一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液的制作方法

1.本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液。


背景技术：

2.细胞冻存是将细胞放在低温环境、减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于
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196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入冻存保护剂，可以使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
3.传统冻存液在降温过程中需要采用“慢冻快融”的方法才能较好地保证细胞存活，标准冷冻速度开始为
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1～
‑
2℃/min，当温度低于
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25℃时可加速，到
‑
80℃之后可直接投入液氮内(
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196℃)。该过程中需要使用多种昂贵的低温冰箱设备，同时需要程序降温盒，时间周期长、操作复杂，不利于批量冻存操作，过程易出错；如果直接放进液氮，会导致细胞全部死亡。另外一种是“快冻快融”，叫玻璃化冻存，虽然可以直接放置液氮冻存，但冷冻液操作流程非常复杂，而且由于所用冻存液浓度高，对细胞损伤大，应用范围极有限，无法大范围推广。
4.基于此，发明人经过研究提供了一种新的冻存管结构，具体可参见申请日为2021年7月13日，申请号为202121595540.0的实用新型专利，发明人进一步采用现有的冻存液进行实验，发现复苏后细胞的活率和贴壁率仍旧不够理想。公知的，细胞的活率和贴壁率是冻存细胞效果评价的基本指标，提高细胞的活率和贴壁率对于后续实验研究具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为了进一步提高冻存细胞的活率和贴壁率，本发明的目的在于提供一种新的用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，其不同之处在于，包括含有渗透保护剂、细胞膜保护剂和细胞稳定剂的pbs缓冲液和添加剂，所述pbs缓冲液中渗透保护剂的体积百分比为5～10％，细胞膜保护剂的质量体积比为1～3％，细胞稳定剂的质量体积比为1～6％；所述添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、谷丙二肽和丙酮酸钠。
6.该冻存液不含有血清和蛋白，不存在病毒、支原体感染的风险，且配制方便，批间差异小，将其配合专用的冻存管用于细胞冻存，对细胞伤害小，细胞复苏后的活力和贴壁率均能达到85％以上。
7.作为本发明的一种实施方式，所述l
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谷氨酰胺的摩尔浓度为1～4mm，所述谷丙二肽的摩尔浓度为0.5～2mm，所述丙酮酸钠的摩尔浓度为0.5～2mm。
8.作为本发明的一种实施方式，所述渗透保护剂为二甲基亚砜、甘油、乙酰胺、乙二醇中的一种。
9.作为本发明的一种实施方式，所述细胞膜保护剂为海藻糖、蔗糖中的一种或两种。
10.作为本发明的一种实施方式，所述细胞稳定剂为羟乙基淀粉、糖酐中的一种或两种。
11.作为本发明的一种实施方式，所述糖酐为糖酐4万。
12.作为本发明的一种实施方式，所述冻存液还包括还原型谷胱甘肽，所述还原性谷胱甘肽的质量体积比为0.5～1％。
13.作为本发明的一种实施方式，所述冻存液包括含有乙酰胺、海藻糖和羟乙基淀粉的pbs缓冲液和添加剂，所述pbs缓冲液中乙酰胺的体积百分比为5％，海藻糖的质量体积比为2.5％，羟乙基淀粉的质量体积比为3％；所述添加剂包括l
‑
谷氨酰胺、谷丙二肽、丙酮酸钠和还原型谷胱甘肽，所述l
‑
谷氨酰胺的摩尔浓度为2mm，所述谷丙二肽的摩尔浓度为1mm，所述丙酮酸钠的摩尔浓度为1mm，所述还原性谷胱甘肽的质量体积比为0.8％。
14.本发明所提供的冻存液，成分明确，不含有血清和蛋白，批次稳定，且可以避免一些动物源蛋白对后续实验的影响；该冻存液配合专用的冻存管，可以一步到位的将细胞冻存在液氮中，适合批量操作，不涉及到昂贵仪器，节省成本；该冻存液中各成分含量普遍较低，对细胞的损伤小，毒性小，相较于传统冻存液复苏后存活率、贴壁率均较好，且可以长久的保存细胞。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
16.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
17.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
18.实施例1
19.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
20.海藻糖2.5％，
21.糖酐4万(厂家：上海源叶，货号s14110)2％，
22.羟乙基淀粉3％，
23.dmso 5％，
24.还原型谷胱甘肽0.8％，
25.l
‑
谷氨酰胺2mm，
26.谷丙二肽1mm，
27.丙酮酸钠1mm，
28.pbs余量。
29.实施例2
30.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
31.海藻糖2.5％，
32.糖酐4万2％，
33.羟乙基淀粉3％，
34.乙酰胺5％，
35.还原型谷胱甘肽0.8％，
36.l
‑
谷氨酰胺2mm，
37.谷丙二肽1mm，
38.丙酮酸钠1mm，
39.pbs余量。
40.实施例3
41.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
42.海藻糖2.5％，
43.糖酐4万2％，
44.羟乙基淀粉3％，
45.乙酰胺5％，
46.l
‑
谷氨酰胺2mm，
47.谷丙二肽1mm，
48.丙酮酸钠1mm，
49.pbs余量。
50.实施例4
51.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
52.海藻糖1％，
53.糖酐4万3％，
54.羟乙基淀粉1％，
55.dmso 8％，
56.还原型谷胱甘肽0.8％，
57.l
‑
谷氨酰胺1.5mm，
58.谷丙二肽1mm，
59.丙酮酸钠1mm，
60.pbs余量。
61.实施例5
62.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
63.海藻糖2.5％，
64.糖酐4万2％，
65.羟乙基淀粉3％，
66.dmso 5％，
67.还原型谷胱甘肽1％，
68.l
‑
谷氨酰胺4mm，
69.谷丙二肽2mm，
70.丙酮酸钠0.5mm，
71.pbs余量。
72.实施例6
73.本实施例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
74.海藻糖2.5％，
75.糖酐8万(厂家：上海源叶)2％，
76.羟乙基淀粉3％，
77.乙酰胺5％，
78.还原型谷胱甘肽0.8％，
79.m
‑
谷氨酰胺2mm，
80.谷丙二肽1mm，
81.丙酮酸钠1mm，
82.pbs余量。
83.对比例1
84.本对比例提供一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，具体组成如下：
85.海藻糖5％，
86.糖酐8万2％，
87.羟乙基淀粉3％，
88.dmso 3％，
89.还原型谷胱甘肽0.8％，
90.l
‑
谷氨酰胺2mm，
91.谷丙二肽1mm，
92.丙酮酸钠1mm，
93.pbs余量。
94.对比例2
95.本对比例采用的是传统冻存液，具体组成如下：
96.dmso 10％，
97.fbs 80％，
98.10％dm/f12培养基。
99.实验例
100.(1)取小鼠骨髓间充质干细胞，293t细胞，消化后收集离心，获得细胞沉淀，分别用实施例1～6和对比例1～2中冻存液重悬沉淀，将悬液放入液氮冻存专用冻存管(背景技术中所述冻存管)中，将冻存管直接放入液氮保存，保存30天后，取出冻存管，按照冻存管复苏流程放入37℃水浴溶解复苏，用专用培养基接种6孔板内，并取50～100μl细胞进行台盼蓝染色计数细胞活率，第24h观察细胞贴壁率，结果如下表1所示。
101.(2)取小鼠骨髓间充质干细胞，293t细胞，获得沉淀，按传统冻存方法，将细胞分别用实施例1～6和对比例1～2中的冻存液重悬在普通冻存管中，冻存管放入专用梯度降温盒，将降温盒放在4℃冰箱稳定30min，在转移至
‑
80℃冰箱存放24h，然后将冻存管挑出转移至液氮保存，保存30天后，取出冻存管，按传统冻存管挑出转移至液氮保存，保存30天后，取
出冻存管，按传统流程复苏，用专用培养基接种于6孔板内，并取50～100μl细胞进行台盼蓝染色计数细胞活率，第24h观察细胞贴壁率，结果如下表1所示。
102.表1细胞活率和贴壁率结果
[0103][0104]
由上述结果可知：
[0105]
当采用本技术所述的冻存液和普通冻存管进行冻存时，其细胞复苏后的染色活率和贴壁率均较低，最高仅能达到70％；
[0106]
当其配合采用特定的冻存管时，实施例1～6中的冻存液冻存的细胞复苏后其染色活率和贴壁率均能达到85％以上，其中染色活率最优可以达到92％，贴壁率最优可以达到96％；
[0107]
而当对本技术中成分进行调整后，其染色活率和贴壁率均会显著下降，这可能是因为不同成分对细胞作用不同，各成分的浓度对细胞有着重要的影响；
[0108]
通过实施例2和实施例3的结果可知，谷胱甘肽主要作为一种营养成分，在本冻存液中对细胞复苏后的染色活率和贴壁率影响不大。
[0109]
发明人通过实验还发现，当将实施例1～6所述的冻存液采用直接放入到液氮中进行冻存(不采用冻存管)时，细胞复苏后的染色活率和贴壁率最高仅能达到40％。
[0110]
本发明所提供的冻存液，能够特定的用于发明人自行研发出的冻存管，两者配合使用，可以一步到位的将细胞冻存在液氮中，适合批量操作，且对细胞的伤害小，复苏后细
胞能保持很好的活率和贴壁性。
[0111]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。