一种基于杂交链反应检测鼻咽癌抗放疗生物标志物的方法与流程

1.本发明涉及一种基于杂交链反应检测鼻咽癌抗放疗生物标志物的方法，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，全球范围内中国及东南亚各国发病率最高。鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，因此放射治疗是目前公认和有效的根治性治疗手段，早期一般采用单纯放射治疗，晚期采用以放疗为主的放化疗综合治疗手段。目前，现阶段临床上常通过乏氧情况来判断肿瘤的放疗敏感性，而临床乏氧检测最常用的方法是直接检测肿瘤组织氧分压的氧电极法。但该检测技术需要采用有创手段，而且只能评估肿瘤的局部乏氧状态。因此，急需开发无创、全面的检测方法，用于判断鼻咽癌患者的放疗敏感性，为患者确定个性化的临床治疗方案，以免延误治疗。
3.mircornas(mirnas)是一类长约20
‑
24nt的，具有调控功能的单链非编码小分子rna。现有研究表明，鼻咽癌抗放疗细胞中mir
‑
205含量明显较高，可作为鼻咽癌患者放疗反应的生物标志物。传统的mirna定量检测方法有实时荧光定量pcr、微阵列法、northern blot等，但存在操作复杂，仪器昂贵，灵敏度不高等问题。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种检测mir
‑
205的生物传感器。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
7.本发明的第一个目的是提供一种检测mir
‑
205的生物传感器，包括mir
‑
205、发夹核酸探针hcr1、发夹核酸探针hcr2、氧化石墨烯和buffer；
8.mir
‑
205的核苷酸序列如seq id no.1所示；
9.发夹核酸探针hcr1的核苷酸序列含有序列a和序列b；发夹核酸探针hcr2的核苷酸序列含有序列b*和序列c；
10.序列a和mir
‑
205的核苷酸序列互补，序列b与序列b*互补，序列c为tccttcattccaccggagtctg；
11.发夹核酸探针hcr1和hcr2的核苷酸序列的5’端连接有荧光素。
12.在一种实施方式中，所述序列a为agactccggtggaatgaagga，序列b*为actttgcagactccggtggaat。
13.在一种实施方式中，hcr1的核苷酸序列如seq id no.1所示，hcr2的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.在一种实施方式中，所述荧光素标记包括但不限于5
‑
羧基荧光素。
15.在一种实施方式中，所述buffer为spsc缓冲液；spsc缓冲液的配方为50
×
10
‑9mol/lna2hpo4，1mol/l nacl，ph值为7.4。
16.本发明还提供上述生物传感器在非疾病诊断上检测mir
‑
205的应用。
17.在一种实施方式中，所述检测为定性检测或定量检测。
18.上述生物传感器对mir
‑
205进行非疾病诊断目的方法，向含有hcr1和hcr2的溶液中加入氧化石墨烯混合孵育，得到负载发夹核酸探针的氧化石墨烯溶液，与细胞共培养后，激光共聚焦成像。
19.在一种实施方式中，所述发夹核酸探针溶液的浓度为90～120
×
10
‑9mol/l；所述的氧化石墨烯浓度为180～200μg/ml；所述孵育的时间至少5min；负载发夹核酸探针的氧化石墨烯溶液与细胞共培养的时间为4～8h。
20.上述生物传感器对mir
‑
205进行非疾病诊断目的方法，向含有hcr1和hcr2的溶液中加入待检测溶液混合孵育，再加入氧化石墨烯反应，利用荧光分光光度计检测荧光强度。
21.在一种实施方式中，所述发夹核酸探针溶液的浓度为90～120
×
10
‑9mol/l；所述的氧化石墨烯浓度为140～160μg/ml；所述孵育的时间至少1h，孵育的温度为22～27℃。
22.本发明的有益效果：本发明方法操作简单、检测快速且灵敏度高，对mir
‑
205的检出限达2.1
×
10
‑
11
mol/l，本发明检测mir
‑
205具有非常高的特异性，传感器在1
‰
胎牛血清中的检测回收率在96～122.17％，rsd(％)在0.25～1.69。
附图说明
23.图1为本发明工作原理示意图。
24.图2为工作原理可行性分析荧光光谱图。
25.图3为工作原理可行性分析核酸电泳图。
26.图4为不同浓度的氧化石墨烯对核酸探针吸附效果的影响。
27.图5为不同浓度核酸探针对荧光背景值的影响。
28.图6为不同温度对杂交链式反应效果的影响。
29.图7为不同时间对杂交链式反应效果的影响。
30.图8为基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对不同浓度的mir
‑
205检测的荧光光谱图。
31.图9基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对mir
‑
205的特异性响应情况。
32.图10基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器于1
‰
胎牛血清的可行性分析。
33.图11在1
‰
胎牛血清中，不同浓度的氧化石墨烯对核酸探针吸附效果的影响。
34.图12在1
‰
胎牛血清中，基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对不同浓度梯度mir
‑
205响应情况。
35.图13在1
‰
胎牛血清中，基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对mir
‑
205的特异性响应情况。
36.图14基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器在不同细胞中的荧光成像情况。
具体实施方式
37.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
38.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
39.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
40.实施例1：
41.工作原理可行性分析。
42.实施步骤：
43.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
44.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。mir
‑
205与hcr1的下划线部分互补形成双链，将hcr1探针打开，hcr1的非下划线部分与hcr2的下划线部分互补形成双链，将hcr2探针打开，hcr2的斜体部分与hcr1的下划线部分互补形成双链，如此循环，进行杂交链反应(hcr)。
45.3.用depc水溶解mir
‑
205(序列为5
’‑
ucc uuc auu cca ccg gag ucu g
‑3’
)，配制成20
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
46.4.用spsc缓冲液配制7个样品。其中，
47.样品1为终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr1溶液；
48.样品2为终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液；
49.样品3为终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr1和终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr2混合溶液；
50.样品4为终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr1和终浓度100
×
10
‑9mol/l的hcr2与120μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
51.样品5为终浓度100
×
10
‑9mol/l hcr1溶液与200
×
10
‑9mol/l mir
‑
205溶液25℃下静置反应2小时后，加入120μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
52.样品6为终浓度100
×
10
‑9mol/l hcr2溶液与200
×
10
‑9mol/l mir
‑
205溶液25℃下静置反应2小时后，加入120μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
53.样品7为终浓度100
×
10
‑9mol/l hcr1溶液、100
×
10
‑9mol/l hcr2溶液与200
×
10
‑9mol/lmir
‑
205溶液25℃下静置反应2小时后，加入120μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液。
54.5.使用f
‑
7000荧光分光光度计读取其荧光强度，其中，荧光光谱仪的激发波长设定为480nm，发射波长扫描设定为500
‑
600nm范围内，激发狭缝宽度设定为5nm，发射狭缝宽度设定为2.5nm。
55.6.制备4个样品并使用sds
‑
page电泳检测条带，：样品1为100
×
10
‑9mol/l的hcr1，样品2为100
×
10
‑9mol/l的hcr2，样品3为40
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205，样品4为同时含有100
×
10
‑9mol/l的hcr1，hcr2和40
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205混合溶液。结果如图3所示。
56.本发明spsc缓冲液配方：50
×
10
‑9mol/l na2hpo4，1mol/l nacl，ph值为7.4。
57.图1为本发明工作原理图，在杂交链式反应中，两条发夹核酸探针彼此处于稳定状态，发夹核酸探针hcr1和hcr2由发夹区，单链粘性末端和双链互补区组成，hcr1序列(5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
)中，caaagt为发夹区，gaagga为单链粘性末端，剩余的是互补双链区；同样的，hcr2序列中，tccttc为发夹区，actttg为单链粘性末端，剩余的是互补双链区。当不存在触发链mir
‑
205时，两条发夹核酸探针末端单链dna通过π
‑
π作用吸附在氧化石墨烯表面，发夹核酸探针携带的荧光基团在荧光共振能量转移的作用下，被氧化石墨烯淬灭。当触发链mir
‑
205存在时，第一条发夹hcr1的裸露的粘性末端与触发链互补配对，导致发夹hcr1结构的打开，其暴露出的粘性末端则与第二条发夹结构hcr2的粘性末端互补配对，导致发夹hcr2结构的打开，此时hcr2暴露出的粘性末端又与触发链的序列相同，便会反复引起发夹核酸探针的结构打开。最后，会形成一条含有粘性末端的杂交双链共聚物，因双链无法通过π
‑
π作用被氧化石墨烯所吸附，因此荧光不被猝灭。此方法通过不断打开含有fam荧光基团标记的两种发夹核酸探针结构来引发荧光恢复，对mir
‑
205的定量可以通过对体系中荧光强度的检测来实现。
58.图2为工作原理可行性分析荧光光谱图，将氧化石墨烯加入hcr1和hcr2混合体系后，荧光信号显着降低，证明氧化石墨烯可以将hcr1和hcr2发夹探针吸附在表面，从而导致有效的荧光猝灭。将mir
‑
205加入hcr1和氧化石墨烯体系中时，仅发生mir
‑
205和hcr1的简单杂交，荧光略有恢复。而将mir
‑
205加入hcr2和氧化石墨烯体系中时，不发生反应，荧光强度几乎没有变化。当将mir
‑
205加入到hcr1和hcr2的混合物中时，在氧化石墨烯的存在下仍能观察到明显的荧光增强，表明出现了大量荧光恢复的现象，mir
‑
205成功触发了杂交链式反应。
59.图3为杂交链式反应可行性分析图，在同时含有hcr1，hcr2和mir
‑
205的泳道4中出现了不同长度的杂交双链共聚物条带，证明mir
‑
205成功引发了杂交链式反应，证实基于杂交链式反应的扩增策略的原理可行。
60.实施例2：
61.不同浓度的氧化石墨烯对核酸探针吸附效果的影响。
62.实验步骤：
63.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
64.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
65.3.用depc水溶解mir
‑
205(序列为5
’‑
ucc uuc auu cca ccg gag ucu g
‑3’
)，配制成20
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
66.4.将100
×
10
‑9mol/l hcr1和hcr2与不同浓度的氧化石墨烯(0、20、40、60、80、100、120、140、160μg/ml)室温孵育10min。
67.5.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计检测荧光读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
68.实验结果如图4所示，当氧化石墨烯浓度为140μg/ml时，荧光强度降到最低值。因此，氧化石墨烯的最佳浓度为140μg/ml，此时的荧光本底最低。
69.实施例3：
70.不同浓度核酸探针对荧光背景值的影响。
71.实验步骤：
72.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
73.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
74.3.用depc水溶解mir
‑
205(序列为5
’‑
ucc uuc auu cca ccg gag ucu g
‑3’
)，配制成20
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
75.4.将200
×
10
‑9mol/l浓度的mir
‑
205溶液与不同浓度的hcr1、hcr2溶液混合静置在25℃下反应2小时。
76.5.在混合溶液中，加入浓度为140μg/ml的氧化石墨烯溶液，振荡、混匀，室温孵育10分钟。
77.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
78.实验结果如图5所示，可以看出，当两种探针浓度在100
×
10
‑9mol/l时，荧光信号扩增效果有所波动，在100
×
10
‑9mol/l时效果最佳，因此，选择核酸探针浓度100
×
10
‑9mol/l为最适浓度。
79.实施例4：
80.不同温度对杂交链式反应效果的影响。
81.实验步骤：
82.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
83.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
84.3.用depc水溶解mir
‑
205(序列为5
’‑
ucc uuc auu cca ccg gag ucu g
‑3’
)，配制成20
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
85.4.将100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1溶液、100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液与200
×
10
‑9mol/l浓度的mir
‑
205溶液，混合静置，分别在25℃和37℃下反应2小时。
86.5.在混合溶液中，加入不同浓度为的氧化石墨烯溶液，振荡、混匀，室温孵育10分钟。
87.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
88.实验结果如图6所示，可以看出，在不同氧化石墨烯浓度下，相较于37℃来说，25℃时的起始荧光强度更高，且荧光响应范围更大，因此选用25℃为反应温度。
89.实施例5：
90.不同时长对杂交链式反应效果的影响。
91.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
92.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
93.3.用depc水溶解mir
‑
205(序列为5
’‑
ucc uuc auu cca ccg gag ucu g
‑3’
)，配制成20
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
94.4.将100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1溶液、100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液与200
×
10
‑9mol/l浓度的mir
‑
205溶液，混合静置，分别在25℃下反应不同的时长。
95.5.在混合溶液中，加入浓度为140μg/ml的氧化石墨烯溶液，振荡、混匀，室温孵育10分钟。
96.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
97.实验结果如图7所示，可以看出，当反应时间超过60分钟时，体系内反应情况基本已达到平衡，选择60分钟为实验的反应时长。
98.实施例6：
99.基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对不同浓度的mir
‑
205检测的荧光光谱图。
100.实验步骤：
101.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
102.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
103.3.将100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1溶液、100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液与浓度分别为0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、10、20、30、40、50、100、150、200
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205溶液混合静置。
104.4.在25℃下反应2小时后，加入浓度为140μg/ml的氧化石墨烯溶液，混匀，室温孵育10min。
105.5.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
106.实验结果如图8所示，可以看出，当mir
‑
205的浓度在0
‑1×
10
‑9mol/l的范围内时，荧光强度与mir
‑
205浓度呈线性相关，线性方程为f＝201.53x 337.91，相关系数r2＝0.963。根据公式3σ/k，计算得出检测极限为21
×
10
‑
12
mol/l。
107.实施例7：
108.基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对mir
‑
205的特异性响应情况。
109.实验步骤：
110.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
111.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
112.3.将100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1溶液、100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2与200
×
10
‑9mol/l浓度的nc、mirna
‑
21、let
‑
7a、mirna
‑
141、rm3(mir
‑
205错配3个碱基的序列)、rm2(mir
‑
205错配2个碱基的序列)、rm1(mir
‑
205错配1个碱基的序列)、mir
‑
205溶液分别混合静置。
113.4.在25℃下反应2小时后，加入浓度为140μg/ml的氧化石墨烯溶液，混匀，室温孵育10min。
114.5.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
115.实验结果如图9所示，可以看出，非互补靶标(nc，mirna
‑
21，let
‑
7a和mirna
‑
141)不会引起明显的荧光信号变化，随着错配碱基数量的减少，荧光变化率逐渐增加，且一个碱基错配的rna相对于目标rna约仅有荧光信号变化的一半，说明检测平台对mir
‑
205的检测具有优越的特异性。
116.实施例8：
117.基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器于1
‰
胎牛血清的可行性分析。
118.实验步骤：
119.1.用spsc缓冲液配制8个样品。
120.样品1为终浓度1
‰
胎牛血清的溶液；
121.样品2为终浓度1
‰
胎牛血清、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
122.样品3为终浓度1
‰
胎牛血清、1
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
123.样品4为终浓度1
‰
胎牛血清、10
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
124.样品5为终浓度1
‰
胎牛血清、50
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
125.样品6为终浓度1
‰
胎牛血清、100
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
126.样品7为终浓度1
‰
胎牛血清、200
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后，加入终浓度180μg/ml氧化石墨烯溶液混合反应10分钟后的溶液；
127.样品8为终浓度1
‰
胎牛血清、100
×
10
‑9mol/l的hcr1与100
×
10
‑9mol/l的hcr2溶液25℃下静置反应2小时后的溶液。
128.2.在荧光显微镜下对上述8个样品拍摄照片。
129.实验结果如图10所示，可以看出，随着反应体系中mir
‑
205浓度增大，荧光亮度不断增强，具有较高的稳定性，证实该检测方法适用于1
‰
胎牛血清环境中。
130.实施例9：
131.在1
‰
胎牛血清中，不同浓度的氧化石墨烯对核酸探针吸附效果的影响。
132.实验步骤：
133.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
134.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
135.3.在1
‰
胎牛血清溶液中加入100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1和100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液。
136.4.在上述混合溶液中加入200
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205溶液混合静置，在25℃下反应2小时后，加入浓度分别为0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300μg/ml的氧化石墨烯溶液。
137.5.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
138.实验结果如图11所示，可以看出，氧化石墨烯浓度达到180μg/ml时，荧光强度下降趋势不再明显。因此，氧化石墨烯的最佳浓度为180μg/ml。
139.实施例10：
140.在1
‰
胎牛血清中，基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对不同浓度梯度mir
‑
205响应情况。
141.实验步骤：
142.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
143.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
144.3.在1
‰
胎牛血清溶液中加入100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1和100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液。
145.4.在上述混合溶液中加入浓度分别为0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、3、5、7、10、20、30、40、50、100、150、200
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205溶液混合静置。
146.5.在25℃下反应2小时后，加入180μg/ml浓度的氧化石墨烯溶液。
147.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
148.实验结果如图12所示，可以看出，当mir
‑
205的浓度在0
‑1×
10
‑9mol/l的范围内时，荧光强度与mir
‑
205浓度呈线性相关，线性方程为f＝72.34x 272.82，相关系数r2＝0.994。根据公式3σ/k，计算得出检测极限为214
×
10
‑
12
mol/l。
149.实施例11：
150.在1
‰
胎牛血清中，基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器对mir
‑
205的特异性响应情况。
151.实验步骤：
152.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
153.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
154.3.在1
‰
胎牛血清溶液中加入100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1和100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液。
155.4.在上述混合溶液中分别加入浓度为200
×
10
‑9mol/l的nc、mirna
‑
21、let
‑
7a、mirna
‑
141、rm3(mir
‑
205错配3个碱基的序列)、rm2(mir
‑
205错配2个碱基的序列)、rm1(mir
‑
205错配1个碱基的序列)、mir
‑
205溶液混合静置。
156.5.在25℃下反应2小时后，加入180μg/ml浓度的氧化石墨烯溶液。
157.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
158.实验结果如图13所示，可以看出，非互补靶标(nc，mirna
‑
21，let
‑
7a和mirna
‑
141)不会引起明显的荧光信号变化，随着错配碱基数量的减少，荧光变化率逐渐增加，且具有一个碱基错配的rna相对于目标rna荧光信号变化不足一半，证明该检测平台对1
‰
胎牛血清中mir
‑
205的检测具有优越的特异性。
159.实施例12：
160.基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器在不同细胞中的荧光成像情况。
161.实验步骤：
162.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
163.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
164.3.分别取hepg2(不表达mir
‑
205)、kyse
‑
150(低表达mir
‑
205)和kyse
‑
140(高表达mir
‑
205)细胞接种于共聚焦培养皿中，其中，接种细胞数为3
×
104个，在37℃、5％co2培养箱中培养24h。
165.4.浓度分别为100
×
10
‑9mol/l的hcr1和hcr2与180μg/ml的氧化石墨烯混合2h，以确保hcr1和hcr2完全吸附在go表面。
166.5.取含有hcr1和hcr2的氧化石墨烯混合体系与3种细胞分别共培养6h，用1ml pbs洗涤细胞5次，用dapi溶液对细胞核进行染色。
167.6.在488nm激发波长下进行激光共聚焦成像。
168.实验结果如图14所示，可以看出，kyse
‑
140细胞、kyse
‑
150细胞和hepg2细胞中的荧光强度由强到弱，证明杂交链反应在kyse
‑
140细胞中由mir
‑
205触发并成像。
169.实施例13：
170.基于杂交链式反应的氧化石墨烯传感器在1
‰
胎牛血清的加标回收检测情况。
171.实验步骤：
172.1.用depc水将氧化石墨烯稀释至1mg/ml，混匀。
173.2.用depc水溶解被荧光标记的发夹核酸探针hcr1和hcr2(序列分别为5
’‑
attccaccggagtctgcaaagtcagactccggtggaatgaagga
‑
fam
‑3’
和)，配制成100
×
10
‑6mol/l的溶液，混匀。
174.3.在1
‰
胎牛血清溶液中加入100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr1和100
×
10
‑9mol/l浓度的hcr2溶液。
175.4.在上述混合溶液中加入浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1
×
10
‑9mol/l的mir
‑
205溶液混合静置。
176.5.在25℃下反应2小时后，加入180μg/ml浓度的氧化石墨烯溶液。
177.6.使用日立f
‑
7000荧光分光光度计读数。激发波长为480nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为2.5nm，检测520nm的荧光强度。
178.7.代入线性方程计算浓度，对比加标浓度，同时计算回收率和rsd值。
179.实验结果如表1所示，可以看出，在1
‰
胎牛血清中取得了良好的回收率，在96.74％～122.17％之间，rsd值始终低于2％，表明基于杂交链式反应的氧化石墨烯生物传感器能够成功应用于1
‰
胎牛血清样品的加标检测中。
180.本发明方法操作简单、检测快速且灵敏度高，在spsc缓冲液中，对mir
‑
205的检出限达21
×
10
‑
12
mol/l，本发明检测mir
‑
205具有非常高的特异性。在1
‰
胎牛血清中，对mir
‑
205的检出限达214
×
10
‑
12
mol/l，本发明在1
‰
胎牛血清中检测mir
‑
205具有非常高的特异性。
181.表1传感器在1
‰
胎牛血清的加标回收检测情况
[0182][0183]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。