从玉米中分离的SIZ1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用的制作方法

18:169
‑
182；rosa tgm and abreu ai(2019)exploring the regulatory levels of sumoylation to increase crop productivity.curr opin plant biol49:43
‑
51.)。sap and miz1 domaincontaining ligase1(siz1)是植物e3 sumo连接酶。它是类泛素化修饰过程中的重要辅助因子，参与调控了各种目的蛋白与sumo结合，促进目的蛋白的sumo化修饰(augustine and vierstra,2018)。siz1蛋白主要包含scaffold attachment factor
‑
a/b/acinus
‑
pias(sap)，siz/pias
‑
really intersting new gene(sp
‑
ring)，plant homeo domain(phd)和proline
‑
isoleucineisoleucine
‑
threonine(piit)等结构域。研究表明，拟南芥、水稻和番茄等植物中的siz1均广泛参与调控植物生长发育、抗逆及抗病等生物学过程(augustine rc and vierstra rd(2018)sumoylation:re
‑
wiring the plant nucleus during stress and development.curr opin plant biol45:143
‑
154.)，但玉米中的siz1基因及其功能尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是从玉米中分离得到siz1蛋白及其编码基因；
7.本发明的目的之二是将从玉米中分离得到siz1蛋白及其编码基因应用于包括玉米穗粒腐病抗性改良、调控玉米sumo化修饰等方面。
8.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
9.本发明首先提供了从玉米中分离得到zmsiz1a蛋白，该蛋白的氨基酸序列为(a)或(b)所示:
10.(a)seq id no.1所示的氨基酸序列；或
11.(b)将seq id no.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有植物e3 sumo连接酶功能或活性的蛋白变体。
12.本发明还提供了从玉米中分离得到zmsiz1b蛋白，该蛋白的氨基酸序列为(a)或(b)所示:
13.(a)seq id no.3所示的氨基酸序列；或
14.(b)将seq id no.3所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有植物e3 sumo连接酶功能或活性的蛋白变体。
15.本发明进一步提供了zmsiz1a蛋白的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
16.(a)seq id no.2所示的多核苷酸；或
17.(b)编码seq id no.1所示氨基酸的多核苷酸；或
18.(c)与seq id no.2的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸；或
19.(d)与seq id no.2所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
20.(e)在seq id no.2所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有植物e3 sumo连接酶的功能或活性。
21.本发明更进一步提供了zmsiz1b蛋白的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
22.(a)seq id no.4所示的多核苷酸；或
23.(b)编码seq id no.3所示氨基酸的多核苷酸；或
24.(c)与seq id no.4的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸；或
25.(d)与seq id no.4所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
26.(e)在seq id no.4所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有植物e3 sumo连接酶的功能或活性。
27.另外，本领域技术人员可以将seq id no.2或seq id no.4所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。
28.本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域技术人员所了解。例如，可通过dna的突变制备该氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
[0029]“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码seq id no.1或seq id no.3所示氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如dna改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：dna结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。
[0030]
本发明还提供了含有所述zmsiz1a蛋白或zmsiz1b蛋白的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
[0031]
本发明利用crispr/cas9转基因技术敲除玉米中zmsiz1a基因和zmsiz1b基因筛选得到的zmsiz1s
‑
#1突变体材料和zmsiz1s
‑
#2突变体材料，因基因zmsiz1a和zmsiz1b功能异常，导致植株体内蛋白发生sumo化修饰的能力严重受损。与野生型植株相比，突变体植株在热胁迫条件下全局性sumo化修饰能力严重受损。同时，突变体籽粒在实验室条件和田间条件下均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明zmsiz1a和zmsiz1b蛋白对玉米蛋白发生sumo化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。
[0032]
本发明进一步提供了zmsiz1a蛋白以及zmsiz1b蛋白的突变体，zmsiz1a蛋白的突变体的氨基酸序列为seq id no.24或seq id no.25所示，其编码基因的核苷酸序列分别为seq id no.26或seq id no.27所示；zmsiz1b蛋白的突变体的氨基酸序列为seq id no.28或seq id no.29所示，其编码基因的核苷酸序列分别为seq id no.30或seq id no.31所示。
[0033]
由此，本发明提供了一种提高玉米抗穗粒腐病抗性的方法，包括，构建含有zmsiz1a基因或/和zmsiz1b基因的植物重组表达载体；将所述植物重组表达载体转化到玉米中，将zmsiz1a基因或/和zmsiz1b基因在玉米中进行过表达。
cell reports.1986.5:81
‑
84)。
[0046]
所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物是玉米。
[0047]
本发明所涉及到的术语定义
[0048]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0049]
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605
‑
2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,mol cell.probes 8:91
‑
98(1994))。
[0050]
本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(tijssen,techniques in biochemistry and molecular biology
‑
hybridization with nucleic probes,"overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点(t
m
)约5
‑
10℃。t
m
为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、ph和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在t
m
下在平衡状态下50％的探针被占据)。
[0051]
本发明中所述的“多个”通常意味着2
‑
8个，优选为2
‑
4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
[0052]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
[0053]
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的
其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
[0054]
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
[0055]
术语“植物重组表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的dna载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：t
‑
dna转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性dna序列等。
[0056]
术语“转化”指将异源性dna序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
[0057]
术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
[0058]
本发明整体技术方案的详述
[0059]
本发明利用crispr/cas9基因编辑技术对玉米zmsiz1a和zmsiz1b基因进行突变，获得了影响玉米sumo化修饰及穗粒腐病抗性的两个关键突变蛋白。
[0060]
在zmsiz1s
‑
#1突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp。
[0061]
在zmsiz1s
‑
#2突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导致移码突变，提前出现终止子。
[0062]
筛选得到的zmsiz1s
‑
#1突变体材料和zmsiz1s
‑
#2突变体材料因基因zmsiz1a和zmsiz1b功能异常，导致植株体内蛋白发生sumo化修饰的能力严重受损。具体来讲，与野生型植株相比，突变体植株在热胁迫条件下全局性sumo化修饰能力严重受损。同时，突变体籽粒在实验室条件和田间条件下均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明zmsiz1a和zmsiz1b蛋白对玉米蛋白发生sumo化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。
[0063]
本发明首次通过crispr/cas9基因编辑技术对玉米sumo e3连接酶基因zmsiz1a和zmsiz1b进行定点突变，获得了严重影响玉米sumo化修饰能力和穗粒腐病抗性的缺陷突变蛋白，这对于构建相关遗传调控网络并应用于育种研究有重要的理论和实践意义。
附图说明
[0064]
图1两个zmsiz1a和zmsiz1b同时被编辑的突变体材料zmsiz1s
‑
#1突变体材料和zmsiz1s
‑
#2突变体材料；a在zmsiz1s
‑
#1突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp；b在zmsiz1s
‑
#2突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导致移码突变，提前出现终止子。
[0065]
图2突变体材料zmsiz1s
‑
#1和zmsiz1s
‑
#2突变体植株叶片在热胁迫条件下全局性
no.13)。
[0088]
3.制备sgrna表达盒
[0089]
以sgrna序列为模板，其序列为：
[0090]
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no.14))；
[0091]
分别以zmsiz1ab
‑
1f，zmsiz1a
‑
2f和zmsiz1b
‑
2f为上游引物，以musgr
‑
r：ggccagtgccaagcttaaaaaaagcaccgactcg(seq id no.15)为下游引物，通过pcr扩增获得3段靶点序列和sgrna的融合片段分别命名为1ab
‑
sgr片段，1a2
‑
sgr片段和1b2
‑
sgr片段。
[0092]
以1ab
‑
sgr片段和u6
‑
1启动子片段为模板，以mu6
‑
2f(序列：tgcactgcacaagctgtttttgttagccccatcg(seq id no.16))为上游引物，musgr
‑
r为下游引物，通过重叠pcr获得sgrna表达盒1；
[0093]
分别以1a2
‑
sgr片段和u6
‑
1启动子片段，1b2
‑
sgr片段和u6
‑
1启动子片段为模板，以mu6
‑
3f为上游引物，其序列为：tgctttttttaagctgtttttgttagccccatcg(seq id no.17))，
[0094]
以musgr
‑
r为下游引物，通过重叠pcr获得sgrna表达盒2和sgrna表达盒3。
[0095]
4.sgrna表达盒连接cpb
‑
ubi
‑
hspcas9载体
[0096]
将三个sgrna表达盒通过hd cloning kit试剂盒依次连接到pcpb
‑
zmubi:hspcas9的hindiii酶切位点间，获得crispr/cas9基因编辑载体，最终构建成的载体经过pcr测序验证无误后用于后续的遗传转化。
[0097]
实施例2 玉米遗传转化及zmsiz1s双突变体株系鉴定
[0098]
1.玉米遗传转化
[0099]
本实施例选取背景材料为zc01，通过对实施例1所构建的crispr/cas9基因编辑载体进行eha105农杆菌介导，以玉米幼胚为受体进行遗传转化，获得转化植株。
[0100]
取t0代转基因材料叶片提取dna，用bar基因引物：
[0101]5’‑
ccatcgtcaaccactacatcgagaca
‑3’
(seq id no.18)；
[0102]5’‑
cttcagcaggtgggtgtagagcgt
‑3’
(seq id no.19)进行pcr扩增检测阳性植株；阳性植株用引物5
’‑
gacaagcctcaattcatcagtgtt
‑3’
(seq id no.20),
[0103]5’‑
cagttcattcgcaacatcttagc
‑3’
(seq id no.21)对zmsiz1a目的片段进行扩增，用引物5
’‑
caagccagtaggttttgttatgc
‑3’
(seq id no.22)，5
’‑
atgtttcatgtcctatgtccctttc
‑3’
(seq id no.23)对zmsiz1b目的片段进行扩增，扩增产物进行测序鉴定。
[0104]
利用snapgene viewer软件将测序结果与目的基因序列进行比对，筛选得到两个zmsiz1a和zmsiz1b同时被编辑的突变体材料zmsiz1s
‑
#1和zmsiz1s
‑
#2：
[0105]
在zmsiz1s
‑
#1突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp(图1a)。
[0106]
在zmsiz1s
‑
#2突变体材料中，zmsiz1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。zmsiz1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导
致移码突变，提前出现终止子(图1b)。
[0107]
上述在zmsiz1s突变体中发生的碱基缺失突变，都导致zmsiz1a和zmsiz1b蛋白被成功敲除。
[0108]
2.对所获得的玉米转基因植株进行sumo化修饰能力鉴定
[0109]
将野生型和zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)种植在人工气候培养箱中，温度为28℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。10天后对幼苗进行42℃高温处理1小时，以未处理的幼苗为对照。取叶片样品提取蛋白，通过蛋白质免疫印迹法检测各样品中蛋白的全局性sumo化修饰水平。
[0110]
实验结果表明，与野生型相比，突变体植株叶片在热胁迫条件下全局性sumo化修饰能力严重受损(图2)
[0111]
3.对所获得的玉米转基因植株进行抗病性鉴定
[0112]
在实验室对野生型与zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)的籽粒进行抗病性鉴定。首先利用10％次氯酸钠溶液对玉米籽粒进行消毒；然后用刀片在籽粒表面划出约0.5cm长、0.5mm深的伤口；然后在籽粒表面滴加150μl含有0.01％吐温20的拟轮枝镰孢菌孢子悬浮液，其中孢子浓度为1
×
106个/ml。将接菌后的籽粒放入28℃培养箱中培养，期间保持湿润环境，3天后进行表型观察并统计孢子数。
[0113]
同时，将野生型与zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)分别种植于海南省三亚市乐东黎族自治县尖峰镇翁毛村万钟公司产学研示范园基地。在玉米雌穗吐丝后20天，利用注射器向果穗中下部进行接菌，接菌菌液为浓度为5
×
106个/ml的拟轮枝镰孢菌孢子悬浮液，每穗接种2ml菌液。待玉米果穗成熟后对发病表型进行观察。
[0114]
上述抗病性鉴定结果均显示，突变体籽粒在实验室条件(图3)和田间条件下(图4)均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明zmsiz1a和zmsiz1b蛋白对玉米蛋白发生sumo化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。