血清中维生素K1的高效液相色谱串联质谱检测方法与流程

血清中维生素k1的高效液相色谱串联质谱检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药检测技术领域，特别是涉及一种血清中维生素k1的高效液相色谱串联质谱检测方法。


背景技术：

2.维生素k1(vk1)，又称甲萘醌，是一种脂溶性维生素，其化学性质较稳定，能耐酸、耐热，但对光敏感，也易被碱和紫外线分解。vk1是肝脏合成凝血因子过程中所必需物质，当其缺乏时会影响凝血因子ⅱ、
ⅶ
、
ⅸ
、
ⅹ
的合成，造成凝血酶原复合物生成减少并出现自发性出血，具有潜在致命风险。vk1状态可以用于评估新生儿出血性疾病，乳糜泻，克罗恩病，溃疡性结肠炎和慢性胰腺炎(囊性纤维化)等吸收不良疾病，亦有报道表明其与骨质密度或阿尔茨海默病亦存在关联。因此，建立有效的vk1检测方法十分重要。
3.由于人体内存在多种脂溶性维生素，包括维生素a、维生素d、维生素e、维生素k等，且血液样本本身具有复杂多样性，采用色谱质谱分析的方法进行脂溶性维生素分析测定时，干扰因素特别多，基质干扰特别严重。对于如何能够充分提取、纯化目标化合物，并尽可能少的引入不必要的基质干扰，以满足项目检测高灵敏度、高特异性的要求是一个非常重要和复杂的关键过程。同时体内不同脂溶性维生素含量不同(维生素a、维生素e浓度相对较高)、极性差异大，若要准确的测定vk1，还要尽可能的实现色谱分离，以免其他维生素对vk1的检测造成干扰。特别是vk1在血液中的含量低至pmol/l，并在体内常与蛋白紧密结合，因此，对方法的检测灵敏度要求极高。此外血清样本十分复杂，除了具有大量的蛋白质、盐以及磷脂外，人体产生的代谢产物也可能会对目标物的检测造成干扰。另外vk1在有光的条件下不稳定的性质也需要予以考虑。
4.目前对于vk1常用的检测方法有高效液相-紫外检测法、高效液相-荧光检测法、气相色谱串联质谱法等。但仍存在前处理过程复杂、基质干扰严重，灵敏度低等问题。因此，为了更好的指导维生素k1的补充治疗，亟待开发可以准确定性和定量、除杂效果好、灵敏度更高的vk1检测方法。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的是提供一种步骤简单，且特异性强、灵敏度高、抗干扰能力好的血清中维生素k1的高效液相色谱串联质谱检测方法。
6.具体技术方案如下：
7.一种血清中维生素k1的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
8.样品前处理：在待测血清样本中加入沉淀剂进行沉淀；再加入萃取剂进行萃取，离心；将所得上清液干燥后用复溶液进行复溶，离心；再取所得上清液作为待测样品溶液；其中，所述沉淀剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇、内标d
7-vk1和乙醇；所述萃取剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇和正己烷；所述复溶液包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、雌三醇和甲醇；
9.液相色谱分离：将所述待测样品溶液使用高效液相色谱进行色谱分离；
10.质谱检测：将高效液相色谱分离后的样品进行质谱检测。
11.在其中一些实施例中，所述液相色谱分离的色谱条件包括：
12.流动相：有机相为2.5
±
0.3mm甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1
±
0.02v/v％甲酸的2.5
±
0.3mm甲酸铵水溶液；采用梯度洗脱，流速为0.5
±
0.1ml/min。
13.在其中一些实施例中，所述梯度洗脱包括：
14.0～0.5min：有机相70％～75％，水相25％～30％；
15.0.5～4min：有机相70％～75％
→
84～87％，水相25％～30％
→
13％～16％；
16.4～4.01min：有机相84～87％
→
88～90％，水相13％～16％
→
10～12％；
17.4.01～9min：有机相88～90％
→
98～100％，水相10～12％
→
0～2％；
18.9～10.5min：有机相98～100％，水相0～2％；
19.10.5～10.6min：有机相98～100％
→
70％～75％，水相0～2％
→
25％～30％；
20.10.6～12min：有机相70％～75％，水相25％～30％。
21.在其中一些实施例中，所述液相色谱分离的色谱条件包括：
22.色谱柱：asentis express c18；
23.洗针液：体积分数40～60％的甲醇水溶液；
24.柱温：40～50℃；
25.进样量：20
±
5μl。
26.在其中一些实施例中，所述色谱柱的长度为2～10cm，内径为2.1～4.6mm，粒径为2.7μm。
27.在其中一些实施例中，所述质谱检测采用ab sciex api 5500三重四极杆质谱仪。
28.在其中一些实施例中，所述质谱检测的条件包括：离子源：大气压化学电离源，正离子扫描模式，多反应监测模式；气帘气为40.0
±
5psi；碰撞气为5.0
±
0.5psi；雾化电流为3.0
±
0.5μa；雾化气为30.0
±
5psi；离子源温度为450.0
±
20℃。
29.在其中一些实施例中，维生素k1的定性离子对为：451.4/199.2；维生素k1的定量离子对为：451.4/187.2；d7-vk1内标离子对为458.5/194.1。
30.在其中一些实施例中，所述沉淀剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/ml，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/ml，所述内标d
7-vk1的浓度为0.8～1.6ng/ml；
31.所述萃取剂中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/ml，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/ml；
32.所述复溶液中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的浓度为0.2～1.0mg/ml，雌三醇的浓度为0.8～1.6μg/ml。
33.在其中一些实施例中，所述待测血清样本、沉淀剂和萃取剂的体积比为1：3～5：7～9。
34.在其中一些实施例中，萃取后离心所得上清液与所述复溶液的体积比为6～8：1。
35.在其中一些实施例中，所述沉淀的过程包括漩涡震荡5～10min和室温孵育10～15min；所述萃取的过程包括漩涡震荡10～15min；所述复溶的过程包括漩涡震荡5～10min。
36.在其中一些实施例中，配制标准曲线工作溶液时加入空白基质，所述的空白基质为2～6wt％牛血清蛋白。
37.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
38.本发明方法采用高效液相色谱-质谱联用，结合特定的样品前处理步骤、液相色谱条件和质谱检测条件，实现了一种特异性强、灵敏度高、抗基质干扰能力好、具有很好的重现性的血清中维生素k1检测方法。尤其本方法的灵敏度相比于已报道的方法更高(定量限更低)，能覆盖更广泛的人群样本检测，特别是针对凝血功能异常的患者，有利于开展临床上对血清中vk1含量进行监测，可以用于诊断vk1相关的疾病，为临床治疗提供服务。
39.本发明的前处理步骤可以去除大部分极性较强的杂质，净化效果好，提取回收率高。并且，将内标溶解在沉淀剂中作为内标工作液一次性加入，将加内标和蛋白沉淀操作步骤合并，节省操作步骤，且不影响蛋白沉淀效果和提取回收率。
40.本发明的前处理试剂中(沉淀剂、萃取剂和复溶液)，所添加的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和雌三醇复配能在目标物萃取及转移过程中起到保护作用，有利于提高检测灵敏度和目标物的响应信号，增强处理后样本的稳定性，避免样本不稳定带来的操作问题，减少vk1以及内标在萃取以及转移过程中的损失，减少样本量；复溶液中使用甲醇作为溶剂，对目标物溶解性好，离子化效率高，vk1绝对响应值更高，且不存在溶剂效应。
41.对于前处理过程中未能去除的杂质和性质相似的代谢物，本发明进一步对液相色谱流动相种类、梯度洗脱、空白基质等进行优化，降低基质干扰，消除基质效应，不仅实现了血清样本中vk1的有效分离和定量，还能实现对多种脂溶性维生素的色谱分离，可扩展应用到准确定量分析。
42.在上述基础上，本发明进一步对质谱条件进行了优化，克服了vk1极性较弱、检测灵敏度低的缺陷，实现低样本用量(100μl)就可以达到高灵敏度(定量限低至0.038ng/ml，即84.4pmol/l)的效果。
附图说明
43.图1为实施例1中1例血清样本中vk1的总离子流色谱图；
44.图2为vk1的线性回归曲线；
45.图3为前处理过程中未加入保护剂处理的vk1检测色谱图；
46.图4为前处理过程中加入保护剂处理的vk1检测色谱图；
47.图5为组a的色谱图；
48.图6为组b的色谱图；
49.图7为组c的色谱图；
50.图8为样本中vk1及其他脂溶性维生素色谱图；
51.图9为混合血清紫外照射前的色谱图；
52.图10为混合血清紫外照射60h后的色谱图；
53.图11为bsa空白基质的色谱图。
具体实施方式
54.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
55.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
56.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
57.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
58.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
59.实施例1
60.(1)溶液配制：
61.雌三醇储备液的配制：称取一定量雌三醇固体，用无水乙醇溶解，制备得到浓度为1.0mg/ml的雌三醇储备液。
62.内标中间液的配制：用无水乙醇稀释维生素k1内标(d
7-vk1)储备液，得到浓度为10.0μg/ml的内标中间液。
63.沉淀剂的配制：分别吸取40μl-80μl的内标中间液及400μl-800μl的雌三醇储备液于500ml容量瓶中，再加入0.1g-0.5g bht，用无水乙醇定容得到沉淀剂。
64.萃取剂的配制：吸取400μl-800μl的雌三醇储备液至500ml容量瓶，再加入0.1g-0.5g bht，用正己烷定容得到萃取剂。
65.复溶液的配制：加入0.1g-0.5g bht和400μl-800μl的雌三醇储备液至500ml容量瓶，用纯甲醇定容得到复溶液。
66.4％bsa溶液配制：称取一定量牛血清蛋白(bsa)固体，用去离子水溶解，得到4％(w/w)bsa溶液。
67.vk1标准品中间液ⅰ：用无水乙醇将1.0mg/ml的vk1标准品储备液稀释成浓度为10.0μg/ml的中间液ⅰ。
68.vk1标准品中间液ⅱ：以4％bsa作为空白曲线基质将中间液ⅰ稀释成50.0ng/ml的中间液ⅱ。
69.(2)样品前处理方法：
70.1)移取100μl血清样本，加入400μl沉淀剂，漩涡震荡5～10min；
71.2)室温孵育10～15min；加入800μl萃取剂，漩涡震荡10～15min；
72.3)然后在转速为10000～12000rpm下离心5～10min；
73.4)吸取上层萃取液700μl转至2.0ml离心管中，室温氮气吹干；
74.5)向吹干离心管中加入100μl复溶液，漩涡震荡5～10min，在转速为10000-12000rpm、25℃离心3min；
75.6)取上清液转移至棕色进样瓶，作为待测样品，待上机检测。
76.(3)待测样品中vk1的检测
77.将待测样品使用液相色谱-质谱仪进行检测：
78.1、液相色谱条件：色谱柱采用asentis express c18(5cm*2.1mm，2.7μm)；流动相a
(有机相)为含有2.5mm甲酸铵甲醇溶液，流动相b(水相)为含有0.1％甲酸～2.5mm甲酸铵水溶液；洗针液为体积分数50％的甲醇水溶液，采用梯度洗脱模式，液相梯度如表1所示。柱温为45℃，进样量为20μl。
79.表1 液相洗脱梯度
80.步骤分析时间(min)流速(ml/min)流动相a％流动相b％100.5732720.50.57327340.5861444.010.58911590.51000610.50.51000710.60.573278120.57327
81.2、质谱检测采用ab sciex api 5500三重四极杆质谱仪，大气压化学电离源(apci)，正离子扫描模式，多反应监测模式(mrm)。质谱条件包括：气帘气为40.0psi；碰撞气为5.0psi；雾化电流为3.0μa；雾化气为30.0psi；离子源温度为450.0℃。mrm扫描模式具体质谱参数如表2所示。
82.表2 质谱参数
[0083][0084]
(4)血清中vk1的定性、定量检测
[0085]
以样品中vk1两个离子对与标准品的化合物保留时间(rt为8.72min)进行比对作为定性依据。用内标标准曲线法定量，vk1的峰面积与d
7-vk1峰面积的比值为纵坐标，vk1的浓度与d
7-vk1的浓度比值为横坐标，加权方式为权重1/x，绘制标准曲线，即可对实际样本进行定量计算。
[0086]
(5)待测样品检测
[0087]
采用上述方法，对1例血清样本中的vk1进行了含量测定，检测总离子流色谱图如图1所示。从图中可看出，vk1的色谱峰(rt为8.72min)峰型对称，响应合适，分离效果很好。
[0088]
(6)方法学验证
[0089]
1、线性关系和定量限：
[0090]
以4wt％bsa溶液为空白基质，对vk1标准品中间液ⅱ(50ng/ml)进行稀释，配制得到浓度分别为0.038ng/ml、0.076ng/ml、0.15ng/ml、0.30ng/ml、0.60ng/ml、1.21ng/ml、2.42ng/ml、4.83ng/ml、9.66ng/ml的一系列标准工作曲线溶液。按样品前处理方法每天将上述每个浓度的曲线样本平行处理2个，检测3天，计算各浓度样本的平均值、rsd和回收率，
结果见表3。图2为vk1的线性回归曲线(回归方程为：y＝0.14729x 0.00143，r＝0.99905)。结果表明vk1在线性范围0.038ng/ml～9.66ng/ml(84.36pmol/l～21445pmol/l)内各浓度点rsd＜20％，回收率均在85％～115％之内，且具有良好的线性关系。vk1定量限为0.038ng/ml(84.36pmol/l)，检出限为0.0100ng/ml(22.2pmol/l)。
[0091]
表3 线性数据
[0092][0093][0094]
2、精密度试验：
[0095]
收集混合病人血清样本或病人基质加标得到低、中、高不同浓度水平(浓度分别在0.30ng/ml、1.5ng/ml、6.5ng/ml附近)的样本，每个浓度同一天各平行处理12份，进行批内精密度实验，如表4结果表明三个不同浓度水平vk1的精密度rsd都在2.6％～3.3％之间，表明该方法的批内精密度良好。
[0096]
取上述混合病人血清样本或加标得到的低、中、高不同浓度水平(浓度分别在0.30ng/ml、1.5ng/ml、6.5ng/ml附近)的样本各20份，每个浓度每天测定两组，连续10天进行相同的前处理和检测，如表4结果表明三个不同浓度的血清样本中vk1的精密度rsd都在4.3％～6.2％之间，表明该方法的批间精密度良好。
[0097]
表4 批内、批间精密度实验结果
[0098]
[0099]
3、加标回收率：
[0100]
收集病人血清样本混合成低、中、高不同浓度(浓度分别在0.30ng/ml、0.90ng/ml、2.10ng/ml附近)的混合血清基质，分别加不同浓度标准品溶液进行加标回收率实验；加标前后的样品，按照本实施例中方法平行处理3次，计算加标样品结果回收率。结果如表5所示，表明此方法在高中低三个不同浓度水平范围的回收率在93.1％～108.2％之间，满足回收率要求，方法准确。
[0101]
表5 加标回收率结果
[0102][0103]
实施例2 样品前处理过程的优化
[0104]
vk1在光照条件下不稳定，在紫外光照射以及碱性条件下易被分解。同时由于vk1脂溶性较强，易被吸附在前处理过程中使用的耗材(离心管、进样瓶等)上。因此，减少前处理过程中vk1在的损失，对于获得准确定量结果以及提升灵敏度都非常关键。在本发明中，通过向前处理过程中的试剂添加保护剂(抗氧化剂bht)，减少对光不稳定带来的降解。同时为避免vk1被塑料离心管或者玻璃瓶吸附，还添加类固醇激素(雌三醇)，通过竞争吸附保护待测目标物。
[0105]
对比同一个样本前处理过程中，在沉淀剂、萃取剂及复溶液中是否添加保护剂(bht和雌三醇)对vk1的影响，平行处理三次结果均表明前处理过程中添加保护剂(bht以及雌三醇)检测得到的vk1响应信号更高(如图3～4所示)，说明加入保护剂能够一定程度保护vk1，有利于提高vk1的检测灵敏度和稳定性。
[0106]
综上述结果，最终选择了在前处理过程中，所有使用的沉淀剂、萃取剂、复溶液中都加入bht和雌三醇保护目标物vk1。
[0107]
实施例3 样本处理后稳定性测试
[0108]
因vk1对光敏感不稳定，在处理过程中和处理后的稳定性都特别重要。收集病人样本混合成高低不同浓度(浓度在6.9ng/ml、0.8ng/ml附近)的混合血清，按照优化后的方法前处理过程中加入保护剂处理，分别将高、低混合血清样本各平行处理10份，将处理后的高、低浓度待测样分别混合在一起，然后用棕色玻璃进样瓶各分装成8份，在进样盘(15℃)条件下保存，分别于0、2、4、8、12、24、36、48h各测定3次，验证样本处理后的保存稳定性；以0h检测结果为参考靶值，其它不同存放时间点的检测结果与0h结果相比。如表6结果表明，回收率均在85％～115％之间，且3次平行测定的cv均在10％以内，说明样品在处理过程中加入保护剂后，在进样盘条件下可稳定放置至少48h。
[0109]
表6 处理后样品放置于进样盘(15℃)的稳定性试验数据
[0110][0111][0112]
实施例4 不同复溶液种类对vk1检测的影响
[0113]
由于在色谱质谱方法中，一般采用优化确定的色谱条件初始流动相作为复溶液，将前处理后的样本进行复溶后上机检测，主要是为了避免出现溶剂效应。但由于vk1极性较弱，且在水相中难溶，同时为了最大程度的保证其离子化效率，本实施例对复溶液的种类进行了研究，比较了两种不同的复溶液体系：纯甲醇溶液(复溶液1)和73％有机相-27％水相
(复溶液2，实施例1中流动相初始比例)。
[0114]
收集病人样本混合成不同浓度水平(浓度分别在0.35ng/ml、3.5ng/ml附近)的血清样本，分别按实施例1中前处理方法，平行处理三批次后进行测定(结果如表7所示)。
[0115]
表7 不同复溶液的比较
[0116][0117]
结果表明采用复溶液2(流动相初始比例溶液)作为复溶液，vk1及其内标d
7-vk1的峰面积均较低，其可能是目标物vk1及其内标未能完全溶解导致离子化效率降低。因此，本发明优选采用纯甲醇作为复溶液体系，vk1的峰面积更高，且不存在溶剂效应。
[0118]
实施例5 流动相条件筛选
[0119]
由于血液样本基质复杂，经过前处理纯化处理后，仍然会有一些杂质会干扰目标物vk1的测定，有些理化性质相似的化合物还会共流出影响vk1离子化效率。而有效的分离杂质和目标物有利于改善基质效应。因此，本发明设计了三组不同的流动相，考察流动相对目标物或者杂质的保留行为，对比不同的流动相组成对目标物vk1的色谱分离效果。
[0120]
组a：有机相为2.5mm甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1v/v％甲酸的2.5mm甲酸铵水溶液；
[0121]
组b：有机相为纯甲醇溶液，水相为纯水溶液；
[0122]
组c：有机相为纯甲醇溶液，水相为含0.1％甲酸的2.5mm甲酸铵水溶液。
[0123]
组a、b、c的色谱结果分别如图5～7所示。所选流动相基本都能将目标物实现色谱分离。但是，组a的流动相(有机相为2.5mm甲酸铵甲醇溶液，水相为含0.1％甲酸的2.5mm甲酸铵水溶液)和梯度洗脱程序，不仅能有效将杂质和目标物进行完全分离，且目标物出峰附近的色谱图中背景噪音较低。同时，该流动相和梯度程序条件下，本方法还能实现多种脂溶性维生素(维生素a、25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3、维生素e、维生素k1)的色谱分离(如图8所示)，抗干扰性强，特异性高，可扩展为多种脂溶性维生素的定量方法。
[0124]
实施例6 空白基质选择和评估
[0125]
对于色谱质谱定量方法的建立以及基质效应的评估，配置标准曲线的空白基质选取十分关键和重要。一方面能够尽量模拟实际样品基质条件，另一方面所选基质不能存在明显的基质效应，不影响准确定量。本发明拟建立人体血清样本中vk1的检测方法，最佳的曲线基质应为人体空白血清基质。但vk1在人体血液中本身存在，即使根据vk1在紫外光照条件下不稳定、易被分解的原理，经过试验，将混合病人血清需放置在紫外灯下常温照射至少60h后，vk1本底才能去除干净(如图9、图10所示)，预处理耗时较长。但是，本发明通过选择
牛血清白蛋白作为替代基质，经测定发现其vk1本底含量可忽略(如图11所示)。因此，基于bsa在节省预处理时间上的优势，我们采取bsa基质开展后续实验。
[0126]
基质效应评估：收集六个不同来源的病人样本(a1-a6)，样本本底浓度范围在0.5～1.5ng/ml；同时使用4wt％bsa将实施例1中vk1标准品中间液ⅱ稀释配制成浓度分别为0.3ng/ml(l)、3.0ng/ml(h)的vk1标准溶液；分别将标准溶液l、h和六个不同来源的病人基质样本按1:1比例进行混合，得到混合样本al和ah；将标准溶液、病人样本和混合样本各平行处理三次，前处理结束后，将得到的待测样品转移至液相进样瓶中，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪(lc-ms/ms)进行检测，通过vk1以及同位素内标d
7-vk1的峰面积，计算相应的比值(vk1/d
7-vk1峰面积之比)。通过混合样品(al、ah)的vk1/d
7-vk1比值与理论值(六个不同来源的病人样本a1-a6与低、高浓度的标准工作溶液响应的均值)的差异均小于20％，说明基质效应可忽略，结果如表8，表9所示。
[0127]
表8 基质效应结果(样本混合前)
[0128][0129]
表9 基质效应结果(样本混合后)
[0130]
[0131][0132]
综上所述，本发明方法采用高效液相色谱-质谱联用，结合特定的样品前处理步骤、液相色谱条件和质谱检测条件，实现了一种特异性强、灵敏度高、抗基质干扰能力好、具有很好的重现性的血清中维生素k1检测方法。尤其本方法的灵敏度相比于已报道的方法更高(定量限更低)，能覆盖更广泛的人群样本检测，特别是针对凝血功能异常的患者，有利于开展临床上对血清中vk1含量进行监测，可以用于诊断vk1相关的疾病，为临床治疗提供服务。
[0133]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0134]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。