一种增强型黄光碳点及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种增强型黄光碳点及其制备方法和应用，属于功能型发光碳材料制造技术领域。


背景技术：

2.细胞内温度的细微差异能指示细胞的生存状态，而对温度进行实时和精确的监控已成为生物医学诊断和治疗过程中重要的研究手段。然而，传统的测温技术，如热电偶、热敏电阻器、电阻式温度监测器和红外检测器等均很难对细胞内微观区域的温度进行检测，且所用温敏性材料的生物相容性较差。近年来，研究者借助荧光材料的某些发光信息(如光谱位置、谱带形状、偏振方向、发光强度和衰减寿命等)对温度的响应构筑荧光纳米温度探针，以满足细胞内温度测定的实际需求。此法具有非直接接触、高的时间和空间分辨率、温度响应和荧光成像双重功能、操作简便等优点，利于精确、便携测量。
3.碳点作为一种新型的光致发光材料，与传统的量子点相比，具有荧光稳定、水溶性好、无光闪烁、激发和发射波长可调、生物相容性好、毒性低等优点，在生物传感和成像示踪领域展示出广阔的应用前景。然而，现有的基于碳点制备的纳米温度计其荧光强度大多都是随着温度升高而猝灭的，由于生物体系特殊、复杂，这类荧光猝灭型探针容易受到环境的干扰，导致可能产生假阳性信号，不利于细胞内温度信息的有效、准确传达。因此，开发一种随着温度升高荧光强度增强的碳点对细胞内的温度进行监测十分必要。


技术实现要素：

4.本发明基于现有技术的不足，提供了一种增强型黄光碳点及其制备方法，该增强型黄光碳点能够用于实时检测细胞内的温度。
5.本发明的第一个目的是提供一种增强型黄光碳点的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
6.(1)将柠檬酸和尿素溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，然后将溶液转移至反应釜中，在150
‑
180℃条件下反应4
‑
8h，得到碳化混合物；
7.(2)以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂按照二氯甲烷:甲醇体积比为8:1～1:1的比例作为洗脱剂在层析柱中对步骤(1)得到的碳化混合物进行分离纯化，具体的，按照二氯甲烷和甲醇体积比从大到小配制的洗脱剂依次对碳化混合物进行分离纯化，收集二氯甲烷和甲醇体积比为1:1～2时洗脱得到的溶液，旋蒸除去溶剂后干燥即得到所述增强型黄光碳点。
8.在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述柠檬酸和尿素的摩尔比为0.14
‑
0.4。
9.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，利用层析柱进行分离纯化时，首先，将步骤(1)所得碳化混合物与一定质量的硅胶粉以及二氯甲烷搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，然后装柱进行分离纯化。
10.在本发明的一种实施方式中，所述硅胶粉的加入量为所得碳化混合物质量的8～
12倍。
11.在本发明的一种实施方式中，所述二氯甲烷的加入量为所得碳化混合质量的3～5倍。
12.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述分离纯化的过程中，依次洗脱所用的洗脱剂的二氯甲烷和甲醇体积比依次为：7～8:1、5～6:1、3～4:1、1:1～2。
13.在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述分离纯化的过程中，洗脱所用的洗脱剂中二氯甲烷和甲醇体积比依次为：8:1、5:1、3:1、1:1～2。
14.在本发明的一种实施方式中，当二氯甲烷和甲醇的体积比为8:1时，得到靛青色碳点，当二氯甲烷和甲醇的体积比为5:1时，得到蓝色碳点，当二氯甲烷和甲醇的体积比为3:1时，得到橙色碳点，收集二氯甲烷和甲醇体积比为1:1～2时的溶液，旋蒸除去溶剂后进一步冷冻干燥得到所述的极性最大的黄光碳点。
15.在本发明的一种实施方式中，在柱层析过程中不断改变二氯甲烷和甲醇的体积比，收集其体积比为1:1时极性最大的黄光碳点。
16.本发明的第二个目的是提供上述制备方法制备得到的黄光碳点。
17.在本发明的一种实施方式中，所述黄光碳点的基本单元之间通过分子内氢键相连接。
18.在本发明的一种实施方式中，所述黄光碳点表面保留碳源的多数官能团(如
‑
cooh,
‑
oh等)，这些官能团促进了碳点内多个基本单元之间通过分子内氢键相连接。在高温下氢键发生断裂，导致基本单元的刚性结构增加，扭曲程度降低，从而促进黄光碳点的荧光强度增强。随着温度的升高分子内氢键的部分断裂使得黄光碳点的荧光强度增强，因此本发明所制备的黄光碳点可以实现对温度的正响应。
19.本发明的第三个目的是提供一种测定细胞内温度的方法，所述方法是利用上述的增强型黄光碳点或上述方法制备得到的黄光碳点进行温度测定。
20.本发明的第四个目的是提供一种荧光纳米温度探针或温度计，所述温度探针或温度计包括上述制备方法制备得到增强型黄光碳点或上述增强型黄光碳点。
21.本发明的第五个目的是将上述的增强型黄光碳点或上述制备方法在温度检测、生物成像、生物医学和光电设备等领域的应用。
22.有益效果：
23.1)本发明合成的黄光碳点具有量子产率高、无毒性、生物相容性好、稳定性好的优点
24.2)本发明通过设计分子内氢键诱导刚性结构的变化合成了随着温度升高荧光强度增强的黄光碳点，避免了常见的猝灭型纳米温度计易受环境影响导致假阳性信号的出现而无法实现对温度的准确检测的问题。
25.3)本发明所制备的黄光碳点在温度检测，生物成像和光电设备等领域具有应用价值。
附图说明
26.图1为实施例1的黄光碳点的透射电子显微镜(tem)照片，插图为高分辨tem照片；
27.图2为实施例1的黄光碳点的紫外可见吸收、荧光激发和发射谱图；
28.图3为实施例1的黄光碳点的红外谱图；
29.图4为实施例1的黄光碳点的变温核磁共振氢谱图；
30.图5为实施例1的黄光碳点的差示扫描量热图；
31.图6为实施例1的黄光碳点的质谱图；
32.图7为实施例1的黄光碳点的基本单元之间通过分子内氢键连接的示意图；
33.图8为实施例1的黄光碳点随着温度从15℃升高到85℃的荧光光谱图；
34.图9为实施例1的黄光碳点在不同浓度氯化钠的存在下的荧光强度图；
35.图10为实施例1的黄光碳点在ph从2到12的荧光强度图；
36.图11为实施例1的黄光碳点在不同金属阳离子存在下的荧光强度图；
37.图12为实施例1的黄光碳点在不同生物活性分子存在下的荧光强度图；
38.图13为实施例1的黄光碳点对hela细胞的细胞毒性测试图；
39.图14为实施例1的黄光碳点的细胞成像图。
具体实施方式
40.透射电镜：jeol jem 2100plus透射电子显微镜(200kv加速电压)；
41.荧光光谱仪：edinburgh fs5荧光分光光度计；
42.红外光谱仪：nicolet 6700光谱仪；
43.紫外可见分光光度计：uv
‑
2700分光光度计；
44.差示扫描量热仪：netzsch dsc 204f1分析仪；
45.核磁共振谱仪：bruker avanceⅲhd光谱仪。
46.下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
47.实施例1
48.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1、3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
49.将所得粉末分散在超纯水中，对其进行透射电子显微镜测试，结果如图1，黄光碳点在水中分散良好，它们的尺寸分布在5.0至12.9nm的范围内，平均尺寸约为8.3nm。在高分辨率tem图像中，0.21nm的良好分辨的晶格间距对应于石墨烯碳的(100)晶格平面，表明碳点的成功制备。
50.通过紫外可见分光光度计和荧光光谱仪测试其光学性质，结果如图2所示，所制备的材料在248nm，328nm和406nm处有三个明显的吸收峰，应归因于c＝c/c＝n键的π
‑
π*跃迁和c＝o/c
‑
o键的n
‑
π*跃迁以及分子态跃迁，黄光碳点的最佳激发和发射波长分别位于425nm和540nm。
51.通过红外光谱分析碳点的结构，结果如图3所示，3432cm
‑1和3200cm
‑1处的吸收峰归于n
‑
h键以及o
‑
h键的伸缩振动，1703cm
‑1处的吸收峰为c＝o键的伸缩振动，1624cm
‑1处的
吸收峰为c＝n键的伸缩振动,c
‑
n键的伸缩振动峰在1384cm
‑1处。
52.通过变温氢谱测试碳点的结构，结果如图4所示，在常温下位于δ6.5的吸收峰，随着温度的升高逐渐向高场移动，表明了黄光碳点中存在氢键。
53.由图5可知，黄光碳点的分子内氢键通过差示扫描量热法(dsc)测量证实，在70℃左右的吸热跃迁可归因于分子内氢键的断裂。
54.由图6可知，表明黄光碳点基本单元的相对分子质量为439。
55.由图7可知，黄光碳点的基本单元之间通过分子内氢键相连接，随着温度的升高，分子内氢键部分断裂，导致碳点的刚性增加扭曲程度降低，因而实现了其荧光强度对温度的正响应。
56.黄光碳点的温敏性可由图8证明，随着温度从15℃逐步升高到85℃，黄光碳点的荧光强度逐步增加，表明黄光碳点的荧光强度随着温度的升高而增强。
57.分别检测黄光碳点在不同浓度的nacl溶液，不同ph环境下的溶液，不同金属阳离子存在下的溶液以及不同生物活性分子存在下的溶液中的荧光强度，图9
‑
12显示黄光碳点的荧光强度在不同的环境下基本保持不变，表明所制备的黄光碳点具有良好的荧光稳定性。
58.细胞毒性测试：将培养好的hela细胞置于不同浓度的黄光碳点中孵育24小时，在450nm处测量混合物的光密度，以没有在黄光碳点中孵育的细胞作为对照组，其细胞活力为100％，测得的光密度越高表明其对细胞的毒性越低。如图13所示，即使在黄光碳点浓度为40μg/ml的条件下，与黄光碳点孵育后细胞的活力仍保持在85％以上。这表明制备的黄光碳点具有良好的生物相容性和低毒性，可用于活细胞的光学温度测量。
59.如图14所示，共聚焦激光扫描显微镜图像显示了黄光碳点的细胞成像，并表现出良好的细胞形态。可以观察到随着温度的升高，标记细胞的荧光强度显着增加。因此，黄光碳点可用作生物体中的纳米荧光温度计。
60.实施例2
61.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到6：1再到4：1，2：1最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
62.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1一致。
63.实施例3
64.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至150℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：2)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：2时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到
极性最大的黄光碳点粉末。
65.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1一致。
66.实施例4
67.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至170℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：2)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：2时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
68.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
69.实施例5
70.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至180℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为7：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从7：1降低到6：1再到4：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
71.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
72.实施例6
73.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持4h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
74.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
75.实施例7
76.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持8h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
77.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
78.实施例8
79.称取1g的柠檬酸和2.8g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的10倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的5倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
80.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
81.实施例9
82.称取1g的柠檬酸和1.4g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
83.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
84.实施例10
85.称取1g的柠檬酸和0.78g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，将二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1时所收集的溶液进行减压蒸馏并进一步冷冻干燥，得到极性最大的黄光碳点粉末。
86.按照实施例1的方式测试，其荧光强度及其测试结果与实施例1类似。
87.对比例1
88.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于水中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，仅得到一种蓝光碳点，且所得到的蓝光碳点不具有随着温度升高荧光强度增强的特性。
89.对比例2
90.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为30：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从30：1降低到20：1再到10：1，5：1，3：1，
最后到1：1)，无法得到的所述的增强型黄光碳点。
91.对比例3
92.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为3：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从3：1降低到2：1再到1：1)，无法得到的所述的增强型黄光碳点。
93.对比例4
94.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂将其纯化，石油醚和乙酸乙酯的体积初始比为8：1，逐步降低石油醚和乙酸乙酯的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，无法得到的所述的增强型黄光碳点。
95.对比例5
96.称取1g的柠檬酸和2g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至160℃保持6h。待反应结束后冷却至室温后，将反应所得的碳化混合物通过柱层析法，以石油醚和二氯甲烷为洗脱剂将其纯化，石油醚和二氯甲烷的体积初始比为8：1，逐步降低石油醚和二氯甲烷的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，无法得到的所述的增强型黄光碳点。
97.对比例6
98.称取1g的柠檬酸和1.4g尿素，将两者溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在反应釜中加热至120℃保持6h。待反应结束后冷却至室温，将反应所得的碳化混合物与一定质量的硅胶粉(碳化混合物质量的8倍)以及适量的二氯甲烷(碳化混合物质量的3倍)搅拌均匀后，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析法，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂将其纯化，二氯甲烷和甲醇的体积初始比为8：1，逐步降低二氯甲烷和甲醇的体积比(从8：1降低到5：1再到3：1，最后到1：1)，无法得到的所述的增强型黄光碳点。
99.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。