逆转录工序(s1
‑
1)～扩增工序(s1
‑
4)，在存在扩增产物时，可在检测区域检测信号。另外，检测装置可还具备从在扩增检测部中得到的检测的结果算出目标mirna的定量值的算出部。
[0172]
检测区域，在使用光学信号时，是例如光学传感器。检测区域，在使用电化学信号时，是例如电极。电极，由于当例如是金时灵敏度良好，从而优选。
[0173]
也可向检测区域的附近能游离地固定用于对目标mirna进行逆转录的逆转录用引物、用于延伸目标mirna的延伸用引物和/或用于扩增目标mirna的扩增用引物组。
[0174]
另外，在检测工序(s1
‑
5)中，也可使用核酸探针。核酸探针具有与扩增产物杂交的序列，通过检测核酸探针和扩增产物的杂交，可检测扩增产物。例如，也可向上述检测用装置的检测区域附近固定核酸探针。
[0175]
接下来，自在检测工序(s1
‑
5)中得到的信号的开始时间起对试样中的目标mirna进行定量。例如，可确定为开始时间越早，目标mirna的存在量越多。例如，优选使用表示开始时间和目标mirna的存在量的关系的校准曲线，进行试样中的目标mirna的定量。
[0176]
根据以上说明的第3实施方式的定量工序，可更特异性并且有效率地逆转录目标mirna，延伸，扩增，检测。从而，通过在第3实施方式的定量工序中进行第1实施方式的定量工序(s1)及第2实施方式的定量工序(s11)，能更高精度地判定癌、特别，目标癌的至少1种的罹患的有无。
[0177]
在进一步的的实施方式中，rna的提取效率有因细胞的种类而不同的情况。因此，
在定量工序中得到的定量值在判定工序中使用之前，优选基于rna提取效率而修正。修正例如，可如以下一样进行。预先向试样添加已知的量的标准mirna。例如向用于从试样提取rna的试剂添加(spike
‑
in)标准mirna。其后，与目标mirna一同提取标准mirna，与目标mirna的定量一同还进行标准mirna的定量。其后，可从标准mirna的定量值评价提取效率，修正目标mirna的定量值。
[0178]
标准mirna的定量优选使用专用的引物组，以与例如用图4中所示的方法对目标mirna进行定量相同的方式进行。
[0179]
标准mirna优选使用不存在于对象的mirna。作为标准mirna，可使用例如存在于线虫(caenorhabditis elegans)的cel
‑
mir
‑
39
‑
3p。cel
‑
mir
‑
39
‑
3p是具有以下的序列的mirna：
[0180]
ucaccgggug uaaaucagcu ug(seq id no:49)
[0181]
cel
‑
mir
‑
39
‑
3p可使用下述表2中记载的引物组k进行定量。
[0182]
[表2：cel
‑
mir
‑
39
‑
3p用引物组k]
[0183][0184]
各引物的序列不限于上述表中所示的，还可使用上述序列之中有1或2个碱基的缺失、取代、附加或插入的。
[0185]
例如，通过目标mirna的定量值除以标准mirna的定量值而得到了修正值。通过在以下的判定工序中使用修正值，能进行更正确的判定。
[0186]
在第3实施方式的方法中，也提供用于判定癌、或者目标癌的罹患的有无的试剂盒。此试剂盒优选例如，含上述的哪个的rt引物3、el引物7、扩增用引物组、和/或核酸探针。例如，试剂盒优选含选自上述表1中所示的引物组a～d及j的至少1个。
[0187]
另外，在第3实施方式的方法中，还可联用第2实施方式中说明的其他标志物。此时，其他标志物也优选用第3实施方式的方法进行定量。另外，此时，试剂盒也可还含用于其他标志物的rt引物、el引物、扩增用引物组。
[0188]
例如，在联用hsa
‑
mir
‑
92a
‑
3p时，试剂盒优选还含以下的表3中记载的引物组e～g中的任一个。对于lb引物，在任何引物组中，均可使用seq id no:25或26中的任一个。
[0189]
【表3】
[0190][0191][0192]
各引物的序列不限于上述表中所示的，还可使用上述序列之中有1或2个碱基的缺失、取代、附加或插入的。
[0193]
在联用hsa
‑
mir
‑
122
‑
5p时，优选使用以下的表4中记载的引物组h或i。对于lb引物，在任何引物组中，均可使用seq id no:39或40中的任一个。
[0194]
【表4】
[0195][0196]
各引物的序列不限于上述表中所示的，还可使用上述序列之中有1或2个碱基的缺失、取代、附加或插入的。
[0197]
在使用表3及4中所示的引物组时，可进一步特异性地对于hsa
‑
mir
‑
92a
‑
3p及hsa
‑
mir
‑
122
‑
5p进行定量。由此，前列腺癌及胰腺癌的检测精度进一步提升。用于试剂盒中所含的其他标志物的引物组不限于上述的，其他任何引物组也能含在试剂盒中。
[0198]
或者，由于第3实施方式的定量工序及试剂盒是能进一步特异性地检测及定量目标mirna，在以目标mirna作为标志物使用的其他疾病的检测中使用时，也可进一步高精度地进行其检测。例如，其他疾病是指神经障碍、认知症、肝炎、心脏疾病、类风湿等的自身免疫疾病等。
[0199]
另外，第3实施方式涉及的试剂盒也可含用于对于修正用的mirna进行定量的引物组或核酸探针。例如试剂盒也可还含表2中所示的引物组k。
[0200]
【实施例】
[0201]
接下来，对于使用实施方式的分析方法或试剂盒进行的实验进行记载。
[0202]
【实施例1：在使用qrt
‑
pcr法的健康者及癌患者中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量】
[0203]
准备从健康者29受试体、乳腺癌患者15受试体、大肠癌患者6受试体、胃癌患者5受试体、肺癌患者3受试体、卵巢癌患者5受试体、胰腺癌患者8受试体、胆管癌患者5受试体、食道癌患者5受试体、肝脏癌患者5受试体、脑肿瘤患者5受试体、膀胱癌患者4受试体、前列腺癌患者5受试体、肉瘤患者5受试体、子宫体癌患者4受试体、子宫肉瘤患者5受试体得到的合计114受试体的血清。
[0204]
(hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量)
[0205]
从全部血清提取rna。提取使用nucleospin(注册商标)mirna plasma(商品名、宝生物制)进行。添加cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的合成rna而进行提取。
[0206]
接下来，将存在于提取样品中的短链rna逆转录而对于cdna进行合成及扩增。合成根据taqman(注册商标)advanced mirna assay(商品名、thermofisher
·
scientific制)的
处理说明书而使用taqman(注册商标)advanced mirna cdna synthesis kit(商品名、thermofisher
·
scientific制)进行。
[0207]
接下来，使用taqman(注册商标)fast advanced master mix(商品名、thermofisher
·
scientific制)及taqman(注册商标)advanced mirna assay id：477897_mir进行taqman pcr，对于ct值进行测定。与样品一同，使用不同浓度的seq id no:1的合成rna(103、104、105、106拷贝/μl)同样地反应而作为校准曲线。
[0208]
(cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量)
[0209]
对于上述血清样品的cel
‑
mir
‑
39
‑
3p(seq id no:49)进行定量。cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的长链化及扩增用与hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p同样的方法进行。另外，使cel
‑
mir
‑
39
‑
3p以103，104，105，106拷贝/μl反应而制成校准曲线。通过与校准曲线比较来得到cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量值。
[0210]
(修正值的算出)
[0211]
接下来，hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量值除以cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量值而得到修正值。
[0212]
图5显示健康者及各癌患者中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量值的修正值的箱形图。修正值在健康者中分布于0～约0.4的范围，在癌患者中分布于超约0.55～约1的范围。结果表明，在癌患者中血清中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的存在量多。
[0213]
图6是显示将修正值以健康者组和癌患者组区分的结果的箱形图。癌患者组是将健康者以外的全部癌患者的结果合并，分布于比健康者高的值。区分健康者组及癌患者组的auc(曲线下面积，area under curve)是0.98。
[0214]
从而表明，hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p，作为用于区别检测健康者和癌患者的标志物是高性能的。
[0215]
【实施例2.在使用lamp法的健康者及癌患者中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量】
[0216]
(hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量)
[0217]
准备从与实施例1同样的受试体得到的血清。用与实施例1相同的方法从受试体进行rna的提取。将提取样品2μl在反应体积20μl、于16℃经10分钟、于42℃经5分钟、于85℃经5分钟的条件下逆转录。逆转录反应液的组成设为67unit multiscribe(注册商标)reverse transcriptase(*)、1
×
rt buffer(*)、0.1mm的dntps(*)、4u的rna酶out(商品名、thermofisher
·
scientific制)、10nm的rt引物。附“*”全部使用high
‑
capacity cdna reverse transcription kit(商品名、thermofisher
·
scientific制)中所含的。
[0218]
向逆转录后的反应液添加延伸溶液5μl，于95℃经2分钟后，将于95℃经20秒钟
‑
于59℃经30秒钟
‑
于72℃经10秒钟的循环进行20次延伸。延伸溶液在25μl中含deepvent(exo
‑
)dnapolymerase(0.5u、newenglandbio)，调整为终浓度成为0.2
×
thermopol buffer(deepvent(exo
‑
)dnapolymerase附属)、0.2mm的mgso4、0.12mm的dntps、10nm的el引物。
[0219]
接下来，将延伸的产物1μl，在反应体积25μl、在65℃60分钟的条件下进行lamp扩增，同时对于荧光强度的开始时间进行测定。lamp扩增溶液含8u的tin(exo
‑
)lf dnapolymerase(optigene)、0.5μl的evagreen(注册商标)(biotium)，调整为终浓度各自成为20mm的tris
‑
hcl(ph8.0)、50mm的kcl、8mm的mgso4、10mm的(nh4)2so4、0.1％的tween
‑
20、0.8m的甜菜碱、各1.4mm的dntps、1.6μm的fip引物、1.6μm的bip引物、及0.8μm的lb引物。用实时pcr装置，对于荧光强度经时进行测定，对于超阈值的时间进行测定。
[0220]
上述rt引物、el引物、fip引物、bip引物及lb引物使用表1的引物组a或引物组j。
[0221]
与样品一同，将已知的浓度的seq id no:1的合成rna使用上述的引物逆转录、延伸及lamp扩增，同样地对于荧光强度的开始时间进行测定。合成rna的浓度是，对于引物组a，设为0、103、104、105及106拷贝/μl，对于引物组j，设为0、5
×
102、5
×
103、5
×
104、5
×
105拷贝/μl。使用结果而制成seq id no:1的rna的拷贝数和开始时间的校准曲线，使用此校准曲线，从各受试体中的开始时间算出rna的拷贝数。
[0222]
(cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量)
[0223]
对于上述血清样品的cel
‑
mir
‑
39
‑
3p(seq id no:49)进行定量。cel
‑
mir
‑
39
‑
3p提取、长链化及扩增用与hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p同样的方法进行。cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的逆转录使用20nm rt引物、长链化使用40nm el引物。扩增使用1.6μm的fip引物、1.6μm的bip引物、及0.8μm的lb引物。
[0224]
上述rt引物、el引物、fip引物、bip引物及lb引物使用表2的引物组k。
[0225]
另外，使cel
‑
mir
‑
39
‑
3p以103，104，105，106拷贝/μl反应而制成校准曲线。通过与校准曲线比较来得到cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量值。
[0226]
(修正值的算出)
[0227]
接下来，hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的定量值除以cel
‑
mir
‑
39
‑
3p的定量值而得到修正值。
[0228]
图7显示使用引物组a时的健康者及各癌患者中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的修正值的箱形图。hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p在健康者中分布于约0.15～约0.55的范围，与此相比，在癌患者中分布于约0.35～约0.95的高的值的范围。另外，在除子宫肉瘤之外的目标癌的患者中分布于约0.5～约0.95的更高的值的范围。结果表明，在癌患者、特别目标癌的患者中血清中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的存在量多。
[0229]
图8是显示将图7的修正值以健康者组和癌患者组区分的结果的箱形图。癌患者组是将上述健康者以外的全部癌患者的结果合并，分布于比健康者高的值。区分健康者组及癌患者组的auc是0.93。
[0230]
图9是显示将图10的修正值以目标癌的患者组和子宫肉瘤的患者组区分的结果的箱形图。他癌患者组分布于比健康者组高的值，目标癌患者组分布于比子宫肉瘤的患者组还高的值。区分他癌患者组和4种癌患者组的auc是0.95。
[0231]
图10显示使用引物组j时的健康者及各癌患者中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的修正值。hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p在健康者中分布于约0.25～约0.50的范围，与此相比，在癌患者中分布于约0.42～约0.80的高的值的范围。另外，在目标癌的患者中分布于比子宫肉瘤高的值的范围。结果表明，在癌患者、特别目标癌的患者中血清中的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p的存在量多。
[0232]
图11是显示将图10的修正值以健康者组和癌患者组区分的结果的箱形图。癌患者组是将上述健康者以外的全部癌患者的结果合并，分布于比健康者高的值。区分健康者组及癌患者组的auc是0.90。
[0233]
图12是显示将图10的修正值以目标癌的患者组和子宫肉瘤的患者组区分的结果的箱形图。他癌患者组分布于比健康者组高的值，目标癌患者组分布于比子宫肉瘤的患者组还高的值。区分子宫肉瘤组和4种癌患者组的auc是0.92。
[0234]
从而表明，hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p作为用于区别检测健康者和癌患者的标志物、或用于区别检测目标癌和健康者或子宫肉瘤患者的标志物是高性能的。
[0235]
另外，评价引物组的稳定性。使用多种引物组，对于已知的拷贝数的hsa
‑
mir
‑
1301
‑
3p进行定量而制成校准曲线。扩增用实时pcr装置，对于荧光强度经时进行测定，对于超阈值的时间进行测定。测定以2次重复进行，算出超阈值的时间的平均值和cv。多次重复定量，评价校准曲线的式的再现性。在结果优良的引物组a中的结果示于表5，在结果更优良的引物组j中的结果示于表6。对于引物组a而制成6次(第1～6次)校准曲线，对于引物组j而制成5次(第1～5次)校准曲线。
[0236]
[表5：引物组a]
[0237][0238]
[表6：引物组j]
[0239][0240]
如表5所示，在引物组a中的校准曲线的斜率是2.15～2.72的范围，偏差少。从而表明，引物组a是可进一步稳定而对于mirna进行定量的优良的引物组。
[0241]
如表6所示，在引物组j中的校准曲线的斜率是2.75～2.90，与引物组a相比更偏差少。另外，在第1～5次的任何中，在mirna的浓度是0拷贝时，均观察不到荧光的开始，表明难引起非特异性扩增。另外，在引物组j中，以与引物组a相同的浓度比较之时也偏差少。例如，在引物组a中，106拷贝之时的开始时间在每次有偏差，对于引物组j，5
×
105的开始时间是每次偏差少。
[0242]
以上表明，引物组j是可进一步稳定而对于mirna进行定量的更优良的引物组。
[0243]
【实施例3.电化学检测】
[0244]
调制含在实施例2中使用的fip引物及bip引物(各48μm)、lb引物(24μm)的引物溶液。向硅酮制流路包装(流路宽度
×
高度：1mm
×
1mm)使用微量分注机点斑引物溶液100nl。将使电极图案化的dna芯片基板(玻璃(0.8mm)/钛(500nm)/金(2000nm))和该流路包装整合到盒，制作芯片。
[0245]
接下来，调整表7中所示的组成的lamp扩增反应液。
[0246]
[表7：lamp扩增反应液的组成]
[0247]
成分终浓度tris
‑
hcl(ph8.8)20mmkcl60mm
mgso48mm(nh4)2so410mmtween200.1％dntps各自1.4mmtin exo
‑
dna聚合酶48个单位(
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3)甜菜碱0.8mruhex1mm模板1μl反应液量60μl
[0248]
向上述lamp扩增反应液添加1μl的在实施例2中使用的延伸后的模板，在表8中所示的条件下进行电化学测定。
[0249]
[表8：电化学测定条件]
[0250]
项目详细测定方法线形扫描伏安法(lsv)扫描电位0.1～
‑
0.4v扫描速度0.5v/s温度65℃
[0251]
在开始lamp扩增反应时，钌六胺(ruhex)的还原电流值开始增加。电流增加的时间是延伸产物的存在量越多越快，表明使用本芯片能进行定量检测。
[0252]
对于本发明的几个实施方式进行说明，这些实施方式例如是例示，不旨在限定发明的范围。这些新的实施方式能以此外的各种各样的形态实施，可在不脱离发明的要点的范围内进行各种省略、置换，变更。这些实施方式或其变形包括在发明的范围或要点的同时，包括在记载在专利权利要求的发明或与其均等的范围内。