一株伯克霍尔德氏菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株伯克霍尔德氏菌菌株及其应用，具体涉及一株具有溶磷作用的伯克霍尔德氏菌菌株ycyp9及其在油茶苗木生长中的应用。


背景技术：

2.油茶(camellia olefera)是山茶科(theacae)山茶属(camellia)中种子含油量高、具有生产价值的油用物种的总称，是我国特有的优质木本油料树种，与油棕、椰子和油橄榄并称为世界四大木本油料树种。我国现有油茶栽培面积6800万亩，主要分布于南方14个省(区)，产业总产值达1160亿元，油茶种子榨取的茶油风味独特，营养丰富，脂肪酸组成合理，不饱和脂肪酸含量高达90％，油酸含量80％以上，不含人体难以吸收的芥酸和山俞酸，也不含会引起人体血压增高而导致血管硬化的胆固醇，油质优于橄榄油等其它食用油，是理想的食用油。油茶适应性广、耐瘠薄，是南方低山、丘陵和岗地很好的经济林树种之一，不与粮、棉争地，而且还具有一年种植，多年受益的特点，丰产期长达80年，在我国南方农村经济和生态建设中占有很重要的地位。
3.大苗繁育是提高油茶种植成活率的主要手段之一，油茶大苗的营养生长在育苗地完成,定植时就有了基本的树形结构,可缩短进入结果期时间,减少了土地资源的浪费
4.。同时，常规苗木在出圃挖掘过程中,根系都会受到伤害,需要缓苗重新萌发新根,受伤较重的成活率低，而大苗根系始终在容器内生长,定植时不会破坏苗木根系团,栽后可继续生长,无缓苗期,成活率几乎百分之百，所以大苗在油茶栽植中优势明显。在大苗繁育过程中微生物菌剂因其绿色高效而被广泛使用，但目前针对油茶大苗繁育的菌剂却鲜有报道，更无可应用的成品。


技术实现要素：

4.本发明旨在克服现有技术的不足，提供一株伯克霍尔德氏菌菌株及其应用。
5.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
6.本发明在湖南省多地区采集油茶根际土，使用pko培养基(葡萄糖10.0g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，mnso4·
h2o 0.03g，ca3(po4)
3 2.0g，caco
3 1.0g，琼脂20.0g)筛选溶解无机磷菌株；使用蒙金娜培养基(葡萄糖10.0g，(nh4)2so
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.3g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，mnso4·
h2o 0.03g，卵磷脂0.2g，caco
3 1.0g，酵母粉0.5g，琼脂20.0g)筛选有机磷菌株。研究中发现了1株同时具有溶解无机磷和有机磷的功能菌株，命名为：伯克霍尔德氏菌(burkholderia sp.)ycyp9，该菌株于2021年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国
·
武汉)，菌种保藏号：cctcc no:m 2021733。该菌株具有同时溶解无机磷和有机磷的功能，可用于制备溶磷制剂。同时，该菌株还具有促进油茶苗木生长的功能，可用于制备油茶苗木生长促进剂。
7.下面对本发明作进一步说明：
8.本发明中，溶磷能力的定性实验采用溶磷圈法测定，将菌株分别点接在培养基中，每个菌株三个重复，培养3d后，测量溶磷圈d及菌落的直径d。当d/d的比值大于1时，代表接种的菌株有溶磷能力。ycyp9菌株点接到含磷平板中，培养3d后菌株直径(d)为1.30
±
0.12cm，溶磷圈直径(d)为3.70
±
0.37cm，溶解磷含量(d/d)为2.85
±
0.38。溶磷强度测定采用钼酸铵比色法测定，将有溶磷圈的菌株接种到液体培养基中过夜活化菌株。配置分别含磷酸钙和蛋黄卵磷脂的液体培养基，分装为50ml，调节ph＝7.0，2％接菌量，28℃，160r/min，7d。菌液10000r/min离心15
‑
18min，取上清液用流动分析仪测培养液中有效磷含量。标准溶液的配制：磷标准储备液(1000mg/l)：105℃烘干2h的kh2po
4 4.394g定容至1l。磷标准工作液(100mg/l)：取10ml储备液溶于100ml容量瓶中，摇匀备用。标准曲线：分别取磷标工作液0、1、2、4、6、8、10、20ml加入到100ml容量瓶中，定容。其浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、20mg/l。研究发现ycyp9对无机磷ca3(po4)2的溶解量为31.82mg/l；对有机磷(蛋黄卵磷脂)的溶解量为4.25mg/l。菌株鉴定结果为burkholderia sp.将菌株应用到油茶苗木中，使用lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph调至7.4左右)培养菌株，使菌液活菌数达到107cfu/ml，将50ml菌液加入到2年生容器苗中，以lb培养基做对照，每个处理15株苗木。生长三个月后，对照处理的苗高为62.50
±
4.32，地径7.98
±
1.45，春梢数量14.13
±
1.14；ycyp9处理后的油茶苗高为75.78
±
5.54，地径8.81
±
1.99，春梢数量24.11
±
2.22，ycyp9使油茶苗木苗高增加21.25％，地径增加了10.40％，春梢数量增加了70.69％。
附图说明
9.图1为菌株对油茶幼苗生长量的影响。
具体实施方式
10.利用选择性培养基及菌落形态差异初步筛选出溶解无机磷菌株14株(ycwp1
‑
14)、溶解有机磷菌株16株(ycyp1
‑
16)。将溶磷菌株点接到含磷平板中，培养3d后观察菌落大小及溶磷圈大小，实验结果表明仅有7株菌株出现溶磷圈即具有溶磷能力，其中ycyp9和ycyp15的溶磷能力较强(表1)。
11.表1 溶磷能力定性研究(d/d)
[0012][0013]
将7株菌株进行溶磷能力的定量测定，结果表明具有溶解无机磷ca3(po4)2能力的菌株有5株，其中溶解能力最强的菌株为ycyp9，对磷的溶解量为31.82mg
·
l
‑1；能够溶解有机磷(蛋黄卵磷脂)的菌株仅有5株，其中溶解能力最强的菌株也为ycyp9，其溶解有机磷的量为4.25mg
·
l
‑1(见表2)。
[0014]
表2 溶磷能力定量研究
[0015][0016]
以油茶“湘林210”扦插苗为研究对象，将筛选出的菌株进行苗木促生效果研究，研究结果如图1所示，ycyp9与对照相比显著促进了油茶苗高和春梢的增长，ycyp9处理后的油茶苗高均值为75.78，地径均值为8.81，春梢数量24.11，ycyp9使油茶苗木苗高与对照相比增加21.25％，地径增加了10.40％，春梢数量增加了70.69％。


技术特征：
1.一株伯克霍尔德氏菌菌株，其特征在于，所述菌株分类学命名为：伯克霍尔德氏菌（burkholderia sp.）ycyp9，保藏号为：cctcc no: m 2021733。2.如权利要求1所述的菌株在制备溶磷制剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述溶磷制剂是同时溶解无机磷和有机磷的制剂。4.如权利要求1所述的菌株在制备油茶苗木生长促进剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一株伯克霍尔德氏菌菌株及其应用，所述菌株分类学命名为：伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）YCYP9，保藏号为：CCTCC NO:M 2021733。该菌株具有同时溶解无机磷和有机磷的功能，可用于制备溶磷制剂。同时，该菌株还具有促进油茶苗木生长的功能，可用于制备油茶苗木生长促进剂。茶苗木生长促进剂。


技术研发人员：刘彩霞 徐婷 王瑞 陈隆升 何之龙 唐炜 陈永忠
受保护的技术使用者：湖南省林业科学院
技术研发日：2021.07.08
技术公布日：2021/10/26