一组用于诊断儿童毛细支气管炎的联合标志物及其应用和检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及分析化学及临床医学领域。具体地，本发明涉及以色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸作为联合标志物判别毛细支气管炎的试剂盒。


背景技术：

2.毛细支气管炎是小儿常见的一种急性下呼吸道感染疾病，多发生于2岁以下，尤其小于6个月的婴儿。毛细支气管炎和哮喘关系十分密切，两者都有典型的喘息症状，部分毛细支气管炎实际是哮喘的首次发作(文献1：ma y,hospital t b.research progress on the relationship between bronchiolitis and asthma[j].heilongjiang medicine journal,2016)。毛细支气管炎患儿病后哮喘患病率(22.1％-53.2％)远高于我国儿童自然哮喘患病率(0.25％-4.63％)(文献2：johnson c h,ivanisevic j,siuzdak g.metabolomics:beyond biomarkers and towards mechanisms[j].nature reviews molecular cell biology,2016,17(7):451-459)。但目前在临床上缺乏区分哮喘和毛细支气管炎的有效方法。另外，支气管炎也是常见的下呼吸道疾病。从临床表现上面来讲，支气管炎不引起呼吸困难，不引起气促。肺功能检测时，毛细支气管炎患者的肺功能会伴有功能性阻塞；而支气管炎患者不伴有呼吸道的呼吸功能的阻塞。故两者能有较明显的区分。当前，小儿毛细支气管炎的临床诊断以经皮血氧饱和度监测、鼻咽抽吸物病原学检测、胸部x线检查等为主。三者均不具备普遍适用性，诊断复杂且成本高。因此，开发新的高灵敏度和特异性的诊断方法势在必行。
[0003]
代谢组学将高通量分析技术与生物信息学相结合，对生物样本中的代谢物进行全面分析。近些年，关于毛细支气管炎研究中使用的样本多为呼气冷凝液(ebc)和肺泡灌洗液。cruickshank-quinn等研究发现，唾液中类花生酸类物质的含量比无唾液污染ebc高出几个数量级，所以以前报道的ebc中类花生酸类物质浓度可能是由于唾液污染所致(文献3：cruickshank-quinn c,armstrong m,powell r,et al.determining the presence of asthma-related molecules and salivary contamination in exhaled breath condensate[j].respiratory research,2017,18(1))。虽然肺泡灌洗液中代谢物质的变化能更直观的反映支气管哮喘发病机制，但其有创性使其在人体研究中受到限制，且quinn等研究证明血清中代谢物可作为肺部代谢物的替代(文献4：quinn k d,schedel m,nkrumah-elie y,et al.dysregulation of metabolic pathways in a mouse model of allergic asthma[j].allergy,2017,72(9))。因此，采用高效、高通量的代谢组学技术来检测哮喘和毛细支气管炎患者血清中代谢物的含量显得尤为重要。通过代谢组学技术确定毛细支气管炎的生物标志物，可以预测和分层疾病的严重性，对临床预测和治疗有重要意义。
[0004]
本发明利用超高效液相色谱-质谱联用(uhplc-ms)技术检测毛细支气管炎患者、哮喘病患者和正常人群的血清代谢谱，将其分为毛细支气管炎组和非毛细支气管炎组(包括正常人群和干扰性疾病哮喘病患者)，通过二元逻辑回归分析优选出了色氨酸和苯丙氨
酰苯丙氨酸联合标志物，用于一次性诊断受试者中的毛细支气管炎。色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸参与人体多种病理生理过程。色氨酸是一种重要的氨基酸和重要的能量代谢前体。有研究报道，卵清蛋白诱导的小鼠血浆中色氨酸含量下降，提示能量代谢在卵清蛋白致变应性哮喘的形成中起着异常的作用(文献5：aberrant purine metabolism in allergic asthma revealed by plasma metabolomics[j].journal of pharmaceutical&biomedical analysis,2016,120:181-189)。苯丙氨酸能够转变为酪氨酸，这两者的同时升高促进了肾上腺素和甲状腺素的合成作用，进一步调节能量代谢(文献6：hsu j w,ball r o,pencharz p b.evidence that phenylalanine may not provide the full needs for aromatic amino acids in children[j].pediatric research,2007,61(3):361.)。此外苯丙氨酸、酪氨酸还有调理肠道功能的作用。先前已有研究证实，肠道菌群失调与机体免疫奈乱和变异性疾病的发生发展密切相关，比如哮喘和毛细支气管炎等。(文献7：mcloughlin r m,mills k h g.influence of gastrointestinal commensal bacteria on the immune responses that mediate allergy and asthma[j].journal of allergy&clinical immunology,2011,127(5):1097-1107)。目前尚无将上述联合标志物用于毛细支气管炎诊断的报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是针对毛细支气管炎诊断困难的问题，提供一种组合的小分子代谢物在辅助诊断毛细支气管炎中的应用，并提供可用于上述组合的小分子代谢物的分析检测方法。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007]
(1)利用高效液相色谱-质谱联用的代谢组学技术，对毛细支气管炎患者、哮喘患者和正常人血清进行了代谢组学指纹分析；
[0008]
(2)使用mev软件对可定量代谢物进行非参数检验，计算得出所有代谢物的假阳性率(fdr)值和p值，fdr值<0.05和p值<0.05的代谢物具备显著性差异，由此发现37种代谢物在非毛细支气管炎(包括正常人群和干扰性疾病哮喘病患者)和毛细支气管炎患者中存在显著性差异，其中包括肉碱、鞘磷脂(sms)、磷脂酰乙醇胺(pes)、脂肪酸(ffas)和氨基酸等代谢物(37种差异代谢物及其相对含量见附表)；
[0009]
(3)使用数据统计软件spss，通过二元逻辑回归分析方法，通过向前：条件方法筛选37种差异代谢物，筛选出五组标志物，然后用roc(receiver operating characteristic)曲线来评价筛选出的联合标志物的灵敏度和特异性及曲线下面积(auc)(如表1所示)。特异性和灵敏度均较高，同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的组合可以作为联合标志物，选取色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸作为辅助诊断毛细支气管炎的联合标志物；
[0010]
表1.联合标志物的评价结果
[0011][0012]
(4)应用另外一批毛细支气管炎患者、哮喘患者和正常人血清样本对组合代谢标志物进行验证，确定色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸可作为辅助诊断毛细支气管炎的联合标志物；
[0013]
(5)联合标志物的使用：相对于非毛细支气管炎患者(正常人群和哮喘病患者)，在毛细支气管炎患者血清中色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度降低。使用数据统计软件spss，通过二元逻辑回归的方法，将上述代谢物回归为一种联合标志物变量p，二元逻辑回归方程如下：
[0014]
p＝1/(1 e-(-8.375
·
a-15.964 b 6.959)
)
[0015]
其中，a为血清样品中色氨酸的浓度，b为血清样品中苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度。所得变量p在毛细支气管炎患者中升高，该变量值可用于辅助判断毛细支气管炎。本发明确定的该联合标志物对毛细支气管炎判断的截点值设为0.365，高于该截点值的则可能为毛细支气管炎。
[0016]
(6)诊断系统包括的装置：色谱柱为waters beh c8柱(100mm
×
2.1mm,1.7μm)(waters,milford,ma)，分离系统为wasters acquity uplc，检测系统为triple tof质谱，使用正离子模式检测；
[0017]
(7)确定试剂盒的最佳组成：
[0018]
a.标准品：色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸。所述标准品分别用于对应的血清代谢物色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的定性。将浓度为1-10μg/ml的两种物质标准品进行液相色谱-质谱分析，确定两种标准品的色谱保留时间以及两种离子的实测质荷比，与在受试者样本中实测的两种物质相比较；
[0019]
b.用于血清样品预处理的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样本，为包含4.25μg/ml d5-色氨酸一种内标的甲醇溶液。d5-色氨酸用于校正色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸。对每一受试者样本中经定性后的两种物质的离子峰强度分别与提取液中的内标物比较，通过内标校正获得色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的相对浓度；
[0020]
c.洗脱液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液和0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；本发明具有如下效果：
[0021]
血清中的联合标志物变量p，能够对毛细支气管炎具有很好的诊断。本发明涉及的检测试剂盒，对上述代谢物组合的检测，具有简便、快速、重复性好的优点，适于辅助毛细支气管炎的临床诊断。灵敏度和特异性及曲线下面积(auc)见下表2。
[0022]
表2.联合标志物的使用结果
[0023]
附图说明
[0024]
图1.在发现集和验证集中，色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸在各组血清样本中的相对含量变化(均值 标准偏差表示)。
[0025]
图2.(a)联合标志物在发现集中用于诊断毛细支气管炎的roc曲线图，auc＝0.967；(b)联合标志物在验证集中用于诊断毛细支气管炎的roc曲线图，auc＝1。
具体实施方式
[0026]
实施例1
[0027]
1.血清样品收集
[0028]
所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署了知情同意书。在相同条件下收集20例毛细支气管炎患者(1个月-19个月)，22例哮喘患者(0.5岁-13岁)和26例健康人(0岁-6岁)的血样，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
[0029]
2.分析方法
[0030]
2.1血清样本预处理
[0031]
向96孔蛋白沉淀板中加入200μl含内标的甲醇(含1种内标：4.25μg/ml d5-色氨酸)，再加入50μl血清，低速涡旋10min，然后离心400g，将上方蛋白沉淀板丢弃，下方收集盒中样品冻干。lc-ms分析前，用80μl体积比为1/4的乙腈/水复溶收集盒中样品，涡旋10min，离心取上清转移入进样瓶进样分析，进样量为5μl。
[0032]
2.2仪器条件
[0033]
液相色谱分析系统采用wasters acquity uplc(waters corp,milford,usa)。色谱柱：waters beh c8柱(100mm
×
2.1mm,1.7μm)(waters,milford,ma)，柱温：50℃，流速：0.35ml/min。流动相：水添加0.1％甲酸(a相)和乙腈添加0.1％甲酸(b相)。梯度：起始梯度为10％b，维持1min，随后在4min内线性增至40％b，在12min内又线性增至100％b并维持5min，在22.1min处降回初始梯度10％b，平衡2.9min。
[0034]
检测系统为triple tof
tm 5600 质谱(ab sciex,framingham,usa)，正离子模式。tof全扫描范围m/z 50-1200；curtain gas 0.241mpa,gs1 0.276mpa,gs2 0.276mpa；化合物的去簇电压100v；碰撞能10v；ida-based auto-ms2(选择响应较高的前20个离子自动进行二级碎片扫描，用于辅助定性)m/z范围：50-1200；碰撞能为30v，碰撞能伸展范围10。
[0035]
3.血清测试结果及辅助诊断方法
[0036]
提取组合标志物色氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸和内标化合物的峰面积，对代谢物的峰面积进行内标校正得到相应的相对浓度，色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸采用d5-色氨酸校正。定量分析色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸。上述代谢物在正常对照组、毛细支气管炎组和哮喘组中的相对含量如图1(发现集)和表3所示。
[0037]
表3.正常对照、哮喘和毛细支气管炎中色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的相对含量
[0038]
[0039]
[0040][0041]
相对于非毛细支气管炎患者(正常人群和哮喘病患者)，在毛细支气管炎患者血清中色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度降低。同时将各代谢物的相对含量代入spss软件进行二元逻辑建模分析，所建模型的回归方程如下：
[0042]
p＝1/(1 e-(-8.375
·
a-15.964 b 6.959)
)
[0043]
其中，a为血清样品中色氨酸的浓度，b为血清样品中苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度。所得变量p在毛细支气管炎患者中升高，该变量值可用于辅助判断毛细支气管炎。本发明确定的该联合标志物对毛细支气管炎判断的截点值设为0.365，高于该截点值的则可能为毛细支气管炎。
[0044]
将色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸组合标志物做诊断毛细支气管炎的roc曲线，用于评价组合标志物对于判别毛细支气管炎的适用性。对于非毛细支气管炎(正常对照和哮喘病)与毛细支气管炎，该小分子代谢组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。auc＝0.967，灵敏度为100％，特异性为91.7％(见表4和图2)。
[0045]
表4.
[0046][0047]
实施例2
[0048]
1.血清样品收集
[0049]
所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署了知情同意书。在相同条件下收集10例毛细支气管炎患者(1个月-19个月)，11例哮喘患者(0.5岁-13岁)和12例健康人(0岁-6岁)的血样，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
[0050]
2.分析方法
[0051]
同实施例1
[0052]
3.血清测试结果及辅助诊断方法
[0053]
实施例2验证集的结果与实施例1发现集的结果基本吻合。色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸在正常对照组、毛细支气管炎组和哮喘组中的相对含量如图1(验证集)和表5所示。相对于正常对照组和哮喘组，在毛细支气管炎患者血清中色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的浓度降低。
[0054]
表5.正常对照、哮喘和毛细支气管炎中色氨酸和苯丙氨酰苯丙氨酸的相对含量
[0055]
[0056][0057]
将代谢物的相对浓度分别代入实施例1中所得二元逻辑回归方程并采用实施例1中所得截止值进行诊断效果判别。对于非毛细支气管炎(正常对照和哮喘病)与毛细支气管炎，该小分子代谢组合标志物具有较好的判别能力并取得较好的诊断效果。auc＝1，灵敏度为100.0％，特异性为91.3％(见表6和图2)。
[0058]
表6.
[0059][0060]
本发明所述试剂盒具有检测成本低，稳定性好的特点。同时，本发明可有效区分毛细支气管炎和哮喘病，有诊断特异性高和灵敏度高的特点，具有较高的开发应用的价值。
[0061]
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
[0062]
附表.37种差异代谢物及其相对含量
[0063]