用于对虾肝肠孢虫荧光定量PCR检测的引物及方法与流程

用于对虾肝肠孢虫荧光定量pcr检测的引物及方法
技术领域
1.本发明涉及一种对虾肝肠孢虫荧光定量pcr快速检测方法，属于水生生物病原检测技术领域。


背景技术：

2.虾肝肠孢虫(enterocytozoonhepatopenaei,ehp)是一类专性细胞内寄生的微孢子虫，主要感染养殖对虾的肠道表皮及肝胰腺，寄生于肝胰腺小管上皮细胞。其感染致使对虾消化吸收功能下降，影响了营养物质的吸收，感染早期无明显症状和死亡，较难发现，通常在养殖30～45d后可见养殖对虾呈现生长缓慢，大小不一等现象。且对虾个体生长速率与体内ehp的载量指数呈显著的负相关。此外，ehp感染还会增加南美白对虾对急性肝胰腺坏死(acute hepatopancreatic necrosis disease，ahpnd)和感染性肝胰腺坏死(septic hepatopancreatic necrosis，shpn)病原的易感性，从而增加ahpnd和shpn的发病几率。因此ehp感染极大的危害了对虾养殖产业的健康发展。
3.ehp最早于2004年作为一种未知微孢子虫在泰国生长缓慢的斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞内被发现。2009年获得分类和命名，被认为是肠上皮细胞微孢子虫属的一个新种。到目前为止，包括中国在内的泰国、越南、印度、印度尼西亚和马来西亚等东南亚各国均报道了ehp感染南美白对虾或斑节对虾，且出现了大范围内的流行，对于ehp的感染目前尚无有效的治疗和防控方法，因此建立灵敏度高，特异性强的快速检测技术对于病原的防控尤为重要。
4.ehp虫体长度约0.7～1.1um，常规光学镜检较难发现，目前已建立的快速检测技术主要以其ssu rrna序列为靶基因，被认为会有假阳性问题，不利于病原监测。而以其孢壁蛋白swp序列为靶基因进行的检测，具有较高的特异性。目前已建立以swp为靶基因的nested
‑
pcr检测技术，但该技术只能用于定性检测，且操作繁琐，需要多对引物进行多次扩增反应，耗时较长。因此建立以swp为靶基因的快速、简便的定量检测技术和诊断方法至关重要。


技术实现要素：

5.本发明针对上述问题，以ehp孢壁蛋白swp为靶基因设计引物，探索最佳反应条件和反应体系建立荧光定量pcr方法。该方法特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确的定量检测，适用于对虾肝肠孢虫的监测、诊断和早期预防。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：
7.本发明提供了一种用于荧光定量检测对虾肝肠孢虫swp的引物，该引物包含：
8.引物ehp146f的核苷酸序列如seqidno.1所示；
9.引物ehp146r的核苷酸序列如seqidno.2所示；
10.扩增核苷酸序列如seqidno.3所示。
11.本发明提供了一种用于检测含对虾肝肠孢虫swp全长orf序列的标准品试剂盒，所述试剂盒包含swp标准质粒(101～107)以及权利要求1所述的特异性引物；本实施方式根据
ncbi提供的ehp
‑
swp序列，设计引物，pcr扩增获得ehp
‑
swp的orf全长，连接载体后，转化克隆感受态；挑取阳性克隆，扩培后提取质粒，测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算出每微升质粒的拷贝数；梯度稀释质粒建立标准品，使质粒拷贝数分别为101～107copies/ul。
12.本发明提供了阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品为含ehp
‑
swp质粒的菌株悬液，阴性质控品为含空载体的菌株悬液。
13.本发明提供一种采用上述引物组用于检测ehpswp的方法，该方法包括以下步骤：
14.1)样本的采集及dna提取：幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体，大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺。样品采集10～50mg，采用qiagendnaminikit试剂盒，严格按试剂盒说明提取总dna。
15.2)将提取的样品dna、标准质粒(101～107)、阳性质控品和阴性质控品置于荧光定量pcr反应体系中进行pcr扩增及荧光信号监测。所述荧光定量pcr反应体系总体积为25ul。包括tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)(2*)12.5ul，ehp146f和ehp146r所述序列的引物各1.25ul，模板(目的样品dna或标准质粒)1ul，灭菌水9ul。
16.3)荧光定量pcr扩增反应程序为95℃30s；40个循环，95℃5s，51℃30s。
17.4)所述方法还包括阳性对照和阴性对照，其反应体系中分别使用阳性对照质控品和阴性对照质控品作为模板。所述方法还包括无模板对照。
18.5)结果判断：根据标准质粒cq值绘制标准曲线，根据标准曲线及目标样品扩增的cq值，计算目标样品所含ehp拷贝数。样品cq<35且有明显s型扩增曲线，结果为阳性，可结合标准曲线计算ehp感染拷贝数；样本cq本贝数且无明显s型扩增曲线，结果为阴性。阳性质控品cq值<35且有明显s型扩增曲线，同时阴性质控品和无模板对照cq模板对且无明显s型扩增曲线，判断结果有效。阳性质控品cq值≥35或阴性质控品和无模板对照cq值<35，反应无效
19.本发明与现有技术相比，具有如下优点：
20.本发明根据ehpswp序列设计引物，提供一种以swp为靶位点的实时荧光定量pcr检测方法，通过绝对荧光定量pcr技术检测swp基因检测ehp的感染。本发明避免了以ssu基因为靶点进行检测的假阳性问题，具有较高的特异性；和已建立的nested
‑
pcr检测技术相比，提高了检测的灵敏度，检测最低拷贝数达到101,极大的缩短了检测时间，全部反应可在2h内完成。此外实现了定量检测，适用于ehp的检测和诊断，在ehp感染监测、流行病学研究及探讨ehp感染机制及其与宿主相互关系的研究中，具有较高的应用价值。
附图说明
21.图1为本发明实施案例1中引物熔解曲线图；
22.图2为本发明实施案例1中梯度稀释标准质粒实时荧光定量pcr扩增曲线图；
23.图3为本发明实施案例1中梯度稀释标准质粒实时荧光定量pcr构建的标准曲线图；
24.图4为本发明实例案例1中ehp阳性和阴性质控品、无模板对照实时荧光定量pcr扩增曲线图；
25.图5为本发明实施案例1中检测样本扩增曲线图；
26.图6为本发明实施案例1种检测样本cq值在标准曲线上的位置；
27.图7为本发明引物特异性检测图。
具体实施方式
28.以下结合实施例对本发明的原理与特征进行描述，所举实施案例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换。
29.下述实施案例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.下述实施案例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
31.下述实施案例中dna提取试剂盒购自qiagen生物技术有限公司。
32.下述实施案例中引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
33.下述实施案例中的定量实验，均做3个复孔，结果取算术平均值。
34.实施案例1
35.本实施案例中涉及的pmd19t克隆载体、dh5α克隆感受态和稀释质粒构建标准品用的easydilution购自takara生物技术有限公司
36.本实施案例中涉及的ehpswp序列信息已在ncbi公开。
37.本实施案例构建ehp
‑
swp标准质粒，主要步骤如下：
38.1)提取ehp自然感染南美白对虾肝胰腺总dna；
39.2)根据ncbi公布的ehp
‑
swp序列设计引物，pcr扩增获得ehp
‑
swporf序列；
40.3)连接pmd 19t质粒，转化dh5α；
41.4)测序鉴定获得阳性克隆，扩大培养后，提取质粒；
42.5)nanodrop核酸测定仪测定质粒浓度，根据阿伏加德罗常数换算ehp感染拷贝数；
43.6)采用easydilution 10倍梯度稀释质粒，使其拷贝数为101～107构建标准品；
44.7)采用测序鉴定正确的swp克隆菌株的菌悬液为阳性对照质控品，采用含pmd19t空载体的克隆菌株的菌悬液为阴性对照质控品。
45.实施案例2特异性引物的筛选
46.在初筛的基础上最终确定了以下2对引物进行多组对比实验：
47.引物对1ehp146f：tggcggcacaattctcaa
48.ehp146r：gctgtttgtctccaactgta
49.引物对2f：tggcggcacaattctcaaacat
50.r：gctgtgtctgtgtaaatatcgtctc
51.本实施案例中tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)(2*)购自takara生物技术有限公司
52.本实施案例通过构建标准曲线，检测南美白对虾仔虾(<2cm)和“生长迟缓”的南美白对虾成虾中ehp感染量，具体步骤如下：
53.1、样品采集和dna提取：幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体，大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺。样品采集10～50mg，采用qiagendnaminikit试剂盒严格按试剂盒说明提取样品总dna。
54.2、荧光定量pcr检测：
55.1)反应体系如下，总体积25ul：tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)
(2x)：12.5ul，引物对的引物各1.25ul，模板1ul，灭菌水9ul。
56.模板分别为标准质粒(101‑
107copies/ul)、样品dna、阴性质控品和阳性质控品，每一个反应设3个重复孔，设立无模板对照。
57.2)扩增反应程序：95℃30s，1个循环；95℃5s，51℃30s(收集荧光)，40个循环；
58.3)结果判定(根据cq值)：根据梯度稀释的标准质粒(101‑
107copies/ul)构建标准曲线，样本结果判断如下
59.经实验，两组引物对实际使用效果差异如下：
[0060][0061]
根据特异性高，cq值小，检测限量值小，可重复性好的筛选原则，决定采纳引物对1为最终检测引物。
[0062]
实施案例3
[0063]
本实施案例中tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)(2*)购自takara生物技术有限公司
[0064]
本实施案例通过构建标准曲线，检测南美白对虾仔虾(<2cm)和“生长迟缓”的南美白对虾成虾中ehp感染量，具体步骤如下：
[0065]
1、样品采集和dna提取：幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体，大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺。样品采集10～50mg，采用qiagendnaminikit试剂盒严格按试剂盒说明提取样品总dna。
[0066]
2、荧光定量pcr检测：
[0067]
1)反应体系如下，总体积25ul：tb green premix ex taq ii(tlirnaseh plus)(2x)：12.5ul，ehp146f和ehp146 r所述序列的引物各1.25ul，模板1ul，灭菌水9ul。
[0068]
模板分别为标准质粒(101‑
107copies/ul)、样品dna、阴性质控品和阳性质控品，每一个反应设3个重复孔，设立无模板对照。
[0069]
2)扩增反应程序：95℃30s，1个循环；95℃5s，51℃30s(收集荧光)，40个循环；
[0070]
3)结果判定(根据cq值)：根据梯度稀释的标准质粒(101‑
107copies/ul)构建标准曲线，样本结果判断如下
[0071][0072]
上述实验结果如图1
‑‑
图6所示。
[0073]
图1为引物熔解曲线图，结果显示为单峰，表明没有非特异性扩增。
[0074]
图2和图3为本发明实施案例1中标准质粒实时荧光定量pcr扩增曲线和构建的标准曲线图，横坐标代表lg质粒拷贝数(x)，纵坐标为cq值，构建标准曲线为cq＝
‑
3.233lgx 37.608,扩增效率e为103.9％，相关系数为r2＝0.999。90％<e<105％，r2>0.98,且各梯度重复样本间cq值的标准差均小于0.2，表示定量准确，可用于检测位置样品。
[0075]
图4为本发明实例案例1中ehp阳性和阴性质控品、无模板对照实时荧光定量pcr扩增曲线图，结果表明阳性质控品cq值为19.89<35且有明显s型扩增曲线，阴性质控品和无模板对照无扩增，表明本实验结果有效。
[0076]
图5和图6为本发明实施案例1中检测的两个样本扩增曲线及其在标准曲线上的位置。结果表明成虾提取的dnacq值为20.28，根据标准曲线计算所得拷贝数为2.29*105，仔虾dnacq值为28.50，根据标准曲线计算所得拷贝数为6.57*102。
[0077]
实施案例3
[0078]
本实施案例提取ihhnv、shiv、wssv阳性感染样本和spf虾样本总dna作为模板，进行荧光定量pcr检测，使用阳性质控品作为阳性对照，检测方法和检测体系如实施案例2。其结果如图7所示，仅阳性质控品出现扩增，其他样品均未出现条带，表明建立的方法具有高度的特异性。
[0079]
综上，本发明以ehp
‑
swp为靶基因设计引物建立ehp荧光定量pcr检测方法。该方法具有较高的特异性和灵敏度，操作简便，快速，且可用于ehp感染的定量检测，适用于ehp感染的早期诊断和实时监测，适用于ehp病原学及其与宿主间相互关系的相关研究。
[0080]
上述实施例仅示例说明本发明的原理及应用，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
[0081]
[0082]