靶向c5ar的抗体
技术领域
1.本公开涉及与c5ar、特别是与人c5ar相互作用的抗体。本公开还涉及能够表达所述抗体的核酸组合物、载体组合物和宿主细胞，包含所述抗体的药物组合物以及所述抗体在治疗特定疾病和/或用于诊断目的中的用途。
背景技术：
2.c5a过敏毒素趋化性受体1(c5ar)(也称为cd88)是一种属于视紫红质家族的g蛋白偶联受体(gpcr)，是在血清中作为补体应答的核心效应子成分之一产生的配体c5a的两个高亲和力受体之一。在生理条件下，c5a充当炎症细胞的趋化剂，刺激其呼吸爆发以及细胞因子和趋化因子的释放，并起到增加血管通透性的作用。
3.c5ar似乎由各种细胞类型广泛表达。对中性粒细胞描述有最高c5ar表达水平。对巨噬细胞/单核细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、肺血管平滑肌细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、成骨细胞、破骨细胞、上皮和内皮细胞已显示出中低表达水平(monk pn等,br j pharmacol.2007,152:429
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448；wetsel ra,immunol lett.1995,44:183
–
187)。对于t细胞，已观察到低表达水平(nataf s,j immunol.1999,162:4018
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4023)。
4.细胞对c5a的反应受到配体诱导的受体内化的严格控制。c5ar被描述为在c5a处理时迅速且剂量依赖性地内化，并且高达90％的受体循环回到细胞表面。因此，由于靶点介导的药物处置(tmdd)效应，c5ar的高表达水平及其快速周转率可能会在功效方面受到限制。
5.c5ar与c5a的相互作用已在许多不同的疾病背景中进行了描述。其中的大多数都参与了炎症和自身免疫性疾病(morgan bp等,nat rev drug discov.2015,14:857
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877；hawksworth oa等,mol immunol.2017,89:36
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43)。已经进行了一些初步研究，以识别c5a刺激肿瘤生长的潜在机制(markiewski mm等,nat immunol.2008,9:1225
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1235；corrales l.等,j immunol.2012,189:4674
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4683；cho ms等,cell rep.2014,6:1085
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1095)。大多数数据表明c5a增加癌细胞的增殖、肿瘤内血管生成并增强肿瘤的侵袭性和转移性。最近的数据还表明了c5a/c5ar在实体瘤背景下在产生免疫抑制环境中的作用(sayegh et等,cancer med.2014,3:747
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758；darling vr等,expert rev clin immunol.2015,11:255
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263；markiewski mm等,cancer res.2009,69:6367
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6370)，通过抑制抗肿瘤反应(例如表达c5ar的髓样细胞如髓样来源的抑制细胞(mdsc)或m2巨噬细胞的募集增加)导致原发肿瘤生长增强。基于这些发现，与已知的抗肿瘤药物(例如免疫检查点蛋白抑制剂)的联合策略旨在通过减少免疫抑制性微环境来增强受试者的免疫反应成为研究和临床开发的焦点(wang y等:cancer discov.2016,6:1022
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1035)。
6.迄今为止，仅批准了一种靶向c5a上游分子即c5的特异性补体治疗剂。人源化的抗c5 mab依库丽单抗(eculizumab)能够结合c5，防止其裂解和c5a与c5b蛋白的形成，以及随后的mac形成。各种其他治疗性单克隆c5特异性抗体，例如alxn1210或lfg316，正在临床评估中(hawksworth oa等,mol immunol.2017,89:36
–
43)。但是，由于感染风险增加是慢性c5治疗的主要问题，因此在防止其他补体成分生物学活性的同时特异性靶向下游分子具有明
显优势。因此，许多拮抗性c5a特异性单克隆抗体正在开发中。
7.与分别靶向c5或c5a相比，直接靶向c5ar具有许多优势。首先，仅受体的抑制将保留mac活性，从而降低感染的潜在风险。第二，c5ar阻断允许c5a与其第二受体c5l2继续相互作用。由于c5l2据报道具有抗炎作用，因此维持有效的c5l2信号传导通路可能会导致功效提高或剂量要求降低。第三，直接靶向c5ar由于其分子量小和周转率高，与抑制可溶性c5a相比可提供药效动力学优势。总体而言，对开发在临床前和临床试验中进行测试的例如适体、肽和非肽小分子的c5ar抑制剂存在浓厚的兴趣。
8.针对人c5ar的n端胞外区并且能够干扰c5ar
‑
c5a相互作用的中和性多克隆抗血清或单克隆抗体已在本领域进行了描述(参见例如，morgan等,the journal of immunology,vol 151,377
–
388.no.1,july 1,1993；oppermann等,the journal of immunology,vol 151,3785
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3794,no.7,october 1,1993)。
9.但是，这些c5ar特异性抗体不适合用于人类的临床开发和治疗用途，尤其是由于它们的动物起源(使它们在人类患者中具有免疫原性)、克隆性和/或与相关动物物种缺乏交叉反应性。
10.已经考虑将靶向c5ar的治疗性抗体用于临床开发。但是，由于免疫细胞耗竭和免疫原性的问题，拮抗性c5ar特异性抗体neutrazumab(一种人源化igg4 mab)的临床开发在ii期临床试验中被终止(daniluk s等,annals of the rheumatic diseases.2014,73:684
–
685)。由于c5ar似乎在多种细胞类型上组成性表达，因此重要的是拮抗性抗体不会诱导靶细胞的耗竭。
11.为了克服neutrazumab的局限性，已经产生了第二代c5ar特异性抗体，即nnc0215
‑
0384(us2013/0295116(novo nordisk)；克隆32f3a6gl)。该抗体是源自转基因小鼠的人igg1抗体，目前正作为iph5401在癌症领域进行临床开发(olivier demaria等,innate pharma2017.poster#b184.cri
‑
cimt
‑
eati
‑
aacr mainz)。iph5401带有一个沉默的人igg1 fc区，以消除抗体诱导效应子功能的能力。该抗体在本文中称为refmab#1。
技术实现要素：
12.本公开提供了新的抗体和抗体片段。
13.本文公开的抗体和抗体片段可以与人c5ar特异性结合，并且优选与食蟹猴的c5ar交叉反应。因此，在一些实施方式中，所公开的抗体对人c5ar和食蟹猴c5ar具有特异性。在一些其他实施方式中，所公开的抗体或抗体片段与人和食蟹猴c5ar的n端胞外区结合。
14.这与上述参考的现有技术抗体iph5401相反，iph5401与人c5ar的第二个胞外环结合，导致不能与食蟹猴c5ar(一种常用的相关毒理学物种)结合。
15.另外，本发明的发明人令人惊讶地发现，与iph5401相比，目前要求保护的c5ar特异性抗体不仅在中和病理生理学c5a浓度方面显著更有效，而且还显示出随着时间的推移在体外抑制c5介导的中性粒细胞活化方面的效能增加。
16.因此，在一些实施方式中，所公开的抗体可以在体外，特别是在病理生理学c5a浓度下，高效地抑制c5a诱导的c5ar活性。如所公开的抗体或抗体片段在粒细胞和/或单核细胞中抑制c5a诱导的cd11b上调的能力所确定的，其也可以在体外抑制c5a诱导的白细胞活化。在一些实施方式中，所公开的抗体或抗体片段在体外在150nm人c5a存在下以42nm的ic
50
浓度抑制人粒细胞中人c5a诱导的cd11b表达。在一些其他实施方式中，在延长的孵育时间之后，所公开的抗体可以显示出在抑制粒细胞和/或单核细胞中c5a诱导的cd11b上调方面增加的效能。所公开的抗体在抑制c5a诱导的中性粒细胞迁移方面也可以是高效的。
17.总之，本公开提供一种新抗体，其优于本领域已知的c5ar特异性抗体。特别地，本公开的抗体是与人c5ar具有高亲和力结合的人抗体，其优选与食蟹猴c5ar交叉反应并且具有以前未观察到过的有利的功能性和安全性。这些特征使得本公开的抗体非常适合用于治疗用途，例如用于预防和/或治疗炎性和自身免疫性疾病以及癌症。
18.本公开提供了与人c5ar特异性结合的分离的抗体或抗体片段，其具有根据本说明书的表1或表2的cdr区。本公开还提供了对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其具有包含根据本说明书的表1或表2的氨基酸序列的可变重链区(vh)和可变轻链区(vl)。本公开还提供了对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其具有包含根据本说明书的表1或表2的氨基酸序列的重链(hc)和轻链(lc)。
19.本公开的分离的抗体在体外基本上不诱导效应子功能。这样的效应子功能可包括adcp、adcc或cdc。此外，本公开的分离的抗体或抗体片段包含一个或多个选自l234a、l235e、g237a、a330s和p331s的氨基酸取代，根据eu索引编号。特别地，本公开的分离的抗体或抗体片段包含变体人igg1 fc区，其包含以下氨基酸取代：l234a，l235e，g237a，a330s和p331s，根据eu索引编号。
20.本公开还提供了用于医药的本公开的分离的抗体或抗体片段。
21.本公开还提供了通过向患有诸如炎性或自身免疫性疾病或癌症的疾病的受试者施用有效量的本公开的抗体或抗体片段来治疗所述受试者的方法。优选地，所述受试者是人。
22.本公开还提供了药物组合物，其包含本公开的分离的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。
23.本公开还提供了编码本公开的分离的抗体或抗体片段的核酸组合物。本公开还提供了载体组合物，其包含编码本公开的分离的抗体或抗体片段的核酸组合物。本公开还提供了宿主细胞，其包含编码本公开的分离的抗体或抗体片段的载体组合物或核酸组合物。
24.本公开还提供了通过向患有诸如炎性疾病、自身免疫性疾病或癌症的疾病的受试者施用有效量的本公开的分离的抗体或抗体片段来治疗所述受试者的方法。优选地，所述受试者是人。
25.本公开还提供了药物组合物，其包含本公开的分离的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。
26.所要求保护的抗体或抗体片段是有用的。此外，所要求保护的方法是有用的，可用于识别此类抗体或抗体片段。
27.所要求保护的抗体或抗体片段的使用是为了改变人c5ar的生物学活性。特别地，所要求保护的抗体或抗体片段用于治疗用途，例如治疗炎性或自身免疫性疾病或癌症。
附图说明
28.图1：通过facs测定的mab#1、mab#2、refmab#1和阴性同种型对照mor03207与人c5ar和食蟹猴c5ar的细胞结合。a与在flp
‑
in cho细胞上过表达的人c5ar结合的剂量反应。
b与在flp
‑
in cho细胞上过表达的食蟹猴c5ar结合的剂量反应。c与从三个不同供体的全血获得的纯化人中性粒细胞结合的平均剂量反应。d与从三只不同的猴子的全血中获得的纯化食蟹猴中性粒细胞结合的平均剂量反应。
29.图2：通过facs测定的在600nm的igg浓度下，mab#1、mab#2、refmab#1和阴性同种型对照mor03207与人c5ar、食蟹猴c5ar和啮齿动物c5ar以及与c5ar相关的gpcr人c5l2、人c3ar、人fpr1和人chemr23的细胞结合。
30.图3：mab#1与在病毒样颗粒(vlp)上表达的人c5ar的两种天然变体以及小鼠c5ar的elisa结合。
31.图4：discoverx的
‑
β
‑
抑制蛋白检定。人c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集的中和。a在不存在或存在mab#1(50nm)、mab#2(50nm)和refmab#1(50nm)的情况下，重组人c5a浓度增加的对数剂量反应曲线。b在50nm的最终igg浓度下计算对三种增加浓度(分别为1.2nm、11nm和100nm)的人c5a的抑制百分比。
32.图5：在正常和病理生理学c5a浓度下人粒细胞中人c5a诱导的cd11b上调的抑制。a b cd11b全血检定中mab#1、mab#2和refmab#1的比较。显示了对数剂量抑制曲线。人粒细胞门控为靶细胞。作为定量读数，计算出达到cd11b上调50％抑制所需的igg浓度(ic
50
浓度)。x轴下方显示了每种igg的ic
50
浓度。a增加浓度的igg和15nm人c5a的对数剂量反应曲线。b增加浓度的igg和150nm人c5a的对数剂量反应曲线。
33.图6：在延长的孵育时间内测定的人粒细胞和单核细胞中人c5a诱导的cd11b上调的抑制。igg与靶细胞孵育20分钟或300分钟后，在cd11b全血检定中比较mab#1和refmab#1。将igg以连续稀释液添加，随后用15nm人c5a刺激孵育20分钟或300分钟。粒细胞(图6a和6b)或单核细胞(图6c和6d)门控为靶细胞。确定出cd11b水平。显示出对数剂量抑制曲线。数据表示为在15nm人c5a下cd11b上调的抑制百分比。mab#1的结果显示在图6a和6c中，而refmab#1的结果显示在图6b和6d中。
34.图7：人c5a诱导的人中性粒细胞迁移的抑制。在10nm人c5a存在下，分别在两种igg浓度(分别为100nm和600nm)下测试mab#1和阴性对照mor03207。显示出在3个不同时间点(15min、25min、35min)进行的三个独立检定的平均值。中性粒细胞得自3个不同的人供体。基于在不存在抗体的情况下中性粒细胞的迁移而计算抑制百分比。
35.图8：promega adcc和adcp报告基因生物检定。mab#1与带有野生型(非沉默)人igg1 fc区或与mab#1的fc区相同的变体(沉默)fc区的单克隆抗c5ar对照igg的比较。另外，包括具有变体或野生型人igg1 fc区的同种型对照抗体mor03207。按照供应商的说明书使用表达fcγriia_h以模拟adcp通路的工程化jurkat细胞，或者表达fcγriiia(v158高亲和力变体)以模拟adcc通路的jurkat细胞和表达c5ar的cho细胞进行检定。a 10μg/ml的igg浓度下adcp报告基因生物检定的结果。b 10μg/ml的igg浓度下adcc报告基因生物检定的结果。数据作为背景上的平均荧光信号提供。
36.图9：单次静脉内施用10mg/kg igg后，han wistar大鼠中mab#1的组平均药代动力学特征。数据提供为平均值(随时间变化的igg浓度)
±
标准差(s)(n＝3)。
37.图10：mab#1和mab#2的蛋白质组分析(3p)结果。与同种型阴性对照抗体mor03207的结合相比，每种抗体的数字代表获得的每种抗体和测试蛋白质的结合信号。分别以10nm和100nm的浓度测试抗体。
38.图11：源自单核细胞的体外成熟的m1和m2巨噬细胞的细胞因子释放。用mab#1处理并与c5a孵育过夜后，通过elisa测定il
‑
10和il
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12的水平。
具体实施方式
39.本公开涉及识别人c5ar的多种人抗体。
40.定义
41.术语“c5ar”是指被称为c5a过敏毒素趋化性受体1或cd88的蛋白质。
42.人c5ar(uniprot：p21730|1
‑
350)(在本文中称为“d/k变体”)具有以下氨基酸序列：
43.mdsfnyttpdyghyddkdtldlntpvdktsntlrvpdilalvifavvflvgvlgnalvvwvtafeakrtinaiwflnlavadflsclalpilftsivqhhhwpfggaacsilpslillnmyasilllatisadrfllvfkpiwcqnfrgaglawiacavawglallltipsflyrvvreeyfppkvlcgvdyshdkrreravaivrlvlgflwplltlticytfillrtwsrratrstktlkvvvavvasffifwlpyqvtgimmsflepssptflllkkldslcvsfayinccinpiiyvvagqgfqgrlrkslpsllrnvlteesvvresksftrstvdtmaqktqav(seq id no:1)。
44.描述了人c5ar的两个天然错义突变(http://www.uniprot.org/uniprot/p21730)：参考snp(refsnp)聚类报告：rs4467185(maf：0.03)和聚类报告：rs11880097(maf：0.03)。一个突变位于人c5ar的n端胞外区内(seq id no：1的2位)，导致d取代为n。
45.在其序列中包含两个天然错义突变的人c5ar蛋白(在本文中也称为“n/n变体”)具有以下氨基酸序列：
46.mnsfnyttpdyghyddkdtldlntpvdktsntlrvpdilalvifavvflvgvlgnalvvwvtafeakrtinaiwflnlavadflsclalpilftsivqhhhwpfggaacsilpslillnmyasilllatisadrfllvfkpiwcqnfrgaglawiacavawglallltipsflyrvvreeyfppkvlcgvdyshdkrreravaivrlvlgflwplltlticytfillrtwsrratrstktlkvvvavvasffifwlpyqvtgimmsflepssptflllnkldslcvsfayinccinpiiyvvagqgfqgrlrkslpsllrnvlteesvvresksftrstvdtmaqktqav(seq id no:2)。
47.食蟹猴(macaca fascicularis)c5ar具有以下氨基酸序列：
48.mdpfssttldyehydgknvldsdtpvdktsntlrvpdilalvvfavvflvgvlgnalvvwvtafevkrtinaiwflnlavadflsclalpilftsivqhhhwpfggtacrilpslillnmyasilllatisadrfllvfnpiwcqnfrgaglawiacavawglallltipsflyravrqeeyspkvlcgvdynndtrreravaivrlvlgflwplltlmicytflllrtwsrratrstktlkvvvavvasffifwlpyqvtgtmmsflrpssptylqlkkldslsisfayinccinpviyvvagqgfqgrlrkslpsllrnvlteesvvresksftrstvdtmtektqav(seq id no:3)。
49.小鼠(mus musculus)c5ar具有以下氨基酸序列：
50.mdpidnssfeinydhygtmapnipadgihlpkrqpgdvaaliiysvvflvgvpgnalvvwvtafearravnaiwflnlavadllsclalpvlfttvlnhnywyfdatacivlpslillnmyasilllatisadrfllvfkpiwcqkvrgtglawmacgvawvlallltipsfvyreaykdfysehtvcginygggsfpkekavailrlmvgfvlplltlnicytflllrtwsrkatrstktlkvvmavvicffifwlpyqvtgvmiawlppssptlkrveklnslcvslayinccvnpiiyvmagqgfhgrllrslpsiirnalsedsvgrdsktftpsttdtstrksqav(seq id no:4)。
51.大鼠(rattus norvegicus)c5ar具有以下氨基酸序列：
52.mdpisndsseitydysdgtpnpdmpadgvyipkmepgdiaaliiylavflvgvtgnalvvwvtafeakrtvnaiwflnlavadllsclalpilftsivkhnhwpfgdqacivlpslillnmyssilllatisadrfllvfkpiw
cqkfrrpglawmacgvtwvlallltipsfvfrrihkdpysdsilcnidyskgpffiekaiailrlmvgfvlplltlnicytfllirtwsrkatrstktlkvvmavvtcffvfwlpyqvtgvilawlprssstfqsverlnslcvslayinccvnpiiyvmagqgfhgrlrrslpsiirnvlsedslgrdsksftrstmdtstqksqav(seq id no:5)。
53.术语“c5a”是指被称为人补体成分c5a的蛋白质。
54.人c5a(uniprot：p01031|678
‑
751)具有以下氨基酸序列：
55.tlqkkieeiaakykhsvvkkccydgacvnndetceqraarislgprcikafteccvvasqlranishkdmqlgr(seq id no:6)。
56.术语“c5l2”是指被称为c5a过敏毒素趋化性受体2的蛋白质。
57.人c5l2具有以下氨基酸序列：
58.mgndsvsyeygdysdlsdrpvdcldgaclaidplrvaplplyaaiflvgvpgnamvawvagkvarrrvgatwllhlavadllcclslpilavpiargghwpygavgcralpsiilltmyasvlllaalsadlcflalgpawwstvqracgvqvacgaawtlallltvpsaiyrrlhqehfparlqcvvdyggssstenavtairflfgflgplvavaschsallcwaarrcrplgtaivvgffvcwapyhllglvltvaapnsallaralraeplivglalahsclnpmlflyfgraqlrrslpaachwalresqgqdesvdskkstshdlvsemev(seq id no:7)。
59.术语“c3ar”是指被称为c3a过敏毒素趋化性受体的蛋白质。
60.人c3ar具有以下氨基酸序列：
61.masfsaetnstdllsqpwneppvilsmvilsltfllglpgnglvlwvaglkmqrtvntiwflhltladllcclslpfslahlalqgqwpygrflcklipsiivlnmfasvflltaisldrclvvfkpiwcqnhrnvgmacsicgciwvvacvmcipvfvyreifttdnhnrcgykfglsssldypdfygdplenrslenivqppgemndrldpssfqtndhpwtvptvfqpqtfqrpsadslprgsarltsqnlysnvfkpadvvspkipsgfpiedhetspldnsdaflsthlklfpsassnsfyeselpqgfqdyynlgqftdddqvptplvaititrlvvgfllpsvimiacysfivfrmqrgrfaksqsktfrvavvvvavflvcwtpyhifgvlslltdpetplgktlmswdhvcialasanscfnpflyallgkdfrkkarqsiqgileaafseeltrsthcpsnnvisernsttv(seq id no:8)。
62.术语“fpr1”是指被称为fmet
‑
leu
‑
phe受体的蛋白质。
63.人fpr1具有以下氨基酸序列：
64.metnsslptnisggtpavsagylfldiitylvfavtfvlgvlgnglviwvagfrmthtvttisylnlavadfcftstlpffmvrkamgghwpfgwflckflftivdinlfgsvflialialdrcvcvlhpvwtqnhrtvslakkviigpwvmallltlpviirvttvpgktgtvactfnfspwtndpkerinvavamltvrgiirfiigfsapmsivavsygliatkihkqgliksspplrvlsfvaaafflcwspyqvvaliatvrirellqgmykeigiavdvtsalaffnsclnpmlyvfmgqdfrerlihalpasleraltedstqtsdtatnstlpsaevalqak(seq id no:9)。
65.术语“chemr23”是指被称为趋化因子样受体1的蛋白质。
66.人chemr23具有以下氨基酸序列：
67.mrmededyntsisygdeypdyldsivvledlsplearvtriflvvvysivcflgilgnglviiiatfkmkktvnmvwflnlavadflfnvflpihityaamdyhwvfgtamckisnfllihnmftsvflltiissdrcisvllpvwsqnhrsvrlaymacmviwvlafflsspslvfrdtanlhgkiscfnnfslstpgssswpthsqmdpvgysrhmvvtvtrflcgflvpvliitacyltivcklhrnrlaktkkpfkiivtiiitfflcwcpyhtlnllelhhtampgsvfslglplatalaianscmnpilyvfmgqdfkkfkvalfsrlvnalsedtghssypshrsftkmssmnertsmneretgml(seq id no:10)。
68.本文使用的术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条
轻(l)链的蛋白质，其与抗原相互作用。每条重链由重链可变区(本文中缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区能够进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl均由以如下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个cdr和四个fr组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼状抗体和嵌合抗体。抗体能够是任何同种型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。轻链和重链均分为结构和功能同源的区域。
69.本文使用的短语“抗体片段”是指抗体的保留与抗原特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定化空间分布)能力的一个或多个部分。结合片段的实例包括但不限于由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段fab片段；包含通过铰链区的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段f(ab)2片段；由vh和ch1结构域组成的fd片段；由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；由vh结构域组成的dab片段(ward等，(1989)nature 341:544
‑
546)；以及分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成接头将它们接合，该接头使得它们能够制成其中vl和vh区配对以形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等，(1988)science 242:423
‑
426；和huston等，(1988)proc.natl.acad.sci.85:5879
‑
5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语“抗体片段”之内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且以与针对完整抗体所使用的方式相同的方式就功用进行片段筛选。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、大型抗体(maxibody)、小型抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v
‑
nar和bis
‑
scfv(参见，例如，hollinger和hudson,(2005)nature biotechnology 23:1126
‑
1136)。能够将抗体片段移植到基于比如iii型纤连蛋白(fn3)的多肽的骨架中(参见描述纤连蛋白多肽单抗的美国专利第6,703,199号)。能够将抗体片段掺入包含一对串联fv片段(vh
‑
ch1
‑
vh
‑
ch1)的单链分子中，该对串联fv片段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合位点(zapata等,(1995)protein eng.8:1057
‑
1062；和美国专利第5,641,870号)。
70.本文使用的“人抗体”或“人抗体片段”是具有框架区和cdr区均来自人源序列的可变区的抗体和抗体片段。人抗体还可以从合成文库或从转基因小鼠(例如xenomouse)中分离，只要各系统产生具有框架区和cdr区均衍生自人源序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也衍生自这些序列。人源包括例如人种系序列或人种系序列的突变形式或包含源自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如knappik等,(2000)j mol biol 296:57
‑
86中所述。
71.可以使用众所周知的编号方案，例如kabat编号方案、chothia编号方案、或kabat和chothia的组合来定义免疫球蛋白可变结构域例如cdr的结构和位置，例如参见sequences of proteins of immunological interest,u.s.department of health and human services(1991),kabat等著；lazikani等,(1997)j.mol.bio.273:927
‑
948；kabat等,(1991)sequences of proteins of immunological interest,第5版,nih公开号91
‑
3242u.s.department of health and human services；chothia等,(1987)j.mol.biol.196:901
‑
917；chothia等,(1989)nature 342:877
‑
883；和al
‑
lazikani等,(1997)j.mol.biol.273:927
‑
948。
[0072]“人源化抗体”或“人源化抗体片段”在本文中定义为具有衍生自人源序列的恒定抗体区和可变抗体区或其部分，或者仅cdr衍生自另一物种的抗体分子。例如，人源化抗体可以是cdr移植的，其中可变结构域的cdr来自非人源，而可变结构域的一个或多个框架为人源，并且恒定结构域(如果有的话)为人源。
[0073]
术语“嵌合抗体”或“嵌合抗体片段”在本文中定义为具有衍生自或对应于一种物种中发现的序列的恒定抗体区和衍生自另一物种的可变抗体区的抗体分子。优选地，恒定抗体区衍生自或对应于在人中发现的序列，而可变抗体区(例如vh、vl、cdr或fr区)衍生自在非人动物例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠中发现的序列。
[0074]
术语“分离的抗体”是指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体或抗体片段的抗体或抗体片段。此外，分离的抗体或抗体片段可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。因此，在一些方面，提供的抗体是已从具有不同特异性的抗体中分离出来的分离的抗体。分离的抗体可以是单克隆抗体。分离的抗体可以是重组单克隆抗体。然而，与靶标的表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可以与其它相关抗原(例如来自其它物种(例如，物种同源物))交叉反应。
[0075]
本文使用的术语“重组抗体”包括通过自然界中不存在的方式制备、表达、产生或分离的所有抗体。例如，从被转化而表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，从重组的组合人抗体文库中选择和分离的抗体，以及通过涉及剪接全部或部分人免疫球蛋白基因、序列到其它dna序列的任何其它手段而制备、表达、产生或分离的抗体，从进行人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由此制备的杂交瘤分离的抗体。优选地，这些重组抗体具有框架和cdr区衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方式中，可以对这些重组人抗体进行体外诱变(或，当使用针对人ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，当衍生自人种系vh和vl序列以及与之相关时，重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是在体内人抗体种系库中可能不天然存在的序列。重组抗体可以是单克隆抗体。在一个实施方式中，本文公开的抗体和抗体片段分离自hucal文库(rothe等,j.mol.biol.(2008)376,1182
‑
1200)。
[0076]
如本文所用，如果抗体能够区分抗原例如人c5ar和一种或多种参考抗原，则该抗体与该抗原“特异性结合”、对该抗原“具有特异性”或“特异性识别”该抗原，因为结合特异性不是绝对性质，而是相对性质。例如，可以进行标准的elisa检定。可以通过标准显色(例如，具有辣根过氧化物的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过光密度(例如在450nm)进行评分。典型的背景(＝阴性反应)可以是0.1od；典型的阳性反应可能是1od。这意味着阳性/阴性差可以大于10倍。通常，结合特异性的测定不是通过使用单一参考抗原，而是通过使用一组约三到五个不相关的抗原，例如奶粉、bsa、转铁蛋白等来进行的。
[0077]
如本文所用，术语“亲和力”是指多肽与其靶标之间在单个位点相互作用的强度。在每个位点内，多肽的结合区通过弱的非共价力与其靶标在多个位点相互作用；相互作用越多，亲和力就越强。
[0078]
如本文所用，术语“k
d”是指离解常数，其得自k
off
与k
on
之比(即k
off
/k
on
)，并表示为摩尔浓度(m)。例如单克隆抗体的抗原结合部分的k
d
值可以使用本领域已确立的方法来确定。确定例如单克隆抗体的抗原结合部分的k
d
的方法是set(溶液平衡滴定)或使用生物传感器系统(例如系统)的表面等离子体共振。在本公开中，对c5ar具有特异性的抗体通常具有小于5
×
10
‑2m、小于10
‑2m、小于5
×
10
‑3m、小于10
‑3m、5
×
10
‑4m、小于10
‑4m、小于5
×
10
‑5m、小于10
‑5m、小于5
×
10
‑6m、小于10
‑6m、小于5
×
10
‑7m、小于10
‑7m、小于5
×
10
‑8m、小于10
‑8m、小于5
×
10
‑9m、小于10
‑9m、小于5
×
10
‑
10
m、小于10
‑
10
m、小于5
×
10
‑
11
m、小于10
‑
11
m、小于5
×
10
‑
12
m、小于10
‑
12
m、小于5
×
10
‑
13
m、小于10
‑
13
m、小于5
×
10
‑
14
m、小于10
‑
14
m、小于5
×
10
‑
15
m或小于10
‑
15
m或更低的解离速率常数(k
d
)(k
off
/k
on
)。
[0079]
术语“表位”包括被抗体或其抗体片段特异性识别或与分子相互作用的任何蛋白质区域。通常，表位是分子例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团，并且通常可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本领域技术人员将理解的，实际上抗体可以特异性结合的任何物质都可以是表位。
[0080]
本公开的“组合物”可以用于治疗或预防应用。因此，本公开包括药物组合物，其包含本文所公开的抗体或抗体片段以及其药学上可接受的载体或赋形剂。在相关方面，本公开提供了一种用于治疗癌症的方法。此类方法包含向有此需要的受试者施用有效量的包含本文所述的抗体或抗体片段的药物组合物的步骤。
[0081]
本公开提供了治疗方法，其包括将治疗有效量的本文公开的抗体或抗体片段施用给需要这种治疗的受试者。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”是指引起期望的生物学反应所需的c5ar抗体的量。根据本公开，治疗有效量是治疗和/或预防疾病所需的c5ar抗体的量。
[0082]“施用”或“给药”包括但不限于，通过可注射形式例如静脉内、肌内、真皮内或皮下路径或黏膜路径，例如，作为鼻喷雾或气溶胶用于吸入或作为可摄取溶液、胶囊或片剂的药物递送。优选地，给药是通过可注射形式。
[0083]
如本文所用，“治疗”或“处理”等是指试图改变被治疗受试者的疾病自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学的过程中进行。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、缓解或减轻疾病的状态、和缓解或预后改善。在一些实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
[0084]
术语“效应子功能”是指归因于抗体的fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的非限制性实例包括c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)；细胞表面受体(例如b细胞受体)下调；和b细胞活化。
[0085]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指细胞毒性的一种形式，其中结合到某些细胞毒性细胞(例如nk细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)上的抗体使这些细胞毒性效应细胞能够与带有抗原的靶细胞特异性结合，随后用细胞毒素杀死靶细胞。介导adcc的原代细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。
[0086]“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体通路
的活化通过补体系统的第一组分(c1q)与本公开的(适当亚类的)抗体的结合而开始，所述抗体与其同源抗原结合。
[0087]“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“adcp”是指通过吞噬细胞如巨噬细胞或树突状细胞的内化来消除抗体包被的靶细胞的机制。
[0088]“预防”是指降低了获得或发展疾病的风险(即，在可能暴露于致病试剂或在疾病发作之前易患疾病的受试者中，导致该疾病的至少一种临床症状不发生)。“预防”还指旨在防止疾病或其症状发作或延迟疾病或其症状发作的方法。
[0089]
在此上下文中使用的“受试者”或“物种”是指任何哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠或大鼠，以及灵长类动物，例如食蟹猴(macaca fascicularis)、恒河猴(macaca mulatta)或人(智人(homo sapiens))。优选地，受试者是灵长类动物，最优选地是人。
[0090]
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”，“具有”和“包含”以及它们各自的变型将被理解为暗示包括所陈述的元素或整数或元素或整数的组，但不排除任何其他元素或整数或元素或整数的组。
[0091]
本文所用的术语“工程化的”或“修饰的”包括通过合成方式(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的某种组合)对核酸或多肽的处理。优选地，对根据本公开的抗体或抗体片段进行工程化或修饰以改善一种或多种特性，例如抗原结合、稳定性、半衰期、效应子功能、免疫原性、安全性等。
[0092]
如本文所用，“变体”是指通过一种或多种修饰例如氨基酸取代、插入或缺失而与参考多肽不同的多肽。
[0093]
本文所用的术语“氨基酸突变”是指包括氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合，只要最终构建体具有所需的特征，例如与fc受体的结合减少。氨基酸序列的缺失和插入包括氨基酸残基的n
‑
和/或c
‑
端缺失和插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。氨基酸取代包括被非天然存在的氨基酸或被二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物替代。可以使用本领域众所周知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、pcr、基因合成等。预期通过基因工程以外的方法例如化学修饰改变氨基酸残基的侧链基团的方法也可以是有用的。本文可以使用各种名称来指示相同的氨基酸突变。例如，从fc区的327位的甘氨酸到丙氨酸的取代可以表示为237a、g337、g337a或gly329ala。
[0094]
如本文所用，术语“ec
50”是指抗体或抗体片段或配体在检定中诱导基线与最大值之间一半反应的浓度。因此，它代表观察到最大效果的50％的抗体或配体浓度。
[0095]
如本文所用，术语“ic
50”是指抗体或抗体片段在检定中抑制最大反应与基线之间一半反应的浓度。它代表将给定反应降低50％的抗体浓度。
[0096]
术语“抑制”或“减少”或“降低”或“中和”是指任何表型特征(例如结合或生物学活性或功能)的减小或停止或该特征的发生率、程度或可能性的减小或停止。“抑制”、“减少”或“中和”不需要完全，只要使用适当的检定可检测到即可。在一些实施方式中，“减少”或“降低”或“抑制”或“中和”是指引起减小20％以上的能力。在另一个实施方式中，“减少”或“降低”或“抑制”或“中和”是指引起减小50％以上的能力。在又一个实施方式中，“减少”或“降低”或“抑制”或“中和”是指引起总体减小75％、85％、90％、95％以上的能力。
[0097]
如本文所用，术语“拮抗性”抗体是指与抗原相互作用并且部分或完全抑制或中和
靶抗原的生物学活性或功能或任何其他表型特征的抗体或抗体片段。
[0098]“野生型”蛋白质是自然界中发现的蛋白质的一种形式或变体。野生型蛋白质的氨基酸序列，例如人igg1抗体的fc区，是蛋白质天然存在时的氨基酸序列。由于同种异型差异，野生型蛋白质可能有多于一种氨基酸序列。例如，存在几种天然存在的人igg1重链恒定区的同种异型(参见，例如，jeffries等(2009)mabs 1:1)。
[0099]“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c端区。免疫球蛋白的fc区通常包含两个恒定结构域，ch2结构域和ch3结构域。尽管igg重链fc区的边界可能略有变化，但通常将人igg重链fc区定义为从cys226或从pro230延伸至重链的c端。但是，fc区的c端赖氨酸(lys447)可能存在也可能不存在。除非本文另有说明，否则fc区中氨基酸残基的编号是根据kabat等,sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991中所述的eu编号系统，也称为eu索引。
[0100]
实施方式：
[0101]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0102]
a)包含seq id no：27的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：28的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：29的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0103]
b)包含seq id no：27的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：39的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：40的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0104]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0105]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区域，或
[0106]
b)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0107]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0108]
a)包含seq id no：30的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：31的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：29的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0109]
b)包含seq id no：30的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：41的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：40的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0110]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0111]
a)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0112]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0113]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0114]
a)包含seq id no：27的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：28的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：29的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0115]
b)包含seq id no：30的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：31的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：29的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0116]
c)包含seq id no：27的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：39的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：40的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0117]
d)包含seq id no：30的氨基酸序列的hcdr1区、包含seq id no：41的氨基酸序列的hcdr2区、包含seq id no：40的氨基酸序列的hcdr3区、包含seq id no：32的氨基酸序列的lcdr1区、包含seq id no：33的氨基酸序列的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0118]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0119]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0120]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0121]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0122]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0123]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0124]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，
其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0125]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0126]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0127]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其包含表1或表2中公开的任何一种抗体的由kabat定义的6个cdr。
[0128]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其包含表1或表2中公开的任何一种抗体的由chothia定义的6个cdr。
[0129]
在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。在本公开的另一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是igg同种型。在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是igg1类的。在本公开的另一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段在体外基本上不诱导效应子功能。
[0130]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0131]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，还包含seq id no：35的vh或seq id no：36的vl，或
[0132]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，还包含seq id no：35的vh或seq id no：36的vl，或
[0133]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，还包含seq id no：42的vh或seq id no：43的vl，或
[0134]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，还包含seq id no：42的vh或seq id no：43的vl。
[0135]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0136]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0137]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl。
[0138]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：35的vh和seq id no：36的vl。
[0139]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：42的vh和seq id no：43的vl。
[0140]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：37的hc和seq id no：38的lc。
[0141]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：44的hc和seq id no：45的lc。
[0142]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其包含表1或表2中公开的任何一种抗体的可变重链(vh)和可变轻链(vl)。
[0143]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其包含表1或表2中公开的任何一种抗体的重链(hc)和轻链(lc)。
[0144]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，并且还包含seq id no：35的vh或seq id no：36的vl。
[0145]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，并且还包含seq id no：42的vh或seq id no：43的vl。
[0146]
在一个实施方式中，本发明涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，并且还包含seq id no：35的vh或seq id no：36的vl。
[0147]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，并且还包含seq id no：42的vh或seq id no：43的vl。
[0148]
在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。在本公开的另一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。
[0149]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0150]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0151]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0152]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0153]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或与seq id no：35
的vh和与seq id no：36的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0154]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或与seq id no：42的vh和与seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0155]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含
[0156]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0157]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0158]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0159]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或与seq id no：37的hc和与seq id no：38的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0160]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或与seq id no：44的hc和与seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0161]
在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在本公开的一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。在本公开的另一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的或人源化的抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人抗体或抗体片段。
[0162]
在一个实施方式中，本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是重组或合成的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是分离的重组单克隆抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是分离的重组单克隆人抗体或抗体片段。
[0163]
在一个实施方式中，根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是igg同种型。在另一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是igg1类的。在另一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人igg1类的。
[0164]
核酸
[0165]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述分离的抗体或抗体片段包含
[0166]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0167]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、
seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0168]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0169]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0170]
在另一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的重链序列和轻链序列的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含
[0171]
a)seq id no：46的hcdr1区、seq id no：47的hcdr2区、seq id no：48的hcdr3区、seq id no：51的lcdr1区、seq id no：52的lcdr2区和seq id no：53的lcdr3区，或
[0172]
b)seq id no：49的hcdr1区、seq id no：50的hcdr2区、seq id no：48的hcdr3区、seq id no：51的lcdr1区、seq id no：52的lcdr2区和seq id no：53的lcdr3区，或
[0173]
c)seq id no：58的hcdr1区、seq id no：59的hcdr2区、seq id no：60的hcdr3区、seq id no：63的lcdr1区、seq id no：64的lcdr2区和seq id no：65的lcdr3区，或
[0174]
d)seq id no：61的hcdr1区、seq id no：62的hcdr2区、seq id no：60的hcdr3区、seq id no：63的lcdr1区、seq id no：64的lcdr2区和seq id no：65的lcdr3区。
[0175]
在另一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的重链序列和轻链序列的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含
[0176]
a)seq id no：70的hcdr1区、seq id no：71的hcdr2区、seq id no：72的hcdr3区、seq id no：75的lcdr1区、seq id no：76的lcdr2区和seq id no：77的lcdr3区，或
[0177]
b)seq id no：73的hcdr1区、seq id no：74的hcdr2区、seq id no：72的hcdr3区、seq id no：75的lcdr1区、seq id no：76的lcdr2区和seq id no：77的lcdr3区，或
[0178]
c)seq id no：82的hcdr1区、seq id no：83的hcdr2区、seq id no：84的hcdr3区、seq id no：87的lcdr1区、seq id no：88的lcdr2区和seq id no：89的lcdr3区，或
[0179]
d)seq id no：85的hcdr1区、seq id no：86的hcdr2区、seq id no：84的hcdr3区、seq id no：87的lcdr1区、seq id no：88的lcdr2区和seq id no：89的lcdr3区。
[0180]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：54的vh和seq id no：55的vl，或与seq id no：54的vh和/或seq id no：55的vl具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0181]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：66的vh和seq id no：67的vl，或与seq id no：66的vh和/或seq id no：67的vl具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0182]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：78的vh和seq id no：79的vl，或与seq id no：78的vh和/或seq id no：79的vl具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0183]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：90的vh和seq id no：91的vl，或与seq id no：90的vh和/或seq id no：91的vl具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0184]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：56的hc和seq id no：57的lc，或与seq id no：56的hc和/或seq id no：57的lc具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0185]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：68的hc和seq id no：69的lc，或与seq id no：68的hc和/或seq id no：69的lc具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0186]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：80的hc和seq id no：81的lc，或与seq id no：80的hc和/或seq id no：81的lc具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0187]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：92的hc和seq id no：93的lc，或与seq id no：92的hc和/或seq id no：93的lc具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0188]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：56的hc和seq id no：57的lc。
[0189]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：68的hc和seq id no：69的lc。
[0190]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：80的hc和seq id no：81的lc。
[0191]
在一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码本文公开的对人c5ar具有特异性的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含seq id no：92的hc和seq id no：93的lc。
[0192]
在另一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含表1或表2中公开的任何一种抗体的vh和vl。
[0193]
在一个实施方式中，本公开提供了对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其由表1或表2中公开的一个或多个核酸序列中的任何一者编码。
[0194]
在一个实施方式中，本公开提供了一种核酸组合物，其包含编码表1或表2中公开的任何一种分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0195]
在一个实施方式中，本公开提供了一种核酸组合物，其包含编码根据本公开的对人c5ar具有特异性的任何一种分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0196]
在另一个实施方式中，本公开涉及一种核酸组合物，其包含编码对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列包含表1或表2中公开的任何一种抗体或抗体片段的hc和lc。
[0197]
在一个实施方式中，所述核酸组合物和/或所述一个和/或多个核酸序列是分离的。
[0198]
载体
[0199]
在一个实施方式中，本公开提供一种载体组合物，其包括一个或多个包含核酸组合物的载体，所述核酸组合物包含编码根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0200]
在一个实施方式中，本公开提供一种载体组合物，其包括一个或多个包含核酸组合物的载体，所述核酸组合物包含编码表1或表2中公开的对人c5ar具有特异性的任何一种分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0201]
在一个实施方式中，本公开提供一种载体组合物，其包括一个或多个包含表1或表2中公开的一个或多个核酸序列的载体。
[0202]
在一个实施方式中，所述载体组合物和/或一个和/或多个载体是分离的。
[0203]
宿主细胞
[0204]
在一个实施方式中，本公开提供一种宿主细胞，其包含载体组合物，所述载体组合物包括一个或多个包含核酸组合物的载体，所述核酸组合物包含编码根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0205]
在一个实施方式中，本公开涉及一种宿主细胞，其包含载体组合物，所述载体组合物包括一个或多个包含核酸组合物的载体，所述核酸组合物包含编码表1或表2中公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列。
[0206]
在一个实施方式中，根据本公开的宿主细胞能够表达由载体组合物或核酸组合物编码的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段。
[0207]
在另一个实施方式中，宿主细胞是分离的宿主细胞。在另一个实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是人细胞。在另一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是cho细胞。在一个实施方式中，所述细胞是hek细胞。在另一个实施方式中，所述细胞是perc.6细胞。在一个实施方式中，所述细胞是hkb11细胞。
[0208]
技术人员将认识到，可以将编码本公开的抗体或抗体片段的重链和/或轻链的一个或多个核酸序列克隆到不同的载体或相同的载体中。
[0209]
可以通过本领域公知的方法将载体引入合适的宿主细胞，例如原核(例如细菌)或真核(例如酵母或哺乳动物)细胞中(参见例如，"current protocol in molecular biology",ausubel等(主编),greene publishing assoc.and john wiley interscience,new york,1989 and 1992)。许多克隆载体是本领域技术人员已知的，选择合适的克隆载体是选择的问题。可以将基因置于启动子、糖体结合位点(用于细菌表达)和任选的操纵子(在本文中统称为“控制”元件)的控制下，以使编码所需蛋白质的核酸序列在通过含有这种表达结构的载体转化的宿主细胞中转录成rna。编码序列可以包含或可以不包含信号肽或前
导序列。在宿主细胞中表达时，获得本公开的抗体或抗体片段。如本领域技术人员将知道的，这些步骤可以以不同的方式来实现。一般来说，此类步骤通常包括用编码抗体或抗体片段的核酸组合物或载体组合物或感染性颗粒转化或转染合适的宿主细胞。此外，此类步骤通常包括在适合于所述宿主细胞的增殖(繁殖，生长)的条件下培养所述宿主细胞，以及在适合于产生(表达，合成)所编码的抗体或抗体片段的条件下的培养步骤。通常在含有适合于细胞生长或诱导表达的成分的介质的存在下，完成在适于增殖或表达的条件下的宿主细胞的培养。特别地，实施方式中，用于产生本公开的抗体或抗体片段的方法还包括从宿主细胞或介质中分离和纯化产生的抗体或抗体片段的步骤。如果表达系统将蛋白质分泌到生长介质中，则可以直接从介质中纯化蛋白质。如果不分泌蛋白质，则将其从细胞裂解物中分离出来或从细胞膜级分中回收。合适的生长条件和恢复方法的选择在本领域技术范围内。然后，可以通过本领域技术人员已知的多种技术来纯化本公开的抗体或抗体片段。
[0210]
在一个实施方式中，本公开涉及产生表1或表2中公开的任何一种抗体的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的方法。在一个实施方式中，提供了产生根据本公开的分离的抗体或抗体片段的方法，其中所述方法包括：在适合于表达抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含载体组合物，所述载体组合物包括一个或多个包含核酸组合物的载体，所述核酸组合物包含编码根据本公开的抗体或抗体片段的一个或多个核酸序列；和从宿主细胞或宿主细胞培养基中分离抗体或抗体片段。如本文所述分离的抗体或抗体片段可以通过本领域已知的技术纯化，例如高效液相色谱(hplc)、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定抗体或抗体片段的条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是明显的。对于亲和色谱纯化，可以使用抗体或抗体片段结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于根据本公开的抗体或抗体片段的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白质a或蛋白质g的基质。抗体或抗体片段的纯度可以通过包括凝胶电泳、高压液相色谱等在内的各种公知的分析方法中的任一种来确定。
[0211]
特异性
[0212]
在一个实施方式中，本公开涉及表1或表2中公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段对人c5ar具有特异性。
[0213]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段对由seq id no：1和/或seq id no：2的氨基酸序列编码的人c5ar具有特异性。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段对包含seq id no：1和/或seq id no：2的氨基酸序列的多肽具有特异性。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段对由seq id no：1和/或seq id no：2的氨基酸序列组成的多肽具有特异性。
[0214]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段与人c5ar的胞外区特异性结合。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段与人c5ar的n端胞外区特异性结合。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段与人c5ar的n端胞外区特异性结合，其中所述n端胞外区包含seq id no：13的氨基酸序列。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段与包含seq id no：13的氨基酸序列的人c5ar的n端特异性结合。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段与包含seq id no：13的
id no：14的氨基酸序列的肽结合。
[0234]
在一个实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段与由seq id no：13和/或seq id no：14的氨基酸序列组成的肽结合。
[0235]
在一个实施方式中，所述对人c5ar和食蟹猴c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0236]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0237]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0238]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0239]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0240]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0241]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0242]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0243]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0244]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0245]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0246]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0247]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0248]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0249]
对c5ar肽的单价亲和力
[0250]
在进一步的实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段对包含seq id no：13的人c5ar肽具有k
d
为100nm以下，例如90nm以下、80nm以下、70nm以下、60nm以下、50nm以下、40nm以下、30nm以下、20nm以下、10nm以下、5nm或1nm以下的单价亲和力。
[0251]
在一个实施方式中，以igg形式确定所述单价亲和力。在某些实施方式中，所述单价亲和力通过如本文实施例4中所述的表面等离子体共振(spr)确定。
[0252]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0253]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0254]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0255]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0256]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0257]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0258]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0259]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0260]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0261]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0262]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0263]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0264]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0265]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0266]
对c5ar肽的表观亲和力(二价)
[0267]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对包含seq id no：13的人c5ar肽具有k
d
为1nm以下，例如0.5nm以下、0.4nm以下、0.3nm以下、0.2nm以下、0.1nm以下、90pm以下、80pm以下、70pm以下、60pm以下、50pm以下、40pm以下、30pm以下、20pm以下、10pm以下、5pm以下或1pm以下的表观亲和力。
[0268]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对包含seq id no：14的食蟹猴c5ar肽具有k
d
为300nm以下，例如250nm以下、200nm以下、150nm以下、100nm以下、90nm以下、80nm以下、70nm以下、60nm以下、50nm以下、40nm以下、30nm以下、20nm以下、10nm或1nm以下的表观亲和力。
[0269]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对包含seq id no：13的人c5ar肽具有k
d
为0.3nm以下的表观亲和力，对包含seq id no：14的食蟹猴c5ar肽具有k
d
为150nm以下的表观亲和力。
[0270]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对包含seq id no：13的人c5ar肽具有k
d
为0.05nm以下的表观亲和力，对包含seq id no：14的食蟹猴c5ar肽具有k
d
为80nm以下的表观亲和力。
[0271]
在某些实施方式中，所述表观亲和力以igg形式确定。在一个实施方式中，所述表观亲和力通过如本文实施例5中所述的生物膜层反射光干涉(bli)确定。
[0272]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0273]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0274]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、
seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0275]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0276]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0277]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0278]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0279]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0280]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0281]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0282]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0283]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0284]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0285]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0286]
对全长c5ar的表观亲和力(二价)
[0287]
在其他实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对人c5ar具有k
d
为10nm以下，例如5nm以下、4nm以下、3nm以下、2nm以下、1nm以下、0.5nm以下、0.4nm以下、0.3nm以下、0.2nm以下或0.1nm以下的表观亲和力。
[0288]
在实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对食蟹猴c5ar具有k
d
为10nm以下，例如9nm以下、8nm以下、7nm以下、6nm以下、5nm以下、4nm以下、3nm以下或1nm以下的表观亲和力。
[0289]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体对人c5ar具有k
d
为0.5nm以下的表观亲和力，对食蟹猴c5ar具有k
d
为5nm以下的表观亲和力。
[0290]
在一个实施方式中，所述人c5ar包含seq id no：1的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人c5ar包含seq id no：2的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述食蟹猴c5ar包含seq id no：3的氨基酸序列。
[0291]
在某些实施方式中，所述表观亲和力以igg形式确定。在实施方式中，所述人c5ar或食蟹猴c5ar在细胞上表达。在实施方式中，所述人c5ar或食蟹猴c5ar在表达全长人的工程化cho细胞上表达。在实施方式中，所述cho细胞是flp
‑
in cho细胞。
[0292]
在某些实施方式中，所述表观亲和力如本文实施例6中所述确定。
[0293]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0294]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0295]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0296]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0297]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0298]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0299]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0300]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0301]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0302]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0303]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0304]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0305]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0306]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0307]
对全长c5ar的表观ec
50
[0308]
在其他实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体以20nm以下、15nm以下、10nm以下、5nm以下、4nm以下、3nm以下、2nm以下、1nm以下、0.5nm以下、0.4nm以下、0.3nm以下、0.2nm以下或0.1nm以下的ec
50
浓度结合人c5ar。
[0309]
在实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体以20nm以下、10nm以下、9nm以下、8nm以下、7nm以下、6nm以下、5nm以下、4nm以下、3nm以下或1nm以下的ec
50
浓度结合食蟹猴c5ar。
[0310]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体以10nm以下k
d
的ec
50
浓度结合人c5ar和食蟹猴c5ar。
[0311]
在一个实施方式中，所述人c5ar包含seq id no：1的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述人c5ar包含seq id no：2的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述食蟹猴c5ar包含seq id no：3的氨基酸序列。
[0312]
在某些实施方式中，所述ec
50
浓度以igg形式确定。在实施方式中，所述人c5ar或食蟹猴c5ar在细胞上表达。在实施方式中，所述人c5ar或食蟹猴c5ar在表达全长人的工程化cho细胞上表达。在实施方式中，所述cho细胞是flp
‑
in cho细胞。在某些实施方式中，所述
人c5ar或食蟹猴c5ar在中性粒细胞上表达。在实施方式中，所述人c5ar在人中性粒细胞上表达。在实施方式中，所述食蟹猴c5ar在食蟹猴中性粒细胞上表达。在某些实施方式中，所述中性粒细胞来源于全血。在某些实施方式中，所述ec
50
浓度如本文实施例7中所述确定。
[0313]
在其他实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段基本上不与选自人c5l2、人chemr23、人fpr1和c3ar的c5ar相关抗原结合。在某些实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段在300nm的igg浓度下基本上不与选自人c5l2、人chemr23、人fpr1和c3ar的c5ar相关抗原结合。在一个实施方式中，所述结合如实施例7中所述确定。
[0314]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0315]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0316]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0317]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区，或
[0318]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0319]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0320]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0321]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0322]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0323]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0324]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0325]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0326]
与seq id no：37或seq id no：44的vh和与seq id no：38或seq id no：45的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0327]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0328]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以5nm以下，例如4nm以下、3nm以下、2nm以下、1nm以下或0.5nm以下的ec
50
浓度结合包含seq id no：1和/或seq id no：2的人c5ar。
[0329]
在某些实施方式中，所述人c5ar存在于病毒样颗粒上。在某些实施方式中，所述人c5ar表达为融合蛋白。在某些实施方式中，所述人c5ar与gag蛋白融合。在实施方式中，所述
融合蛋白包含表8中公开的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述结合如实施例8中所述通过elisa确定。
[0330]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0331]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0332]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0333]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0334]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0335]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0336]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0337]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0338]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0339]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0340]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0341]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0342]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0343]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0344]
功能性
‑
c5a诱导的c5ar活化
[0345]
大体上，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段可用于防止或抑制人c5ar与人c5a之间的相互作用，从而防止、抑制、中和或减少由c5ar介导的信号传导通路，且/或调节c5ar参与的生物学通路和机制。
[0346]
在一个实施方式中，本公开涉及对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段特异性地干扰c5ar介导的信号转导。
[0347]
在本公开的另一个实施方式中，对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段特异性地干扰c5a与在细胞上表达的c5ar的相互作用。在又一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段能够特异性地干扰c5a诱导的由c5ar介导的信号转导。
[0348]
用于检定c5ar特异性抗体的功能活性的方法可以利用结合检定，例如酶联免疫吸附检定(elisa)、放射免疫检定(ria)、荧光活化细胞分选(facs)和本领域众所周知的其他方法(参见hampton,r.等(1990；serological methods a laboratory manual,aps press,st paul,mn)和maddox,d.e.等(1983；j.exp.med.158:1211
‑
1216))。或者，检定可以测试本公开的分离的抗体或抗体片段在体内或体外由于与c5ar结合而引起生物学应答的能力。此
类检定在本文公开的实施例中描述。其他合适的检定是本领域技术人员已知的。
[0349]
在某些实施方式中，本公开的分离的抗体或抗体片段拮抗人c5ar活性。在一个实施方式中，分离的抗体或抗体片段中和人c5ar活性。在一个实施方式中，本公开的分离的抗体或抗体片段抑制人c5ar活性。在一个实施方式中，本公开的分离的抗体或抗体片段抑制人c5ar信号传导。在一个实施方式中，所述人c5ar活性或人c5ar信号传导是由c5a诱导的。在一个实施方式中，所述人c5ar活性或人c5ar信号传导是通过人c5a与人c5ar的相互作用诱导的。在一个实施方式中，所述c5ar活性或c5ar信号传导是通过人c5a与人c5ar的结合诱导的。在一个实施方式中，所述c5ar在细胞上表达。在一个实施方式中，所述人c5ar活性或人c5ar信号传导在体外和/或离体和/或体内被抑制。
[0350]
c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集
[0351]
如实施例14中所述，在β
‑
抑制蛋白募集检定中测试了根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制c5a诱导的c5ar活化的能力，并且揭示了与现有技术抗体refmab#1相比，两种抗体均是c5ar活性更强的拮抗剂，尤其是在高病理生理学c5a浓度下。
[0352]
因此，在本公开的一个实施方式中，对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制c5a诱导c5ar活性的能力。在一个实施方式中，所述c5a诱导的c5ar活性在如实施例14中所述的β
‑
抑制蛋白募集检定中确定。在一个实施方式中，所述c5a诱导的c5ar活性在体外确定。
[0353]
在一个这样的实施方式中，本公开提供对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中所述分离的抗体或抗体片段抑制人c5a诱导人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集的能力。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段抑制人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集。
[0354]
在本公开的另一个实施方式中，对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的人c5ar与β
‑
抑制蛋白的相互作用。在一个这样的实施方式中，使用β
‑
半乳糖苷酶片段互补来测量所述人c5a诱导的人c5ar与β
‑
抑制蛋白的相互作用和/或人c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集。在一个实施方式中，如实施例14中所述确定所述人c5a诱导的人c5ar与β
‑
抑制蛋白的相互作用和/或人c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集。在一个这样的实施方式中，在50nm的igg浓度下测试所述人c5a诱导的人c5ar与β
‑
抑制蛋白的相互作用和/或人c5a诱导的β
‑
抑制蛋白募集。
[0355]
根据本公开的分离的抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的人c5ar活性的能力，例如抑制人c5a诱导的人c5ar与β
‑
抑制蛋白的相互作用和/或人c5a诱导的人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集的能力可以通过生成增加浓度的人c5a和固定浓度的igg的剂量反应曲线并通过计算各自的ec
50
浓度来确定。
[0356]
在一个实施方式中，本公开提供对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，其中当与在不存在所述分离的抗体或抗体片段的情况下确定的ec
50
浓度相比时，所述分离的抗体或抗体片段将在β
‑
抑制蛋白募集检定中在50nm的igg浓度下确定的对人c5a的ec
50
浓度提高了至少5倍以上，例如至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍或至少13倍。
[0357]
在一个实施方式中，本公开提供对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段，
其中当与在不存在所述分离的抗体或抗体片段的情况下确定的ec
50
浓度相比时，所述分离的抗体或抗体片段将在β
‑
抑制蛋白募集检定中在50nm的igg浓度下确定的对人c5a的ec
50
浓度提高了约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍或约13倍。
[0358]
在一个实施方式中，本公开提供对人c5ar具有特异性的抗体或抗体片段，其中当与在不存在所述抗体或抗体片段的情况下的人c5a的浓度相比时，所述人c5a在β
‑
抑制蛋白募集检定中在50nm的igg浓度下需要以至少5倍以上、例如至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上、至少10倍以上、至少11倍以上、至少12倍以上或至少13倍以上的浓度存在以诱导相同的人c5ar活性。
[0359]
在一个实施方式中，所述β
‑
抑制蛋白募集检定如实施例14中所述进行。在一个实施方式中，所述β
‑
抑制蛋白募集检定在体外进行。
[0360]
或者，可以通过计算对不同的人c5a浓度的抑制百分比来确定根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制c5a诱导的c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集的能力。
[0361]
在一个这样的实施方式中，与在存在1.2nm或11nm人c5a而不存在根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的情况下人c5a诱导的人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集水平相比，在50nm的igg浓度和存在1.2nm或11nm人c5a的情况下，所述抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集的至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
[0362]
在一个这样的实施方式中，与在存在100nm人c5a而不存在根据本公开的对c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的情况下人c5a诱导的人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集水平相比，在50nm的igg浓度和存在1.2nm或11nm人c5a的情况下，所述抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的人c5ar介导的β
‑
抑制蛋白募集的至少25％，例如至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
[0363]
在一个实施方式中，所述β
‑
抑制蛋白募集检定如实施例14中所述进行。在一个实施方式中，所述β
‑
抑制蛋白募集检定在体外进行。
[0364]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0365]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0366]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0367]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0368]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和包含seq id no：34的氨基酸序列的lcdr3区。
[0369]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0370]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0371]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0372]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具
有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0373]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0374]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0375]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0376]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0377]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0378]
c5a诱导的cd11b表达上调
[0379]
作为人中性粒细胞和单核细胞的有效活化剂，c5a诱导这些细胞中细胞表面抗原cd11b的上调。因此，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制c5a诱导的粒细胞和/或单核细胞活化的能力可以通过确定这些细胞中的cd11b表达水平来评估。
[0380]
根据本公开的分离的抗体或抗体片段抑制粒细胞和/或单核细胞中cd11b表达的能力可以通过生成增加浓度的igg和固定浓度的人c5a的剂量反应曲线并计算各自的ic
50
浓度来确定。或者，可以通过计算不同igg浓度的cd11b表达的抑制百分比来确定根据本公开的分离的抗体或抗体片段抑制粒细胞和/或单核细胞c5a中cd11b表达的能力。
[0381]
在一个这样的实施方式中，在15nm人c5a的存在下，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段以30nm以下、25nm以下、20nm以下、15nm以下、10nm以下或5nm以下的ic
50
浓度抑制人粒细胞和/或人单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0382]
在另一个实施方式中，与在存在15nm人c5a而不存在根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的情况下的cd11b表达水平相比，所述抗体或抗体片段在存在15nm人c5a和600nm的igg浓度下将人粒细胞和/或人单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达抑制至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
[0383]
在又一个实施方式中，在150nm人c5a存在下，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段以150nm以下、125nm以下、100nm以下、90nm以下、80nm以下、70nm以下、60nm以下、50nm以下或40nm以下的ic
50
浓度抑制人粒细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0384]
在一个实施方式中，在150nm人c5a存在下，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段以42nm的ic
50
浓度抑制人粒细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0385]
在另一个实施方式中，与在存在150nm人c5a而不存在根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的情况下的cd11b表达水平相比，所述抗体或抗体片段在存在150nm人c5a和600nm的igg浓度下将人粒细胞中人c5a诱导的cd11b表达抑制至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少90％。
[0386]
在一个实施方式中，与在存在150nm人c5a而不存在根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段的情况下的cd11b表达水平相比，所述抗体或抗体片段在存在150nm人c5a和100nm的igg浓度下将人粒细胞中c5a诱导的cd11b表达抑制至少45％、至少50％、至少55％、至少60％或至少65％。
[0387]
在一个实施方式中，所述cd11b表达的确定如实施例15中所述进行。在一个实施方式中，所述cd11b表达的确定在体外和/或离体进行。
[0388]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0389]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0390]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0391]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0392]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0393]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0394]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0395]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0396]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0397]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0398]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0399]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0400]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0401]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0402]
此外，在延长的时间内进一步分析了根据本公开的分离的抗体或抗体片段对人c5a诱导的cd11b表达的抑制活性，这意味着在添加人c5a之前，将抗体与全血中存在的粒细胞和/或单核细胞预孵育不同长度的时间(例如300分钟vs.20分钟)。令人惊讶地，该实验表明，根据本公开的分离的抗体在更长的时间内，例如延长的孵育时间，是更有效的c5ar活性拮抗剂，尤其是与现有技术抗体refmab#1相比时。
[0403]
因此，根据本公开的分离的抗体或抗体片段在延长的时间内抑制粒细胞和/或单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达的能力可以在所述分离的抗体与所述粒细胞和/或单核细胞孵育不同的孵育时间后，通过生成增加浓度的igg和固定浓度的人c5a的剂量反应曲线并通过计算各自的ec
50
值来确定。
[0404]
如图6a和6c所示，与孵育20分钟后确定的剂量反应曲线相比，在孵育300分钟后，本公开的分离的抗体或抗体片段显示出所确定的剂量反应曲线向较低的igg浓度的明显移动。有趣的是，refmab#1没有显示出随时间增加的效能(参见图6b和6d)。
[0405]
因此，在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段在与所述细胞孵育延长的时间后，更有效地抑制人粒细胞和/或人单核细胞中c5a诱导的cd11b表达。
[0406]
在一个这样的实施方式中，当与20分钟孵育时间后确定的ic
50
浓度相比时，在延长的50分钟、100分钟、150分钟、200分钟、250分钟或300分钟孵育时间后，根据本公开的分离的抗体或抗体片段以至多1/2、至多1/4、至多1/5或至多1/6的ic
50
浓度抑制人粒细胞和/或人单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0407]
在一个这样的实施方式中，当与20分钟孵育时间后确定的ic
50
浓度相比时，在延长的300分钟孵育时间后，根据本公开的分离的抗体或抗体片段以约1/5的ic
50
浓度抑制人粒细胞和/或人单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0408]
在一个实施方式中，当与refmab#1的相应ic
50
浓度相比时，在延长的300分钟孵育时间后，根据本公开的分离的抗体或抗体片段以至多1/3、至多1/4、至多1/5、至多1/10、至多1/15或至多1/19的ic
50
浓度抑制人粒细胞和/或人单核细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0409]
在一个实施方式中，在与人粒细胞和/或人单核细胞孵育300分钟的延长时间后，根据本公开的分离的抗体或抗体片段以3nm以下、2.5nm以下、2nm以下、1.5nm以下或1nm以下的ic
50
浓度抑制所述细胞中人c5a诱导的cd11b表达。
[0410]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0411]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0412]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0413]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0414]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0415]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0416]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0417]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0418]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0419]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0420]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0421]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0422]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0423]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0424]
c5a诱导的中性粒细胞迁移
[0425]
在进一步的检定中，评估了根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段抑制人c5a诱导的人中性粒细胞迁移的能力，并表明mab#1在体外高效地抑制c5诱导
的中性粒细胞迁移。
[0426]
因此，在本公开的一个实施方式中，本公开的所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段在体外抑制人c5a诱导的人中性粒细胞的迁移。
[0427]
在另一个实施方式中，与在体外存在10nm人c5a而不存在所述分离的抗体或抗体片段的情况下的迁移水平相比，所述分离的抗体或抗体片段将人c5a诱导的人中性粒细胞迁移抑制至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％或至少80％。
[0428]
在一个实施方式中，在15分钟之后、25分钟之后和/或35分钟之后确定所述人中性粒细胞的迁移。在某些实施方式中，以100nm和/或600nm的igg浓度测试根据本公开的所述分离的抗体或抗体片段。
[0429]
在一个实施方式中，与存在10nm人c5a而不存在本公开的所述分离的抗体或抗体片段的情况下35分钟后的迁移水平相比，所述抗体或抗体片段在35分钟后和在100nm的igg浓度下将人c5a诱导的人中性粒细胞迁移抑制至少25％。
[0430]
在一个实施方式中，与存在10nm人c5a而不存在本公开的所述分离的抗体或抗体片段的情况下25分钟后的迁移水平相比，所述抗体或抗体片段在25分钟后和在100nm和/或600nm的igg浓度下将人c5a诱导的人中性粒细胞的迁移抑制至少60％。
[0431]
在一个实施方式中，与存在10nm人c5a而不存在本公开的所述分离的抗体或抗体片段的情况下35分钟后的迁移水平相比，所述抗体在35分钟后和在600nm的igg浓度下将人c5a诱导的人中性粒细胞的迁移抑制至少40％。
[0432]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0433]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0434]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0435]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0436]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0437]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0438]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0439]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0440]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0441]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0442]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0443]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0444]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0445]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆
抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0446]
效应子功能
[0447]
免疫球蛋白的fc区通常赋予抗体有利的药代动力学特性，例如延长的血清半衰期，并赋予通过与细胞上表达的fc受体结合而诱导效应子功能的能力。另一方面，与fc受体的结合也可能导致某些细胞表面受体的不希望的活化，从而在全身性给药时造成不希望的细胞因子释放和严重的副作用。
[0448]
因此，对于某些治疗情况，希望减少或消除抗体的野生型fc区(例如野生型igg fc区)与一种或多种或所有fc受体的正常结合和/或与补体成分例如c1q的结合，以减少或消除抗体诱导效应子功能的能力。例如，可能希望减少或消除抗体的fc区与一种或多种或所有fcγ受体，例如fcγrl、fcγriia、fcγriib、fcγriiia的结合。
[0449]
效应子功能可包括但不限于以下一种或多种：补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、与nk细胞结合、与巨噬细胞结合、与单核细胞结合、与多形核细胞结合、直接信号传导诱导凋亡、靶标结合抗体的交联、树突状细胞成熟或t细胞引发(priming)。
[0450]
fc区与fc受体和/或与c1q的结合的减少或消除通常是通过使野生型fc区，例如igg1 fc区，更特别是人igg1 fc区突变，从而导致所述野生型fc区的变体或工程化的fc区，例如变体人igg1 fc区来实现的。导致结合减少的取代可以是有用的。为了减少或消除fc区与fc受体的结合特性，优选非保守的氨基酸取代，即，将一种氨基酸取代为具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸。
[0451]
因此，在一个实施方式中，与野生型fc区相比，根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含与fc受体和/或与c1q结合减少或消除的变体fc区。在一个这样的实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含减少或消除抗体诱导效应子功能的能力的变体fc区。在另一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段基本上不诱导效应子功能。
[0452]
在某些实施方式中，效应子功能是选自cdc、adcc和adcp中的一种或多种。在一个实施方式中，效应子功能是adcc。在一个实施方式中，效应子功能是cdc。在一个实施方式中，效应子功能是adcp。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段基本上不诱导adcc和/或cdc和/或adcp。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段在体外不诱导adcc或adcp。
[0453]
在一个实施方式中，当与野生型fc区相比时，根据本公开的分离的抗体或抗体片段的变体fc区包含一个或多个减少或消除该变体fc区与一种或多种fc受体和/或与c1q结合的氨基酸取代。在一个实施方式中，当与野生型fc区相比时，根据本公开的分离的抗体或抗体片段的变体fc区包含一个或多个减少或消除抗体诱导效应子功能的能力的氨基酸取代。
[0454]
在一个具体的实施方式中，当与野生型fc区相比时，该一个或多个氨基酸取代可将变体fc区对一种或多种fc受体和/或与c1q的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、至少10
倍、至少20倍或甚至至少50倍。在另外可选的实施方式中，当与野生型fc区相比时，该一个或多个氨基酸取代可将根据本公开的分离的抗体或抗体片段诱导效应子功能的能力降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。
[0455]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段的变体fc区基本上不结合一种或多种fc受体和/或c1q。在一个实施方式中，根据本公开的抗体的变体fc区确实基本上消除了所述抗体诱导效应子功能的能力。在一个实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段基本上不诱导效应子功能。在一个实施方式中，所述效应子功能是adcc和/或adcp和/或cdc。在一个实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段基本上不诱导效应子功能，这意味着诱导的效应子功能的水平不显著高于如在不存在所述抗体的情况下所测量的背景。
[0456]
在一个实施方式中，fc受体是人fc受体。在一个实施方式中，fc受体是fcγ受体。在一个实施方式中，fc受体是人fcγriiia、fcγri、fcγriia和/或fcγriib。
[0457]
在一个实施方式中，效应子功能是选自cdc、adcc和adcp中的一种或多种。在一个具体的实施方式中，效应子功能是adcc、cdc和adcp。在一个更具体的实施方式中，效应子功能是adcc和adcp。
[0458]
在一个实施方式中，野生型fc区是igg1 fc区。在一个实施方式中，野生型fc区是人igg1 fc区。在一个实施方式中，野生型fc区是人igg1 fc区。在一个实施方式中，野生型fc区是包含以下氨基酸序列的人igg1 fc区：
[0459]
pellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:11)。
[0460]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含变体人igg1 fc区，与野生型人igg1 fc区相比，其包含一个或多个氨基酸取代。在一个实施方式中，当与野生型fc区相比时，该一个或多个氨基酸取代减少或消除了变体fc区与fc受体和/或与c1q的结合且/或减少了所述抗体诱导效应子功能的能力。
[0461]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，根据本公开的抗体或抗体片段的变体人igg1 fc区在选自根据eu索引编号的234、235、237、330和331中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
[0462]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，所述变体人igg1 fc区在选自根据eu索引编号的l234、l235和g237中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
[0463]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区在选自根据eu索引编号的l234a、l235e、g237a中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
[0464]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a和l235e。
[0465]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e和g237a。
[0466]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，
变体人igg1 fc区在选自根据eu索引编号的a330和p331中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
[0467]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区在选自根据eu索引编号的a330s和p331s中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
[0468]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区包含根据eu索引编号的氨基酸取代a330s和p331s。
[0469]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，变体人igg1 fc区包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0470]
在一个实施方式中，根据本公开的抗体或抗体片段包含变体人igg1 fc区，与包含seq id no：11的序列的野生型人igg1 fc区相比，其包含一个或多个氨基酸取代，该取代减少或消除了变体fc区与一种或多种fc受体和/或与c1q的结合亲和力且/或降低了所述抗体诱导效应子功能的能力，其中该一个或多个氨基酸取代为根据eu索引编号的l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0471]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段是人igg1类的。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段是变体人igg1类的。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段在体外基本上不诱导效应子功能。在一个实施方式中，变体人igg1 fc区基本上不结合一种或多种fc受体和/或c1q。在一个这样的实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含选自以下根据eu索引编号的氨基酸取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0472]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段是人igg1类的，其包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0473]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0474]
在一个实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型igg1 fc区相比，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。
[0475]
在一个这样的实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s，且在体外基本不诱导效应子功能。在一个实施方式中，效应子功能是选自cdc、adcc和adcp中的一种或多种。
[0476]
在一个这样的实施方式中，与包含seq id no：11的氨基酸序列的野生型人igg1 fc区相比，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含根据eu索引编号的氨基酸取代l234a、l235e、g237a、a330s和p331s，并且在体外基本上不结合一种或多种fc受体和/或c1q。
[0477]
在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段是人igg1类的。在一个实施方式中，本公开的分离的抗体或抗体片段在体外基本上不诱导效应子功能。在一个实施方式中，根据本公开的分离的抗体或抗体片段包含选自根据eu索引编号的l234a、l235e、g237a、a330s和p331s中的一个或多个氨基酸取代。
[0478]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0479]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0480]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0481]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0482]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0483]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0484]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0485]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0486]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0487]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0488]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0489]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0490]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0491]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0492]
可以容易地确定抗体经由其fc区与fc受体的结合，例如，通过elisa，或通过使用标准仪器例如仪器(ge healthcare)的表面等离子体共振(spr)，并且可以通过重组表达获得fc受体。或者，可以使用已知表达特定fc受体的细胞系，例如表达fcγiiia受体的nk细胞，来评估fc区的结合亲和力。抗体的效应子功能可以通过本领域已知的方法来测量。评估感兴趣分子的adcc活性的合适的体外检定例如在wo2012130831中描述。用于此类检定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。或者，或另外地，可以在体内例如在clynes等,proc natl acad sci usa 95,652
‑
656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性。为了评估补体活化，可以进行cdc检定(参见，例如gazzano
‑
santoro等,j immunol methods 202,163(1996)；cragg等,blood 101,1045
‑
1052(2003)；以及cragg和glennie,blood 103,2738
‑
2743(2004))。可以进行c1q结合检定(例如elisa)以确定抗体是否能够结合c1q并因此具有cdc活性(参见，例如wo 2006/029879)。本文实施例10
‑
13中描述了评估与fc受体结合或评估免疫效应子功能的体外方法。
[0493]
融合蛋白
[0494]
根据本公开的分离的抗体或抗体片段可以或可以不与一个或多个其他氨基酸残基、多肽或部分融合。这样的融合蛋白可以以任何合适的方式制备，包括遗传或化学方法。所述连接的部分可包含分泌或前导序列，有助于检测、表达、分离或纯化的序列，或例如在重组生成期间赋予提高的蛋白质稳定性的序列。可能部分的非限制性实例包括β
‑
半乳糖苷
酶、谷胱甘肽
‑
s
‑
转移酶、萤光素酶、t7聚合酶片段、分泌信号肽、抗体或抗体片段、毒素、报告酶、能够像聚组氨酸标签一样结合金属离子的部分、适合检测和/或纯化的标签、同型或异型缔合(homo
‑
or hetero
‑
association)结构域、增加蛋白质溶解度的部分或包含酶促切割位点的部分。
[0495]
因此，根据本公开的分离的抗体或抗体片段可以任选地包含一个或多个用于结合其他感兴趣的靶标或靶标蛋白质的部分。应当清楚的是，这些另外的部分可以或可以不为抗体提供进一步的功能性，并且可以或可以不改变根据本公开的分离的抗体或抗体片段的特性。
[0496]
诊断用途
[0497]
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段在疾病诊断中的用途。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的抗体或抗体片段在检测c5ar、特别是人c5ar和/或食蟹猴c5ar中的用途。在一个实施方式中，本公开提供了一种用于检测受试者或样品中的c5ar的方法，其包括使所述受试者或样品与本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段接触的步骤。在一个实施方式中，本公开提供了一种用于诊断受试者中的疾病的方法，其包括使所述受试者或样品与根据本公开的分离的抗体或抗体片段接触的步骤。
[0498]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0499]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0500]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0501]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0502]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0503]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0504]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0505]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0506]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0507]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0508]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0509]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0510]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0511]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0512]
治疗方法
[0513]
根据本公开的分离的抗体或抗体片段可以用于治疗方法。根据本公开的抗体或抗体片段可以用于治疗疾病，例如癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病。
[0514]
在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗疾病的方法。
[0515]
在一个实施方式中，本公开提供了用于治疗疾病的根据本公开的分离的抗体或抗体片段。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段用于治疗疾病。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段用于在有需要的受试者中治疗疾病。
[0516]
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段在药物制备中的用途。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段用作药物。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段用于医药。在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的分离的抗体或抗体片段用作用于治疗有需要的受试者的药物。
[0517]
在一个实施方式中，疾病与不期望的c5ar、特别是人c5ar的存在有关。在一个实施方式中，疾病与不期望的c5a、特别是人c5a的存在有关。
[0518]
在一个实施方式中，待治疗的疾病是增殖性疾病。在一个具体的实施方式中，疾病是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血液癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、黑素瘤、肾细胞癌和肾癌。
[0519]
在一个实施方式中，待治疗的疾病是自身免疫性或炎性疾病。自身免疫性或炎性疾病的非限制性例子包括类风湿关节炎(ra)、银屑病、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮(sle)、狼疮肾炎、i型糖尿病、格雷夫病、炎性肠病(ibd)、克罗恩病(cd)、溃疡性结肠炎(uc)、肠易激综合征、多发性硬化症(ms)、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病(copd)、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、全身性硬化症、骨关节炎、特应性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、干燥综合征、自身免疫性肾炎、古德帕斯彻氏综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、anca相关性血管炎、葡萄膜炎、硬皮病、大疱性类天疱疮、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病、囊性纤维化、痛风、年龄相关性黄斑变性、过敏、哮喘、抗磷脂综合征(aps)、动脉粥样硬化、c3肾小球病和iga肾病、缺血/再灌注损伤、腹膜炎、败血症和其他作为急性或慢性炎症结果的自身免疫性疾病。
[0520]
在一个实施方式中，本公开提供了根据本公开的对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段用于治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的根据本公开的抗体或抗体片段。
[0521]
在一个实施方式中，该方法还包括向受试者施用治疗有效量的至少一种其他治疗剂。需要治疗的受试者通常是哺乳动物，更具体地是人。为了用于治疗方法，以与较好医学实践一致的方式配制、给药和施用根据本公开的分离的抗体或抗体片段。
[0522]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0523]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0524]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、
seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0525]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0526]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0527]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0528]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0529]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0530]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0531]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0532]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0533]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0534]
与seq id no：37或seq id no：44的hc和与seq id no：38或seq id no：45的lc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0535]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0536]
药物组合物
[0537]
在一个实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含根据本公开的分离的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体或赋形剂。
[0538]
药物组合物还可以包含至少一种其他药学活性化合物。根据本公开的药物组合物可以用于诊断、预防和/或治疗与不期望的c5ar、特别是人c5ar的存在相关的疾病。特别地，本公开提供了包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物，其适合于在哺乳动物、更特别地在人中的预防、治疗和/或诊断用途。
[0539]
通常，可以将根据本公开的抗体或抗体片段配制成药物组合物，其包含至少一种根据本公开的抗体或抗体片段和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选地一种或多种其他药学活性化合物。这样的制剂可以适合于口服、肠胃外、局部给药或通过吸入给药。因此，包含至少一种根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物可以肠胃外施用，例如静脉内、肌内或皮下施用。或者，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径例如经口服或局部施用。在一个优选的实施方式中，包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物通过静脉内或皮下施用。
[0540]
特别地，根据本公开的抗体或抗体片段可以与一种或多种药学活性化合物组合使用，所述药学活性化合物用于或可以用于预防和/或治疗涉及感兴趣的靶抗原的疾病，因此可能会或可能不会获得协同效果。这种化合物的实例，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生将是清楚的。
[0541]
在一个实施方式中，本公开提供了包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物，用于预防和/或治疗与不期望的c5ar存在相关的疾病。在一个实施方式中，本公开提供
了包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物用作药物。在一个实施方式中，本公开提供了包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物用于预防和/或治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病和/或癌症。
[0542]
在一个实施方式中，本公开提供了使用包含根据本公开的抗体或抗体片段的药物组合物在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病和/或癌症的方法。
[0543]
还提供了一种以适合于体内施用的形式产生根据本公开的抗体或抗体片段的方法，该方法包括(a)通过根据本公开的方法获得抗体或抗体片段，和(b)将所述抗体或抗体片段与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制，从而配制抗体或抗体片段的制剂以用于体内给药。根据本公开的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种根据本公开的抗体或抗体片段，其溶解在药学上可接受的载体或赋形剂中。
[0544]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0545]
a)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：28的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0546]
b)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：31的hcdr2区、seq id no：29的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0547]
c)seq id no：27的hcdr1区、seq id no：39的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区，或
[0548]
d)seq id no：30的hcdr1区、seq id no：41的hcdr2区、seq id no：40的hcdr3区、seq id no：32的lcdr1区、seq id no：33的lcdr2区和seq id no：34的lcdr3区。
[0549]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0550]
a)seq id no：35的vh和seq id no：36的vl，或
[0551]
b)seq id no：42的vh和seq id no：43的vl，或
[0552]
与seq id no：35或seq id no：42的vh和与seq id no：36或seq id no：43的vl具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的vh和vl。
[0553]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段包含
[0554]
a)seq id no：37的hc和seq id no：38的lc，或
[0555]
b)seq id no：44的hc和seq id no：45的lc，或
[0556]
与seq id no：37或seq id no：44的vh和与seq id no：38或seq id no：45的vc具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的hc和lc。
[0557]
在一个实施方式中，所述对人c5ar具有特异性的分离的抗体或抗体片段是单克隆抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是重组抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述分离的抗体或抗体片段是人的、人源化的或嵌合的抗体或抗体片段。
[0558]
抗体序列
[0559]
表1：mab#1的抗体序列
[0560]
[0561]
[0562]
[0563]
[0564]
[0565]
[0566][0567]
表2：mab#2的抗体序列
[0568]
[0569]
[0570]
[0571]
[0572]
[0573][0574]
表3：refmab#1的抗体序列
[0575][0576]
工作实施例
[0577]
实施例1：抗原产生和质量控制
[0578]
从公开可得来源(例如uniprot)检索各种物种的c5ar和与c5ar相关的gpcr的氨基酸序列，进行验证并在内部自行制备或由外部服务供应商制备。
[0579]
合成肽
[0580]
作为用于最初淘选和筛选的抗原，使用覆盖人c5ar的n端胞外区域的线性肽。用生
物素标签(jpt)化学合成这些肽，rp
‑
hplc纯化，并作为冻干材料配送。将冻干的肽储存在
‑
80℃。或者，将肽与转铁蛋白或牛血清白蛋白(bsa)结合。
[0581]
表4：用于最初淘选和筛选的n端人c5ar肽的氨基酸序列。
[0582][0583]
作为用于以后的结合研究的抗原，使用了包含人和食蟹猴c5ar的n端区的线性肽。用生物素标签(genscript)化学合成这些肽，rp
‑
hplc纯化，并作为冻干材料配送。将冻干的肽储存在
‑
80℃。为了重构，将肽溶解在所需体积的pbs中并储存在
‑
80℃。
[0584]
表5：用于结合研究的n端c5ar肽的氨基酸序列。
[0585][0586]
重组蛋白
[0587]
c1q蛋白
[0588]
从合并的正常人血浆中纯化的c1q蛋白购自complement technology,inc.(catalog#a099)。
[0589]
人c5a蛋白
[0590]
重组人c5a购自r&d systems(cat#：2037
‑
c5)或在内部自行制备。
[0591]
为了进行内部自行制备，将编码人c5a氨基酸(uniprot：p01031|lys679
‑
arg751)的dna克隆到pet21a表达载体(novagen)中具有n端ompa信号序列，随后是编码麦芽糖结合蛋白(mbp)的序列、fxa切割位点和gs接头的框内。
[0592]
人c5a(hc5a)在大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)细胞(novagen)中表达为n端标记的麦芽糖结合蛋白(mbp)
‑
融合蛋白。通过加入iptg并将培养物进一步培养20
‑
23小时而诱导蛋白质表达。通过离心收集细胞，将沉淀重悬于裂解缓冲液(pbs缓冲液加2mm mgcl2、20u/ml benzonase(roche)和1片/50ml complete(不含edta的蛋白酶抑制剂混合片(roche)))中。通过化学裂解或高压匀化破坏细胞。将得到的悬浮液离心，并将上清液无菌过滤以用于进一步的纯化步骤。
[0593]
hc5a
‑
mbp
‑
融合蛋白使用mbp
‑
trap柱(ge
‑
healthcare)通过糊精
‑
琼脂糖亲和色谱加以纯化，并任选地使用hi
‑
trap sp ff柱(ge lifesciences)通过阳离子交换色谱进行精纯(polished)。纯化的mbp
‑
融合物通过pd10柱(ge healthcare)将缓冲液交换为fxa消化缓冲液(20mm tris/hcl ph 8.0；100mm nacl；2mm cacl2)。通过添加因子xa(1：100(w/w))并在旋转振荡器中于室温下孵育o/n，从麦芽糖结合蛋白中释放出hc5a蛋白。使用hi
‑
trap sp ff柱(ge lifesciences)通过阳离子交换色谱纯化释放的hc5a。所有亲和色谱步骤均使用avant 25制备色谱系统进行。
[0594]
使用pd 10柱(ge healthcare)将缓冲液交换为pbs。将样品无菌过滤，并通过紫外分光光度法测定hc5a浓度。在变性、还原或非还原sds
‑
page、sec
‑
hplc和质谱中分析样品的纯度和完整性。
[0595]
fcγ受体(fcγr)和fcrn受体
[0596]
将编码人fcγri、人fcγriia(131h)、人fcγriia(131r)、人fcγriib、人fcγriiia(158f)和人fcγriiia(158v)的胞外区的dna克隆到pmax表达载体中具有n端vκ前导序列和c端6x his
‑
标签的框内，该载体是基于pcdna3.1(thermo fisher)的修饰表达载体。
[0597]
将编码人、食蟹猴、小鼠或大鼠fcrn大亚基p51的胞外区的dna克隆到pmax表达载体中具有n端vκ前导序列和c端avi
‑
6xhis
‑
标签的框内，该载体是基于pcdna3.1(thermo fisher)的修饰表达载体。此外，将编码人、食蟹猴、小鼠或大鼠fcrn小亚基p14(＝与β
‑
2微球蛋白相同)蛋白的dna克隆到第二开放阅读框中具有n端vk前导序列的框内。所制备的受体的氨基酸序列总结于表6和7中。
[0598]
hek293
‑
6e细胞系由加拿大国家研究委员会(nrc)开发。将细胞在37℃和6％co2的潮湿co2培养箱中保持在freestyle f17培养基(thermo scientific)中。hkb11(亲本克隆：美国专利6,136599。j.biomed.sci.2002；9:631
‑
638)是由hek293人胚胎肾和2b8伯基特淋巴瘤细胞融合产生的人杂交细胞系。将hkb11#52细胞在37℃和6％co2的潮湿co2培养箱中保持在含有1％fcs的mac1.0培养基中。
[0599]
接种后一天，使用市售的转染试剂，根据制造商的说明书，对hkb11#52或hek293
‑
6e细胞进行瞬时转染。将细胞培养3天，并通过离心然后无菌过滤(0.22μm)收集条件化细胞培养上清液。通过转染细胞，然后用800μg/ml g418(thermo scientific)进行筛选，可生成稳定转染的hkb11#52库。接种后4天，从稳定库中进行抗原表达。通过离心然后无菌过滤(0.22μm)收集条件化细胞培养上清液。
[0600]
通过imac使用protino ni
‑
nta柱(macherey
‑
nagel)纯化各蛋白质。所有色谱步骤均使用色谱系统(ge healthcare)进行。使用pd10柱(ge healthcare)将样品缓冲液交换为d
‑
pbs。在某些情况下，使用superdex 200柱(ge healthcare)在d
‑
pbs中进行精纯制备性sec步骤。
[0601]
fcrn异二聚体的生物素化是通过使用bira kit(avidity)的体外生物素化，然后使用superdex 200柱(ge healthcare)的制备性sec而进行的。
[0602]
通过变性、还原或非还原sds
‑
page、链霉亲和素移位检定(streptavidin
‑
shift assay)、hp
‑
sec和dls分析样品的质量。
[0603]
表6：所制备的fcrn蛋白的氨基酸序列。
[0604][0605]
表7：所制备的人fcγr蛋白的氨基酸序列。
[0606][0607]
病毒样颗粒(vlp)
[0608]
如wo 2015/193143中所述，在内部自行产生稳定表达人c5ar的两个天然变体之一(d/k变体或n/n变体)以及小鼠c5ar的vlp。所有克隆实验均使用标准技术进行。将感兴趣抗原克隆到合适的双载体系统中以在哺乳动物细胞中表达。在该系统中，一载体表达gag，另一载体表达gpcr
‑
gag融合蛋白。这些载体中的表达处于cmv启动子的控制下。随后，用双载体转染宿主细胞。产生的构建体以融合蛋白的形式产生，其中感兴趣抗原在n端与gag蛋白(hv1b1(uni
‑
prot id：p03347))融合。在悬浮培养中在标准条件下进行蛋白质的表达和vlp的制备。本实验中使用的宿主细胞是hkb11细胞(atcc；crl
‑
12568)和hek细胞(life technologies)。转染后三天，使用标准程序(包括沉淀和离子交换色谱)收集并纯化含有vlp的上清液。分离出的蛋白质进行sds
‑
page色谱。用商业抗gag抗体或商业抗c5ar抗体检测上清液，并显示gag和gpcr
‑
gag融合蛋白的共表达导致vlp中gag和gpcr
‑
gag的高表达水平。这证实了c5ar抗原被高效地整合到vlp中，并且c5ar抗原可用抗体检测。制备的融合蛋
白的氨基酸序列总结在表8中。
[0609]
表8：在病毒样颗粒上表达的c5ar
‑
gag融合蛋白的蛋白序列。
[0610]
[0611][0612]
细胞系
[0613]
产生稳定表达全长人c5ar、食蟹猴c5ar、小鼠c5ar、大鼠c5ar和与c5ar相关的gpcr人c5l2、人c3ar、人fpr1和人chemr23的cho flp
‑
in细胞。为了产生flp
‑
in cho细胞，在内部自行基因合成各种载体构建体，并根据指导手册(thermofischer/invitrogen)进行细胞转染。所有构建体均包含n端v5/his标签。使用市售的抗his(例如dianova cat#dia
‑
910)或抗v5(例如abd serotec cat#mca2285ga)检测抗体来确认各gpcr在细胞系表面的表达，即使不存在市售的特异性抗gpcr工具抗体。
[0614]
实施例2：从hucal文库中产生人c5ar特异性抗体
[0615]
为了产生抗体，使用hucal 文库来选择对人c5ar具有特异性的抗体。
hucal 文库是基于hucal概念的噬菌粒文库(knappik等,(2000)j mol biol 296:57
‑
86)，并采用技术在噬菌体表面展示fab(lohning等,wo2001/05950)。
[0616]
为了识别人c5ar特异性抗体，使用人和食蟹猴c5ar抗原材料进行淘选策略以选择物种交叉反应性抗体。每次进行的淘选包括针对各种c5ar抗原(作为可溶性重组抗原或在细胞上过表达)的至少3轮各自独立的选择。
[0617]
尽管食蟹猴与人c5ar之间的整体同源性90％很高，但胞外结构域仅共享75％的蛋白质序列同一性。食蟹猴c5ar交叉反应性抗体的识别确实具有挑战性，其中mab#1和mab#2的祖先抗体是几个揭示与细胞上表达的人c5ar特异性细胞结合、与食蟹猴c5ar具有交叉反应性且不结合其他相关gpcr的候选者之一。
[0618]
对代表人c5ar n端(nt)的肽进行基于珠子的溶液淘选，从而识别对人和食蟹猴c5ar具有特异性并且能够与细胞上表达的全长人c5ar结合的mab#1和mab#2的祖先抗体。
[0619]
使用工程化为过表达人或食蟹猴c5ar的cho flp
‑
in细胞对该克隆进行两次连续进行的亲和力成熟淘选，以进一步增加对人和食蟹猴c5ar的亲和力和特异性。另外，进行抗体工程化以进一步提高特异性、去除潜在的翻译后修饰位点(ptm基序)并用于种系目的。
[0620]
经工程化过程的该最后一步，mab#1和mab#2被识别为潜在的治疗候选物。由于mab#1和mab#2这两个候选物均源于相同的祖先，因此它们享有相似的氨基酸序列和体外特征。
[0621]
下文概述的实施例中进一步描述了这两种抗体。
[0622]
实施例3：制备人c5ar特异性抗体
[0623]
mab#1和mab#2两者都是人igg1f同种型，但在fc区进行了工程化，以消除抗体介导免疫效应子功能的能力。与野生型人igg1 fc区相比，该fc区包含5个氨基酸取代，即根据eu索引编号的l234a、l235e、g237a、a330s和p331s(h_igg1f_aeass)。
[0624]
抗体由重链框架vh3
‑
15和抗体轻链框架λ1组成。
[0625]
瞬时抗体制备
‑
超微量制备hkb11
[0626]
分别用编码mab#1或mab#2(人igg1_aeass)的重链和轻链的哺乳动物表达载体瞬时转染真核hkb11#52细胞。转染后7天收集细胞培养上清液，并使用液体处理站进行蛋白a亲和色谱(mabselect sure
│
ge healthcare)。样品保留在中和的洗脱缓冲液(naps：137mm磷酸钠，81mm nacl，ph 7)中。对样品进行无菌过滤(孔径0.2μm)。通过紫外分光光度法在280nm处测定蛋白质浓度，并使用ce
‑
sds(labchip gxii
│
perkin elmer)在变性、还原条件下分析igg的纯度。进行uhp
‑
sec以分析天然状态的igg制剂。
[0627]
瞬时抗体制备
‑
cho中的探索性规模制备
[0628]
分别用编码mab#1或mab#2(人igg1_aeass)的重链和轻链的哺乳动物表达载体瞬时转染cho3
‑
e7细胞。转染后第6天收集细胞培养上清液，并进行标准的protein a亲和色谱(mabselect sure
│
ge healthcare)。除非另有说明，否则将缓冲液交换为1
×
dulbecco’s pbs(ph 7.2
│
invitrogen)，并对样品进行无菌过滤(孔径0.2μm)。通过紫外分光光度法在280nm处测定蛋白质浓度，并使用ce
‑
sds(labchip gxii
│
perkin elmer)在变性、还原和非还原条件下分析igg的纯度。进行uhp
‑
sec以分析天然状态的igg制剂。
[0629]
瞬时制备结果
[0630]
表9中总结了mab#1和mab#2的产品质量(sec单体含量)和产率数据。总体而言，获
得了可接受的单体含量(>95％)和产量(>55mg/l，在hkb11细胞中)。从cho3e
‑
7瞬时探索性规模制备中获得的体积产量也在预期范围内。
[0631]
表9：瞬时表达的mab#1和mab#2的制备数据
[0632][0633]
稳定hkb11库的产生
[0634]
为了生成稳定表达mab#1或mab#2的hkb11#52库，使用了双载体系统进行共转染。
[0635]
为了促进库选择，这些载体包含博来霉素(zeocin)和新霉素(neomycin)抗性盒。将这两个载体以1:1比例瞬时共转染到活跃分裂的hkb11#52细胞中。转染后一天通过向细胞悬液中加入160μg/ml博来霉素和800μg/ml遗传霉素(geneticin)而开始选择。在选择过程中，细胞计数和存活力最初下降。转染后20天，细胞开始恢复。达到～80％的存活力时，根据所需的量将稳定的库放大到所需的体积。接种后第6天收集批量制备的细胞培养上清液。
[0636]
mab#1和mab#2的大规模纯化
[0637]
使用100mm柠檬酸盐、150mm nacl ph 3.5作为洗脱缓冲液，通过蛋白质a亲和色谱(mabselect sure
│
ge healthcare)从hkb11#52稳定库的细胞培养上清液中纯化mab#1和mab#2。在ph3.5下孵育60分钟后，将样品中和。将缓冲液交换为150mm组氨酸ph 6.0，并对样品进行无菌过滤(0.2μm孔径)。通过紫外分光光度法在280nm处测定蛋白质浓度，并使用ce
‑
sds(labchip gxii
│
perkin elmer)在变性、还原和非还原条件下分析igg的纯度。进行uhp
‑
sec以分析天然状态的igg制剂。
[0638]
大规模制备结果
[0639]
如表10中总结的，mab#1和mab#2的制备获得有利的产量、纯度和完整性。
[0640]
表10：源自稳定细胞库表达的mab#1和mab#2的制备数据。
[0641][0642]
对照抗体
[0643]
出于比较目的，制备了各种对照抗体并将其包括在实验中：
[0644]
refmab#1：基准抗体
[0645]
从美国专利申请us2013/0295116(novo nordisk
‑
克隆32f3a6gl)中检索到编码人c5ar特异性抗体“iph5401”的vh和vl区的核苷酸序列。在内部或由外部供应商将核苷酸序列基因合成为具有合适的侧翼区域(例如，合适的限制酶识别位点、接头序列)的线性dna片段。通过使用标准分子生物学方法，如上所述将dna片段克隆到编码人igg1_aeass的重链和
轻链的合适的哺乳动物igg表达载体中。如上所述，瞬时制备refmab#1。refmab#1的重链和轻链氨基酸序列如表3所示。
[0646]
其他对照抗体：
[0647]
如上所述，以人igg1或人igg1_aeass形式瞬时制备对鸡卵溶菌酶具有特异性的内部阴性同种型对照抗体(mor03207)以及对人c5ar的n端具有特异性的内部阳性对照抗体(抗c5ar抗体)。
[0648]
mab#1和mab#2的结合特性的表征
[0649]
实施例4：使用spr确定mab#1和mab#2对c5ar n端肽的单价亲和力
[0650]
方法
[0651]
使用biacore t200仪器(biacore，ge healthcare)在25℃下通过igg捕集设置进行k
d
测定。使用标准edc
‑
nhs胺偶联化学方法在固定有抗人fc抗体(ge healthcare)的cm5芯片(biacore，ge healthcare)上捕集大约500ru的hbs
‑
ep ph 7.4中稀释的igg。参考流通池(flow cell)1仅被活化和去活化。使用6种不同的人或食蟹猴c5ar_nt
‑
bio肽浓度(分别为seq id no：13或seq id no：14)(2n系列稀释，2000至62.5nm)和作为运行缓冲液的hbs
‑
ep (ge healthcare)(进样时间300s；解离时间600s；流速30μl/min)进行动力学测量。在每个循环之后，通过3
×
20s注射3mm mgcl2使传感器芯片再生以去除结合的肽/抗体复合物。使用运行缓冲液的空白进样来进行双重参照。使用biacore t200评估软件3.1(biacore，ge healthcare)拟合所有传感图，以确定k
on
和k
off
速率常数，这些常数用于计算k
d
。使用1:1结合模型拟合原始数据，其中参数rmax设置为局部，ri设置为0。
[0652]
结果
[0653]
结果总结在表11中。两种抗体均显示出与人c5ar肽相似的结合(k
d
值在较低的两位数纳摩尔范围内)，和与食蟹猴c5ar肽较弱的结合。
[0654]
表11：确定mab#1和mab#2与人和食蟹猴c5ar n端肽结合的缔合和解离速率常数。
[0655][0656]
*灰色斜体格式的值仅用于排名。
[0657]
实施例5：使用octet测定mab#1和mab#2对c5ar n端肽的表观亲和力(二价)
[0658]
方法
[0659]
用octet htx仪器(fort
é
bio,pall life sciences)在27℃下通过c5ar_nt
‑
bio肽捕集设置进行表观k
d
测定。将在ph 7.4的pbs中稀释的大约0.03nm肽加载到链霉亲和素(sa)传感器(fort
é
bio,pall life sciences)上。使用7种不同的igg浓度(在octet缓冲液(pbs，0.05％(v/v)tween
‑
20，0.1％(w/v)bsa)中3倍连续稀释，对于人c5ar_nt
‑
bio肽(seq id no：13)为200至0.27nm，对于食蟹猴c5ar_nt
‑
bio肽(seq id no：14)为1000至1.4nm)以480s的缔合时间和900s的解离时间进行动力学测量。每个解离步骤后，使传感器再生以去除结合的抗体(3
×
30s gly/hcl，ph 1.5)。使用octet data analysis软件10.0(fort
é
bio)
拟合所有传感图，以确定表观k
on
和表观k
off
速率常数，这些常数用于计算表观k
d
(使用1:1结合模型)。
[0660]
结果
[0661]
结果总结在表12中。两种抗体均显示出以二价形式与人c5ar肽的强结合，表观k
d
值在两位至三位数皮摩尔范围内。与食蟹猴c5ar肽的结合大约弱1000倍。观察到的与食蟹猴c5ar肽的较弱结合似乎主要是由于快的k
off
速率引起的。就与人c5ar_nt的表观亲和力而言，mab#2的结合亲和力比mab#1弱约10倍(k
d
：290pm vs.20pm)。
[0662]
表12：确定mab#1和mab#2与人和食蟹猴c5ar n端肽结合的表观缔合和解离速率常数。
[0663][0664]
实施例6：通过使用kinexa确定mab#1对细胞上表达的全长c5ar的表观亲和力(二价)
[0665]
由于c5ar属于gpcr家族，因此很难生成可用于spr测量的重组全长抗原材料。因此，进行了稳定表达人c5ar或食蟹猴c5ar的flp
‑
in cho细胞和kinexa的测量。
[0666]
方法
[0667]
用kinexa 3200仪器(sapidyne仪器)在室温下对表达c5ar的细胞进行表观k
d
测定。将补充有bsa(1mg/ml)和0.02％(v/v)nan3的pbs(gibco)用作检定缓冲液。将mab#1(浓度：2nm和30pm)用作分析物，且将flip
‑
in cho hc5ar_v5/his细胞(终浓度3mio细胞/ml和1mio细胞/ml，2n系列稀释)或flip
‑
in cho cyc5ar_v5/his细胞(终浓度25mio细胞/ml和6mio细胞/ml，2n系列稀释)用作滴定剂，并在室温下于顶置振荡器中平衡过夜。平衡后，将样品离心，并将上清液用于分析。使用涂有mabssl(ge healthcare)的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)珠确定mab#1的游离浓度，并使用抗人fab2 alexa fluor 647(500ng/ml)进行检测。使用kinexa软件并通过“n曲线分析”(其同时将所有给定曲线拟合到单个k
d
值)获得表观k
d
。
[0668]
结果
[0669]
结果总结在表13中。mab#1显示出与全长人c5ar的强结合，表观k
d
值为130pm。与全长食蟹猕猴c5ar的结合看似弱约20倍，表观k
d
值为约3nm。之前在octet和biacore测量(参见实施例4和实施例5)中可观察到类似的与食蟹猴c5ar结合相关的发现。
[0670]
表13：mab#1与在flp
‑
in cho细胞上表达的全长人和食蟹猴c5ar的二价结合
[0671][0672]
实施例7：mab#1和mab#2与在flp
‑
in cho细胞和源自全血的中性粒细胞上表达的全长c5ar的结合(facs分析)
[0673]
通过facs研究细胞与稳定表达各种全长c5ar抗原和相关gpcr的cho flp
‑
in细胞系的结合以及与内源性表达人或食蟹猴c5ar的纯化人或食蟹猴中性粒细胞的结合。食蟹猴中性粒细胞是从三个不同动物(lpt hamburg)的食蟹猴全血中获得的。
[0674]
方法
[0675]
封闭c5ar
‑
cho flp
‑
in细胞系，并以连续稀释或300nm的单一(高)浓度添加igg。为了检测igg结合，添加r
‑
藻红蛋白(r
‑
pe)结合的抗人igg(fc
‑
γ片段特异性)2抗体，并使用facs array或novocyte装置测量荧光。
[0676]
使用来自miltenyi biotec的macsexpress中性粒细胞分离混合物从edta全血样本中纯化中性粒细胞。简而言之，使用该试剂盒，可通过磁性标记和负磁分离操作分离细胞。去除红细胞后，通过添加连续稀释的igg，然后添加alexa fluor 647结合的抗人f(ab)2片段特异性检测抗体，对细胞染色。在facs array装置上进行测量。将facs数据使用flowjo评估，输入graphpad prism(v4.0)，并使用非线性回归拟合到s形剂量反应曲线，以计算ec
50
。
[0677]
结果
[0678]
结果总结于表14以及图1和2中。图1a和图1c示出了mab#1、mab#2和refmab#1与表达各自全长受体的工程化cho细胞上存在的人和食蟹猴c5ar的结合。总体而言，对于mab#1、mab#2和refmab#1，确定在人c5ar上具有非常相当的结合曲线，具有几乎相同的ec
50
浓度。对于mab#1和mab#2，在食蟹猴c5ar上获得了相似的结果。如所预期，refmab#1显示不与cho细胞上表达的食蟹猴c5ar结合。
[0679]
还使用从人或食蟹猴全血获得的纯化的中性粒细胞证实了与食蟹猴和人c5ar的结合(图1b和图1d)。同样，对于mab#1，可观察到在人和食蟹猴中性粒细胞上具有非常相当的结合曲线，具有几乎相同的ec
50
值。有趣的是，与mab#1相比，mab#2在食蟹猴中性粒细胞上在背景水平上显示出总体较低的信号。当分析与cho细胞上表达的食蟹猴c5ar的结合时，观察不到这一发现。证实refmab#1与食蟹猴中性粒细胞缺乏结合。
[0680]
对于啮齿动物c5ar，由于其低序列同源性(66％的整体同一性)，因此预期不会与大鼠和小鼠c5ar发生交叉反应。实际上，当以300nm的igg浓度测试时，mab#1和mab#2均未显示与cho
‑
flp细胞上表达的大鼠或小鼠c5ar的任何显著结合(图2)。为了排除与c5ar亚家族任何其他成员的交叉反应性，还通过facs确定了与在cho flp
‑
in细胞上表达的全长人c5l2、chemr23、fpr1和c3ar的结合(与未转染的亲本cho flp
‑
in细胞相比)。如图2所示，即使在300nm的igg浓度下，也无法检测到mab#1和mab#2与任何c5ar相关gpcr或与亲本cho细胞的显著细胞结合。
[0681]
总之，mab#1和mab#2均显示出与人和食蟹猴c5ar的特异性结合。
[0682]
表14：mab#1、mab#2和refmab#1与由工程化cho细胞或纯化的中性粒细胞表达的全长人或食蟹猴c5ar的结合。每种抗体均在至少两个独立的检定运行中加以测试。
scale diagnostics)检测电化学发光信号。
[0697]
为了评估，将抗体样品与某种蛋白质的结合信号除以参考抗体mor03207的各结合信号，得到结合率(br)。然后计算除对照外的所有蛋白质(总共25个)的累积结合率(cbr)：至多150的cbr表示igg没有可检测的非特异性结合。高于150的值表示igg与参考抗体mor03207相比具有增加的非特异性结合。
[0698]
结果
[0699]
mab#1和mab#2的结果总结在图10中。总而言之，对于任何测试的蛋白质都没有检测到关键的非特异性结合。观察到非常低(mab#2)和低(mab#1)的与牛转铁蛋白的结合。在基于octet的结合检定法中证实了与牛转铁蛋白的结合，但是未检测到与大鼠和食蟹猴转铁蛋白的结合(数据未显示)。因此，观察到的与牛转铁蛋白的结合被认为是非关键的。
[0700]
最终抗体形式和安全性
[0701]
c5ar在各种免疫细胞(如白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)上表达，需要防止人igg1 fc介导的此类细胞的耗竭，以避免不想要的副作用。因此，就其在治疗干预期间诱导任何效应子功能的能力而言，抗c5ar抗体的最终igg形式需要保持沉默。
[0702]
mab#1和mab#2两者均在人igg1f的fc区包含五个氨基酸取代，即l234a、l235e、g237a、a330s和p331s(higg1f_aeass，根据eu索引编号)，以消除抗体诱导的效应子功能。在c5ar抗体治疗的背景下，这种形式的临床安全性已在本领域进行了描述(wagner f等.annals of the rheumatic diseases.2014；73:499.doi:10.1136/annrheumdis
‑
2014
‑
eular.2156.)
[0703]
在各种检定(例如与fcγ受体或c1q的结合研究，以及如下概述的体外adcc和adcp检定)中证实了mab#1和mab#2缺乏诱导效应子功能的能力。
[0704]
实施例10：使用octet的mab#1和mab#2与fcrn受体的结合
[0705]
方法
[0706]
使用octet htx仪器(fort
é
bio,pall life sciences)在27℃下于ph 6.0和7.2对来自不同物种的固定化新生儿fc受体(fcrn)进行了表观k
d
检定。在链霉亲和素(sa)传感器(fort
é
bio,pall life sciences)上捕集0.5nm的生物素化人、食蟹猴、小鼠和大鼠fcrn。使用在octet缓冲液(pbs，0.05％(v/v)tween
‑
20，0.1％(w/v)bsa)中8种不同浓度的igg(3n系列稀释，1000至0.46nm)以240s的缔合时间和180s的解离时间进行动力学测量。在每个循环后，使传感器再生以去除结合的配体/抗体复合物(在ph 8.0的hbs
‑
ep 中，2
×
30s)。使用data analysis software 10.0(fort
é
bio,pall life sciences)拟合所有传感图，以确定表观亲和力，并使用稳态模型拟合数据。
[0707]
结果
[0708]
结果总结在表16中。与同种型对照抗体mor03207 igg1f相比，mab#1和mab#2显示出与不同物种的fcrn的表观亲和力在预期的亲和力范围内，并且两种igg分子均可确认与人fcrn结合的生理结合行为，即在中性ph值(7.2)下均未检测到结合。因此，在抗体的fc区中引入的5个突变不会不利地影响人fcrn结合。
[0709]
表16：ph 6.0和7.2下mab#1和mab#2经fc区与fcrn的结合。
[0710][0711]
*与拟合模型(ph 6.0)的偏差
[0712]
**在ph 7.2下有轻微结合
[0713]
***斜体格式的值主要用于排名
[0714]
实施例11：使用octet的mab#1和mab#2与人fcγ受体的结合
[0715]
方法
[0716]
使用octet(fort
é
bio,pall life sciences)在27℃下通过igg捕集设置进行k
d
测定。在蛋白a传感器(fort
é
bio,pall life sciences)上捕集在octet检定缓冲液(pbs，0.05％(v/v)tween
‑
20，0.1％(w/v)bsa)中稀释的2.0nm igg。使用检定缓冲液中的7种浓度的fcγ受体(2n系列稀释)进行动力学测量。在每个循环之后，使传感器再生以去除结合的配体/抗体复合物(在10mm ph 1.5的gly/hcl中，2
×
30s)。使用data analysis software 10.0(fort
é
bio,pall life sciences)对所有传感图进行拟合，以确定k
on
和k
off
速率常数，这些常数用于计算k
d
。使用1:1结合模型拟合原始数据，参数rmax设置为局部。
[0717]
结果
[0718]
结果总结在表17中。未检测到mab#1和mab#2与任何测试的fcγ受体的结合，或仅检测到非常弱的结合，并证实在人igg1 fc区引入的突变对消除fcγ受体结合是有效的。
[0719]
表17：mab#1和mab#2通过fc区与人fcγ受体的结合
[0720][0721]
实施例12：使用octet的mab#1和mab#2与c1q的结合
[0722]
方法
[0723]
使用octet(fort
é
bio,pall life sciences)在27℃下通过igg捕集设置进行表观(二价)k
d
测定。将在octet缓冲液中稀释的2.0nm igg捕集到固定在链霉亲和素(sa)传感器(fort
é
bio,pall life sciences)上的抗hu fab ch1κ/λ(bac)上。使用octet检定缓冲液(参见上文)中的8种浓度的c1q(3n系列稀释，500至0.69nm)以240s的缔合时间和240s的解离时间进行动力学测量。每个循环后，使传感器再生以去除结合的配体/抗体复合物(2
×
50mm naoh，1
×
10mm gly/hcl，ph 1.5，每次进行30s)。使用data analysis software 9(fort
é
bio,pall life sciences)对所有传感图进行拟合，以确定表观亲和力。使用稳态模型拟合数据。
[0724]
结果
[0725]
结果总结在表18中。如所预期，没有观察到mab#1和mab#2与c1q(从合并的人血浆中分离)的结合，并证实了在人igg1 fc区引入的突变对于消除c1q结合是有效的。
[0726]
表18：mab#1和mab#2与人c1q的结合。
[0727]
抗原mab#2mab#1人c1q无结合无结合
[0728]
实施例13：mab#1的adcc和adcp体外活性
[0729]
方法
[0730]
使用promega adcc和adcp报告基因生物检定试剂盒根据制造商的说明书(分别为cat#g7017和cat#g988a)，对mab#1的adcc和adcp活性进行测试。这些试剂盒采用工程化jurkat细胞作为效应细胞。这些细胞稳定表达用于adcc的fcγriiia受体(v158(高亲和力)变体)和用于adcp的fcγriia_h受体以及驱动萤火虫荧光素酶表达的nfat响应元件。作为靶细胞，使用表达人c5ar的cho flp
‑
in细胞。效应细胞通过抗体桥(例如通过mab#1或mab#2)与靶标的结合引发nfat通路中的级联事件，导致萤火虫荧光素酶蛋白的表达。酶促反应产生的发光与荧光素酶浓度成正比，与adcc或adcp活性直接相关。通过将平均信号绘制到背景值来分析mab#1的adcc或adcp活性。
[0731]
由于对于mab#1，野生型人igg1f版本不可得，因此将内部人抗c5ar对照抗体的野生型igg1f以及fc沉默的人igg1f_aeass版本用作阳性对照。另外，包括同种型对照抗体mor03207的fc沉默(higg1_aeass)和野生型(higg1f)版本作为阴性对照。
[0732]
结果
[0733]
igg浓度为10μg/ml的结果总结在表19中，并示于图8a(adcp)和图8b(adcc)中。在过表达c5ar的cho细胞存在下，mab#1不会在工程化效应细胞中诱导nfat通路的fcγriiia或fcγriia_h活化，类似于抗c5ar对照抗体的fc沉默版本和mor03207的fc沉默版本。c5ar特异性对照抗体的野生型(非沉默)版本在表达c5ar的cho细胞存在下，明显诱导了工程化jurkat细胞中萤光素酶的产生。
[0734]
总而言之，实验清楚地证实了在野生型人igg1 fc区引入的突变可高效防止adcc和adcp活性。
[0735]
表19：进行体外检定以确认mab#1(higg1f_aeass)不介导效应子功能的概述。
[0736][0737]
mab#1和mab#2的功能性表征
[0738]
在监测c5a诱导的c5ar活化的不同体外检定中分析mab#1和mab#2的中和活性。
[0739]
由于已经描述了在病理生理条件下升高的c5a水平，因此预期c5ar拮抗抗体中和可能在疾病部位局部存在的高浓度c5a的能力在体内提供有益的治疗效果。因此，还建立了体外实验以反映这种体内病理状况。
[0740]
实施例14：
‑
抑制蛋白检定(discoverx)
[0741]
方法：
[0742]
根据制造商的说明书进行discoverx的
‑
抑制蛋白检定。简而言之，通过使用β
‑
半乳糖苷酶片段互补检测β
‑
抑制蛋白与活化的c5ar的相互作用来测量人c5a诱导的人c5ar活性。
[0743]
使用重组人c5a诱导β
‑
抑制蛋白募集，并使用来自discoverrx的化学发光检测试剂测量酶活性。将表达人c5ar工程化版本的中国仓鼠卵巢细胞(cho)接种过夜，添加系列稀释的人c5a(r&d systems)并在37℃和5％co2中孵育1.5小时(在不存在拮抗剂情况下生成滴定曲线)。平行地，在存在c5ar特异性抗体(固定的igg浓度50nm)的情况下测定人c5a的滴定曲线。为此，在用人c5a刺激之前将igg添加到细胞中，并在37℃和5％co2下孵育1小时。结果表示为相对发光单位。通过graphpad prism生成在存在和不存在拮抗igg的情况下人c5a的滴定曲线。
[0744]
对于β
‑
抑制蛋白检定，比较了mab#1、mab#2和refmab#1对人c5a的剂量反应曲线向较高剂量的移动(即在剂量轴上水平向右)(图4a)。另外，计算并比较了在三个增加的c5a浓度(1.2nm、11nm和100nm)处的抑制百分比(图4b)。
[0745]
结果
[0746]
β
‑
抑制蛋白检定的结果示于图4a和图4b中，并总结在表20和表21中。在不存在抗体的情况下，获得平均ec
50
浓度为2.9nm的对人ec5a的剂量反应曲线(图4a)。
[0747]
以50nm的最终igg浓度将mab#1或mab#2添加至人c5a导致剂量反应曲线向较高剂量的人c5a显著移动，移动大于12倍。更准确地说，在存在50nm mab#1或mab#2的情况下，获得平均ec
50
浓度为37nm的对人c5a的剂量反应曲线(图4a，表20)。换句话说，mab#1或mab#2的存在会显著降低人c5诱导c5ar活化的能力，或者，在存在mab#1或mab#2的情况下，与不存在抗体的情况下c5ar活性相比，为了诱导相同的c5ar活性，需要以至少12倍的浓度添加人
c5a。
[0748]
当计算在三个增加的c5a浓度下的抑制百分比时，也反映了这一观察结果(图4b)。在1.2nm的人c5a下，所有三种测试的抗体mab#1、mab#2和refmab#1在50nm的igg浓度下，对c5a诱导的c5ar活性的抑制作用相当，均超过80％。但是，如果使用约10倍浓度的人c5a(11nm)来活化c5ar，则refmab#1只能中和约50％的c5a诱导的c5ar活性。这与mab#1和mab#2形成强烈反差，mab#1和mab#2仍然能够中和多达80％的c5a诱导的c5ar活性。
[0749]
当使用100倍浓度的人c5a(100nm)来活化c5ar时，这种效果更加明显。在这里，对于refmab#1几乎没有检测到中和活性，而mab#1和mab#2仍然能够分别中和约40％和30％的人c5a诱导的c5ar活性。
[0750]
因此，mab#1和mab#2两者均高效地在体外中和病理生理学c5a浓度，并且与refmab#1相比，效力显著更强。
[0751]
表20：体外β
‑
抑制蛋白检定(n＝3)：通过使用β
‑
半乳糖苷酶片段互补检测β
‑
抑制蛋白与活化的c5ar的相互作用来测量c5ar特异性抗体对c5a诱导的c5ar活性的抑制活性。
[0752][0753]
表21：体外β
‑
抑制蛋白检定(n＝3)：c5ar特异性抗体对c5a诱导的c5ar活性的抑制活性，针对3种浓度的c5a和固定的igg浓度50nm计算，并通过使用β
‑
半乳糖苷酶片段互补检测β
‑
抑制蛋白与活化的c5ar的相互作用来测量。
[0754][0755]
实施例15：mab#1和mab#2对中性粒细胞和单核细胞活化的抑制
‑
cd11b检定
[0756]
此外，在代表了更为生理设置的功能性cd11b全血检定中测定了mab#1和mab#2的中和效能。cd11b与cd18结合形成整合素mac
‑
1复合物，该复合物充当多配体受体。cd11b在>50％的外周血白细胞的表面上组成性表达；在白细胞活化时，其表达通过含有cd11b的分泌性颗粒融合到细胞膜中而被上调。因此，cd11b表达被广泛用作体内和体外白细胞活化的标志物。
[0757]
c5a作为人中性粒细胞和单核细胞的有效活化剂，诱导表面抗原cd11b的上调。因此，通过评估源自全血的粒细胞和单核细胞中的cd11b水平，研究mab#1和mab#2防止c5a诱导的粒细胞和单核细胞活化的能力。基本上如美国专利申请us2013/0295116(novo nordisk)中所述进行实验。
[0758]
方法
[0759]
在第一个检定设置中，将肝素化全血与igg(连续稀释)混合，并在37℃、5％co2下孵育20分钟。以15nm的标准浓度添加人c5a，并在37℃、5％co2下孵育20分钟。加入抗cd11b
‑
pe或同种型对照抗体mor03207，并将板在37℃、5％co2下孵育20分钟。最后，加入红细胞裂解缓冲液并在黑暗中于室温孵育15分钟，洗涤细胞，并再次将其重悬于裂解缓冲液中。
[0760]
在第二个实验设置中，以150nm的更加临床相关病理生理学浓度添加人c5a，但没有修改如上所述的其余检定设置。
[0761]
为了研究mab#1的受体停留时间，通过将肝素化全血与igg的孵育时间从20分钟延长至300分钟，而进一步调整该检定。
[0762]
使用facs array或novocyte装置测量荧光。门控样品以排除死细胞和碎片。单核细胞和粒细胞根据其fsc和ssc谱进行识别并进行门控。计算cd11b
‑
pe通道(黄色
‑
a)中门控粒细胞和/或单核细胞的中值荧光强度(mfi)。结果表示为抑制百分比(％抑制)。最大cd11b表达(mfi
max
)是与c5a孵育但无igg的细胞的平均mfi。最小(背景)cd11b表达(mfi
min
)是在没有c5a且没有igg的情况下孵育的细胞的平均mfi。用于计算每个样品的％抑制的公式为：
[0763]
％抑制＝100
‑
(((mfi
样品
‑
mfi
min
))/((mfi
max
‑
mfi
min
))
×
100)
[0764]
将数据使用flowjo评估，输入graphpad prism(v4.0)，并使用非线性回归拟合到s形剂量反应曲线，以计算ic
50
。
[0765]
使用15nm c5a配体的mab#1的结果
[0766]
表22中总结了cd11b全血检定的mab#1的结果。对于两个门控细胞群体(单核细胞和粒细胞)，确定出单位数nm范围的ic
50
值，对粒细胞的最大抑制作用接近88％，对单核细胞的最大抑制作用为83％。
[0767]
表22：mab#1防止c5a介导的粒细胞和单核细胞活化的能力。
[0768]
在cd11b检定中使用15nm c5a(n＝3)确定概览最大抑制和ic
50
值。
[0769][0770]
使用15nm vs.150nm c5a配体的mab#1、mab#2和refmab#1的结果
[0771]
除了添加15nm的人c5a来刺激粒细胞(如上所述)外，还使用十倍浓度的配体(150nm)来模拟更病理生理学的配体浓度。
[0772]
同样，对mab#1、mab#2和refmab#1进行剂量滴定，并使用graphpad prism通过非线性回归函数生成抑制曲线。结果定量地表示为“诱导50％抑制所需的拮抗剂浓度”。
[0773]
该cd11b全血检定的结果示于图5a和图5b中。
[0774]
图5a示出在15nm c5a下的mab#1、mab#2和refmab#1的中和活性，图5b示出在150nm c5a下的各中和活性。作为定量读数，计算了达到cd11b上调50％抑制的igg浓度，结果在两个图中的x轴下方表示。
[0775]
总之，当在作为主要靶细胞的粒细胞上门控的cd11b全血检定中使用增加的c5a浓
度时，进行了与β
‑
抑制蛋白检定(实施例14)类似的观察。为了将15nm人c5a的作用阻断到50％，对于mab#1和refmab#1需要12nm的igg浓度，而对于mab#2，17nm的igg浓度才足够。但是，为了阻断由10倍c5a浓度(150nm)诱导的cd11b上调的50％，需要显著不同量的拮抗剂。当对于mab#1，现在42nm的igg浓度足以抑制50％的c5a诱导的c5ar活化时，要达到相同的阻断效果，需要7倍浓度(291nm)的refmab#1。对于mab#2，114nm的igg浓度足够。
[0776]
因此，就效力而言，可以对3种igg进行与β
‑
抑制蛋白检定中已经观察到的相同的排名(mab#1>mab#2>refmab#1)，并且mab#1和mab#2两者在体外均显得非常高效地中和病理生理学c5a浓度，且与refmab#1相比，效力显著更强。
[0777]
mab#1的结果
‑
对受体停留时间的影响
[0778]
seow及其同事(seow v等,sci rep.2016；6:24575)报道了c5a的生成位于细胞膜上，对于短暂但重复的时间可以很高。因此，建议具有长停留时间的c5ar拮抗剂在具有快速和瞬时信号传导的系统中可能是有利的。还得出结论，在体外测量的增加的受体停留时间也可以转化为体内的作用时间和效力程度。
[0779]
为了比较两种抗体在seow及其同事发表的相似设置中的受体停留时间，如上所述评估了igg与全血中存在的粒细胞和单核细胞一起孵育20分钟和300分钟的对数剂量抑制曲线。
[0780]
cd11b全血检定的该实验设置的结果示于图6a
‑
d中。令人惊讶的是，在延长的孵育时间内，可观察到mab#1的中和活性的显著提高。如图6a和图6c所示，对于粒细胞和单核细胞群体两者，mab#1的计算出的ic
50
浓度随时间下降了约6倍(ic
50
值汇总在表23中)。对于refmab#1，在300分钟后未观察到抑制曲线的移动或下降(图6b和图6d)。
[0781]
表23：在15nm c5a下igg与全血孵育20分钟或300分钟后的cd11b检定。提供了粒细胞(上侧)和单核细胞(下侧)的ic
50
值和x倍效能提高(20分钟vs 300分钟)。
[0782][0783]
总之，病理生理学c5a水平的高效中和以及随着时间的推移增加的效能两者的组合预期在体内是有益的。
[0784]
实施例16：c5a诱导的中性粒细胞的迁移
[0785]
分析了c5a诱导的纯化的中性粒细胞的趋化性。该实验基本上如美国专利申请
us2013/0295116中所述进行。
[0786]
方法
[0787]
使用人macsxpress全血中性粒细胞分离试剂盒(miltenyi biotec cat#130
‑
104
‑
434)和人macsxpress红细胞耗竭试剂盒(miltenyi biotec，cat#130
‑
098
‑
196)从三个不同人供体的全血中分离和纯化中性粒细胞。
[0788]
使用的3.0μm孔径96孔板通过boyden室技术分析igg抑制hc5a依赖性中性粒细胞迁移的效能。在37℃下，用1mg/ml人纤维蛋白原包被boyden室孔的膜2小时。洗涤后，将膜用含2％牛血清白蛋白(bsa)的溶液在37℃下封闭1小时。然后，用钙黄绿素对纯化的中性粒细胞进行染色，并在有和没有拮抗igg(100nm和600nm)的情况下，将105个染色的细胞添加到boyden室的上隔室中。将hc5a(r&d systems，10nm)应用于boyden室的下隔室中。在酶标仪(tecan m1000pro)中，每5分钟在37℃下于485/538nm下测量该板60分钟。测量通过fluoroblok膜的钙黄绿素染色的中性粒细胞来确定中性粒细胞迁移到下隔室的能力。结果表示为动力学迁移曲线(5
‑
60分钟)以及在选定的时间点(15、25和35分钟)计算的抑制百分比。
[0789]
用于计算％抑制的公式为
[0790]
％抑制＝100
‑
(((rfu
样品
‑
rfu
min
))/((rfu
max
‑
rfu
min
))
×
100)
[0791]
结果
[0792]
根据使用来自三个不同人供体的中性粒细胞的三个独立的实验，计算在两个测试的igg浓度下，在选定的时间点，中性粒细胞迁移的平均抑制百分比。
[0793]
如图7所示，迁移15分钟后，对于mab#1几乎完全抑制了c5a诱导的中性粒细胞迁移。在迁移35分钟之后和测试的最高igg浓度(600nm)，mab#1仍然显示出>50％的抑制。阴性同种型对照抗体mor03207对中性粒细胞迁移没有抑制作用。
[0794]
实施例17：c5a诱导巨噬细胞释放细胞因子
[0795]
巨噬细胞在活化时根据其极化释放促炎或抗炎细胞因子。因此，评估了c5a/c5ar与mab#1相互作用的阻断是否影响c5a诱导的m1和m2巨噬细胞的细胞因子释放。进行细胞因子elisa以检测m2巨噬细胞产生抗炎性il
‑
10和m1巨噬细胞产生促炎性il
‑
12。
[0796]
方法
[0797]
简而言之，通过使用biocoll分离液和sepmate管(stemcell)进行密度梯度离心，从健康人供体的全血中制备外周血单核细胞(pbmc)。使用cd14 选择试剂盒(miltenyi biotech)从pbmc中分离单核细胞，并在96孔板中在补充有10％fcs和1
×
glutamax的rpmi中培养。使用lps(20ng/ml)和ifnγ(50ng/ml)在37℃使过夜铺板的单核细胞极化24小时至m1巨噬细胞，并与mab#1(30nm)预孵育30分钟，然后添加c5a(15nm)再放置24小时。包括在不存在mab#1的情况下用c5a刺激的m1巨噬细胞和未经处理的对照。24小时后，通过il
‑
12/il23 duoset elisa(r&d systems)根据制造商的说明书分析细胞上清液。为了生成m2巨噬细胞，通过将单核细胞在补充有m
‑
csf的rpmi/10％fcs中培养5天，并在第5天添加m
‑
csf、il
‑
4、il
‑
13和il
‑
6(每种40ng/ml)而使其预分化为巨噬细胞。从第5天至第9天，每天添加c5a(15nm) /
‑
mab#1(30nm)。在第9天，通过il
‑
10duoset elisa(r&d systems)根据制造商的说明书分析细胞上清液。
[0798]
结果
[0799]
尽管与c5a的孵育导致m1巨噬细胞的il
‑
12产生降低，但与未经处理的对照相比，用mab#1预处理后未观察到il
‑
12水平降低。另一方面，用mab#1处理抑制了m2巨噬细胞中c5a诱导的il
‑
10产生(参见图11)。
[0800]
结论是，mab#1高效抑制了c5a诱导的m2巨噬细胞产生抗炎性il
‑
10，并恢复了m1巨噬细胞产生促炎性il
‑
12，从而证明了mab#1在体外的作用模式。
[0801]
药代动力学
[0802]
实施例18：药代动力学
[0803]
在单次静脉内(i.v.)施用10mg/kg igg后，评估雄性han
‑
wistar大鼠(n＝3只动物)中mab#1的药代动力学特征。
[0804]
方法
[0805]
在以下时间点通过眶后窦或下颌静脉穿刺从每只动物收集血浆样品：给药前、给药后0.083小时、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、240小时、336小时和504小时。
[0806]
使用基于msd的配体结合检定确定大鼠血浆中游离的生物活性mab#1浓度。简而言之，将生物素化的n端人c5ar肽包被在96孔链霉亲和素
‑
msd板的表面上。使用药物特异性抗独特型ecl标记的抗体检测结合的分析物。基于血浆中的游离药物浓度，使用非房室数据分析(nca)评估mab#1的药代动力学特性。
[0807]
结果
[0808]
随时间变化的平均血浆浓度如图9所示。在所有三只动物中给药后5分钟(即0.083小时)观察到单次静脉内给药后mab#1的平均最大血浆浓度(即t
max
)(即给药后的第一个采样时间点)。106ml/kg的平均分布体积(vz)在血浆体积和胞外体积之间(davies等，1993)。静脉内给药之后的平均末端消除半衰期确定为9.0天，平均总清除率确定为0.341ml/h/kg。
[0809]
总体而言，mab#1证明了人igg1抗体在大鼠血浆中的典型药代动力学特征，与啮齿动物c5ar无交叉反应性。没有检测到抗药物抗体(ada)介导清除的迹象。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
