一种从生物碱浸膏中分离纯化的樟柳碱及其制备方法与流程

1.本发明涉及医药制剂技术领域，具体而言，涉及一种从生物碱浸膏中分离纯化的樟柳碱及其制备方法。


背景技术：

2.樟柳碱是托品烷生物碱的成分之一，也可以被称作1
‑
羟基东莨菪碱，是从华山参中提取的一种生物碱，简称at
‑
3，其化学结构与樟柳碱，东莨菪碱相似。樟柳碱的中枢抗胆碱作用较强，对大脑皮层有抑制作用，对外周则表现为胆碱能神经的阻滞作用，能解除血管痉挛，改善病损区的微循环及局部营养代谢，使病损区黏膜达到正常角化，促进炎症恢复，有消除口腔斑纹等功能。更为重要的是，樟柳碱的毒性较其他抗胆碱药如莨菪，东莨菪较小，因此具有更好的药理应用价值。最近，科学家还发现，樟柳碱对油酸所引起的急性肺损伤和急性肾衰时肾微血管的损伤具有保护作用，说明樟柳碱有着更为巨大的商业和医药价值。
3.目前，制备樟柳碱的方法主要是通过化学合成方法，以及从华山参中进行提取。但是，化学合成法成本太高，合成步骤繁多，而且也容易对环境造成污染。因此，为了保障樟柳碱的质量一般采用从华山参中提取有效成分。但是，传统的提取方法所获得的樟柳碱的纯度不高，会影响樟柳碱的药效。因此，如何提高樟柳碱的纯度，从而保障樟柳碱的药用效果是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，该制备方法将生物碱浸膏中的有效成分通过分级层析的方式进行纯化分离得到高纯度的樟柳碱，且该制备方法操作简单，适用于大规模生产，所用到的洗脱液、层析液等可进行回收利用，在节约资源的同时也能降低生产成本。
5.本发明的另一目的在于提供一种樟柳碱，该樟柳碱通过多次层析将其从华山参中分离出来，其品质和生理活性较好，且纯度较高，具有良好的药用效果，医药价值较高。
6.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.本发明提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：用浸提法从华山参中获得生物碱浸膏，生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为200
‑
300目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
8.本发明提出一种樟柳碱，上述樟柳碱利用上述从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法制成。
9.本发明实施例的樟柳碱、从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法至少具有以下有益效果：
10.一方面，本明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，该制备方法用提取剂浸渍华山参，将其内含有的有效成分提取至提取剂中，然后再经过过滤浓缩得到生物碱浸膏。生物碱浸膏中的可溶性有效成分溶解于水中，再将mci凝胶加入该混合液中搅拌，搅拌均匀后倒入玻璃柱内进行层析。各成分之间分子大小不同，因而在mci凝胶上受阻滞的程度不同，当混合液流过mci凝胶层析柱时，有效成分被混合液带过，并以不同速度向前移动。经过一定的层析时间后，不同组分移动的距离有较明显的差异，被分离成不同的色带，同一色带集中同一种物质，将其物质所对应的色带取下并用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，此过程中将生物碱浸膏中的物质进行初步分离，得到莨菪碱和东莨菪碱的混合物，即洗脱液一。
11.洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱得到洗脱液二，且硅胶柱的硅胶粒子为200
‑
300目。洗脱液一经过硅胶柱层析后用氯仿/甲醇溶液洗脱分离出山莨菪碱和樟柳碱的混合液，即得到洗脱液二。氯仿/甲醇溶液作为提取溶液，在使得洗脱液一中的有效成分游离出来的同时，使其与提取溶液之间的亲和性增大，增大其结合强度从而有效地提取出全部的有效成分，经过过滤排除其余成分，回收溶剂得到洗脱液二，此时洗脱液二中主要为山莨菪碱和樟柳碱的混合液。
12.洗脱液二再经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。丙酮与石油醚的功能各异作用互补：第一阶段，丙酮和石油醚将山莨菪碱和樟柳碱溶解于层析液中，丙酮可以增加樟柳碱在层析液中的溶解能力。第二阶段，石油醚携带樟柳碱以最快的速度进行扩散，如此就可以将樟柳碱分离出来。
13.上述制备方法中通过一级一级的层析处理将生物碱浸膏中的各组分进行分离纯化，最后获得纯度较高的樟柳碱。该制备方法只是将生物碱浸膏中的有效成分通过分级层析的方式进行纯化分离，没有经过其他的加工处理，因而保持了樟柳碱的品质和活性，且提高了樟柳碱的纯度，从而提高了樟柳碱的治疗效果。而且，该制备方法操作简单，适用于大规模生产，所用到的洗脱液、层析液等可进行回收利用，在节约资源的同时也能降低生产成本。
14.另一方面，本发明还提供一种樟柳碱，本发明实施例中的樟柳碱利用上述从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法制成。该樟柳碱的提取过程中，没有经过高温等其余处理步骤，只是通过多次层析将其从华山参中分离出来，其品质和生理活性较好，且纯度较高，具有良好的药用效果，医药价值较高。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
16.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
17.一方面，本发明提供一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：用浸提法从华山参中获得生物碱浸膏，生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲
醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过200
‑
300目的硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
18.用提取剂浸渍华山参将其内的有效成分提取至提取剂中，然后再经过滤浓缩得到生物碱浸膏。生物碱浸膏中的可溶性有效成分溶解于水中，再将80
‑
100目的mci凝胶加入该混合液中搅拌，搅拌均匀后倒入玻璃柱内进行层析。各成分之间分子大小不同，因而在mci凝胶上受阻滞的程度不同，当混合液流过mci凝胶层析柱时，有效成分被混合液带过，并以不同速度向前移动。经过一定的层析时间后，不同组分移动的距离有较明显的差异，被分离成不同的色带，同一色带集中同一种物质，将其物质所对应的色带取下并用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，此过程中将生物碱浸膏中的物质进行初步分离，得到莨菪碱和东莨菪碱的混合物，即洗脱液一。
19.详细地，本发明实施例中，采用甲醇/乙腈/水的混合液作为洗脱剂，其中甲醇、乙腈和水的质量比为(10
‑
13):2:35。水是极性大的溶剂，甲醇是极性较小的溶剂，后者的加入可以降低分离物质的r
f
值，乙腈起着混合整个系统及降低洗脱剂黏度的作用，该比例下的混合洗脱剂相对于单一的洗脱剂来讲，能使得生物碱溶液中各组分之间分离的更为彻底，且分离速度较快。
20.洗脱液一经过200
‑
300目的硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱得到洗脱液二。洗脱液一经过硅胶柱层析后用氯仿/甲醇溶液洗脱分离出山莨菪碱和樟柳碱的混合液，即得到洗脱液二。详细地，本发明实施例中，氯仿与甲醇的质量比为(25
‑
30)：1。该比例下的氯仿/甲醇溶液作为提取溶液，在使得洗脱液一中的有效成分游离出来的同时，使其与提取溶液之间的亲和性增大，增大其结合强度从而有效地提取出全部的有效成分，经过过滤排除其余成分，回收溶剂得到洗脱液二，此时洗脱液二中主要为山莨菪碱和樟柳碱的混合液。
21.洗脱液二再经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。详细地，本发明实施例中，丙酮与石油醚的质量比为(1
‑
2)：1。该比例下的混合溶液中，丙酮与石油醚的功能各异作用互补：第一阶段，丙酮和石油醚将山莨菪碱和樟柳碱溶解于层析液中，丙酮可以增加樟柳碱在层析液中的溶解能力。第二阶段，石油醚携带樟柳碱以最快的速度进行扩散，如此就可以将樟柳碱分离出来。
22.上述制备方法中通过一级一级的层析处理将生物碱浸膏中的各组分进行分离纯化，最后获得纯度较高的樟柳碱。该制备方法只是将生物碱浸膏中的有效成分通过分级层析的方式进行纯化分离，没有经过其他的加工处理，因而保持了樟柳碱的品质和活性，且提高了樟柳碱的纯度，从而提高了樟柳碱的治疗效果。而且，该制备方法操作简单，适用于大规模生产，所用到的洗脱液、层析液等可进行回收利用，在节约资源的同时也能降低生产成本。
23.进一步地，本发明实施例中，上述生物碱浸膏的制备方法包括以下步骤：用乙醇浸提华山参3
‑
4次后过滤合并滤液，滤液减压浓缩得到浸膏，浸膏调节ph至1
‑
3后静置5
‑
6小时抽滤，然后再调节ph至9
‑
10静置5
‑
6小时后得到原液，用氯仿萃取原液，然后减压浓缩后回收氯仿得到生物碱浸膏。本发明实施例中，根据相似相溶的原理采用乙醇为提取剂，将乙醇加入华山参中浸泡一定的时间后将其过滤得到一次滤液和一次滤渣，再向一次滤渣中加入乙醇进行二次浸泡，浸泡一定时间后将其过滤得到二次滤液和二次滤渣，每次皆以上次滤渣为原料加入乙醇进行浸泡，如此浸提3
‑
4后将所有滤液进行混合，并将滤液进行浓缩得到
浸膏，此时浸膏中含有生物碱等多种可溶性活性物质。然后将浸膏调节ph至1
‑
3后，浸膏中的生物碱与酸结合成盐而溶于酸中，静置5
‑
6小时后浸膏中除生物碱外的其他物质沉淀，抽取滤液即得到生物碱盐。然后将滤液调节ph至9
‑
10可使得生物碱变成游离态，静置5
‑
6小时即可使得生物碱盐完全转化成游离态的生物碱，便于后期的分离提纯操作。
24.详细地，对华山参浸提的过程中采用体积分数为90
‑
95％vol的乙醇溶液。根据相似相溶原理，随着乙醇浓度的增加，活性物质的提取量逐渐增加。但是，当浓度大于95v/v％时，乙醇溶剂中的水含量减少，溶剂极性减弱，不利于对生物碱的提取，其活性物质的提取率下降。因此，选择乙醇的体积分数为90
‑
95％vol较合理。
25.进一步地，上述浸提步骤中，乙醇于35
‑
40℃的温度下浸提华山参。该温度下，可加快分子的运动速率，同时可以引起细胞膜结构发生变化导致其渗透、扩散、溶解速度加快。而且，该温度下乙醇的蒸发速率较慢，可以保证提取剂中乙醇的含量，保持乙醇的提取效率。另外，该温度下提取华山参，可以避免高温破坏生物碱的结构，保持生物碱的质量和活性。
26.为了提高华山参中生物碱的溶出率，本发明实施例中，在华山参浸提的同时进行超声处理。在华山参整个浸提的过程中进行超声处理，超声波会产生大量的微气泡，微气泡爆炸时产生的冲击波和微射流在固液体系中起到很好的冲击作用，增强分子间相互碰撞和聚集的能力，加剧流体的运动，从而提高华山参与提取剂的接触面积，防止华山参聚集而使得部分生物碱未能被完全提取。超声波处理不仅可以提高华山参中生物碱的溶出率，还可以缩短生物碱的提取时间。本发明实施例中，超声处理的功率为30
‑
100w，超声时间为2
‑
3小时。该超声条件下，不但可以保持提取剂在合适的温度，避免过大的功率或过长的时间使得提取剂升温而产生副产物影响生物碱的纯度，而且还能延长仪器的使用寿命。
27.进一步地，为了提高生物碱的溶出率，本发明实施例中，将华山参进行研磨，研磨后过筛，过筛的目数为80
‑
100目。将华山参研磨成小颗粒后可以增加提取剂与华山参的接触面积，提高生物碱溶出率的同时，还可以缩短提取时间。而且，该目数下能够避免由于粒径过小而使得颗粒之间的表面结合能过大而相互聚合，该目数下的颗粒在提取剂中的分散程度较好，可以提高生物碱的溶出率。
28.另一方面，本发明还提供一种樟柳碱，本发明实施例中的樟柳碱利用上述从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法制成。该樟柳碱的制取过程中，没有经过高温等其余处理步骤，只是通过多次层析将其从华山参中分离出来，其品质和生理活性较好，且纯度较高，具有良好的药用效果，医药价值较高。
29.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
30.实施例1
31.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：
32.预处理：将华山参经过研磨、过筛处理，过筛目数为80目。
33.生物碱的浸提：用体积分数为95％vol的乙醇于40℃的温度下浸渍上述预处理后的华山参，然后过滤得到滤液和滤渣，然后向滤渣内加入上述乙醇浸渍，再次过滤，如此循环操作对华山参进行浸提。另外，在浸渍的过程中进行超声波处理。
34.生物碱浸膏的制备：利用上述方法浸提华山参4次，然后合并滤液，将混合后的滤
液减压浓缩得到浸膏，浸膏调节ph至3后静置6小时抽滤，然后再调节ph至10静置6小时后得到原液，用氯仿萃取原液，然后减压浓缩后回收氯仿得到生物碱浸膏。
35.樟柳碱的提纯：生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为200目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
36.需要说明的是，上述甲醇/乙腈/水的混合液中，甲醇、乙腈和水的质量比为10:2:35，上述氯仿/甲醇溶液中，氯仿和甲醇的质量比为25：1。
37.实施例2
38.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：
39.预处理：将华山参经过研磨、过筛处理，过筛目数为100目。
40.生物碱的浸提：用体积分数为90％vol的乙醇于35℃的温度下浸渍上述预处理后的华山参，然后过滤得到滤液和滤渣，然后向滤渣内加入上述乙醇浸渍，再次过滤，如此循环操作对华山参进行浸提。另外，在浸渍的过程中进行超声波处理。
41.生物碱浸膏的制备：利用上述方法浸提华山参3次，然后合并滤液，将混合后的滤液减压浓缩得到浸膏，浸膏调节ph至1后静置5小时抽滤，然后再调节ph至9静置5小时后得到原液，用氯仿萃取原液，然后减压浓缩后回收氯仿得到生物碱浸膏。
42.樟柳碱的提纯：生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为300目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
43.需要说明的是，上述甲醇/乙腈/水的混合液中，甲醇、乙腈和水的质量比为13:2:35，上述氯仿/甲醇溶液中，氯仿和甲醇的质量比为30：1。
44.实施例3
45.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：
46.预处理：将华山参经过研磨、过筛处理，过筛目数为90目。
47.生物碱的浸提：用体积分数为93％vol的乙醇浸渍上述预处理后的华山参，然后过滤得到滤液和滤渣，然后向滤渣内加入上述乙醇浸渍，再次过滤，如此循环操作对华山参进行浸提。
48.生物碱浸膏的制备：利用上述方法浸提华山参4次，然后合并滤液，将混合后的滤液减压浓缩得到浸膏，浸膏调节ph至2后静置5.5小时抽滤，然后再调节ph至9静置5.5小时后得到原液，用氯仿萃取原液，然后减压浓缩后回收氯仿得到生物碱浸膏。
49.樟柳碱的提纯：生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为260目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
50.需要说明的是，上述甲醇/乙腈/水的混合液中，甲醇、乙腈和水的质量比为12:2:35，上述氯仿/甲醇溶液中，氯仿和甲醇的质量比为28：1。
51.实施例4
52.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步
骤：
53.预处理：将华山参经过研磨、过筛处理，过筛目数为95目。
54.生物碱的浸提：用体积分数为91％vol的乙醇于37℃的温度下浸渍上述预处理后的华山参，然后过滤得到滤液和滤渣，然后向滤渣内加入上述乙醇浸渍，再次过滤，如此循环操作对华山参进行浸提。
55.生物碱浸膏的制备：利用上述方法浸提华山参4次，然后合并滤液，将混合后的滤液减压浓缩得到浸膏，浸膏调节ph至1后静置5小时抽滤，然后再调节ph至10静置5小时后得到原液，用氯仿萃取原液，然后减压浓缩后回收氯仿得到生物碱浸膏。
56.樟柳碱的提纯：生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为230目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
57.需要说明的是，上述氯仿/甲醇溶液中，氯仿和甲醇的质量比为29：1。
58.实施例5
59.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：
60.生物碱的浸提：用乙醇于38℃的温度下浸渍华山参，然后过滤得到滤液和滤渣，将滤液减压浓缩得到生物碱浸膏。
61.樟柳碱的提纯：用上述浸提法从华山参中获得生物碱浸膏，生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为240目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
62.实施例6
63.本发明实施例提出一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，包括以下步骤：
64.用浸提法从华山参中获得生物碱浸膏，生物碱浸膏溶解于水中并用mci柱层析，用甲醇/乙腈/水的混合液进行洗脱得到洗脱液一，洗脱液一经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇溶液洗脱后得到洗脱液二，硅胶柱的硅胶粒子为280目，洗脱液二经丙酮/石油醚溶液层析洗脱后得到樟柳碱。
65.效果例1
66.取实施例1
‑
6所得的樟柳碱进行定性鉴别，按照下述方法分别制备供试品溶液和对照品溶液，按色谱条件在agilent 1100高效液相色谱仪中进行液相测试。
67.对照品溶液的配置：称取氢溴酸樟柳碱10mg(中国药品生物制品检定所，批号100399
‑
201802)，用二次蒸馏水溶解并定容于100ml量瓶，摇匀即可。
68.供试品溶液的配置：分别取实施例1
‑
6所得的樟柳碱样品烘干，并对应编号1
‑
6,取10mg的1
‑
6号试样分别溶解于二次蒸馏水中定容于100ml摇匀，即可。
69.色谱条件：色谱柱waters c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相：0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(ph＝3.5)
‑
乙腈(93:7)；紫外检测波长：210nm，流速为1.0ml/min，进样量：100μl，柱温：30℃。取20μl对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
70.结果：通过测试供试品溶液1
‑
6分别与对照品溶液的色谱图中显示主峰保留时间
一致。采用dad检测器检测主峰的紫外吸收光谱图，供试品溶液与氢溴酸樟柳碱对照品溶液保留时间相应的色谱峰均具有相同的紫外吸收特征，说明本发明提出的制备方法所得到的物质为樟柳碱。
71.效果例2
72.取实施例1
‑
6所得的樟柳碱进行重复性试验，选择实施例1作为本试验的样品。按照上述供试品溶液的配置方法平行制备6份实施例1供试品溶液，分别进样。
73.结果：测得峰面积的rsd为1.48％，表明本发明提出的制备方法的重复性良好。
74.效果例3
75.取实施例1
‑
6所得的樟柳碱进行稳定性试验，选择实施例1作为本试验的样品。按照上述供试品溶液的配置方法制备实施例1供试品溶液，按照效果例1中的色谱条件分别在0,1,2,3,4,6,8,16,24h进样，记录色谱图。
76.结果：樟柳碱峰面积的rsd为0.08％，表明本发明提出的制备方法所制得的樟柳碱在24h内的稳定性良好。
77.综上所述，本发明提供一种从生物碱浸膏中分离纯化樟柳碱的制备方法，该制备方法操作简单，适用于大规模生产，所用到的洗脱液、层析液等可进行回收利用，在节约资源的同时也能降低生产成本。本发明还涉及一种樟柳碱，该樟柳碱利用上述制备方法制成，其品质和生理活性较好，且纯度较高，具有良好的药用效果，医药价值较高。
78.以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。