一种修复有机污染土壤的木质纤维基负载微生物材料的制备方法与流程

1.本发明属于有机污染土壤修复领域，特别涉及一种修复有机污染土壤的木质纤维基负载微生物材料的制备方法。


背景技术：

2.近些年生物修复技术及其在石油烃/多环芳烃污染土壤修复领域已掀起一阵研究热潮，其中土壤污染是我国现阶段发展所面临的重要挑战。生物修复技术是利用微生物及其它生物将存在于土壤中的有毒有害有机污染物降解成二氧化碳和水或其它无害物质的技术和方法。与物理化学修复技术相比生物修复技术具有安全、破坏性小、效果好、操作简单以及不易导致二次污染等优点。根据治理过程中添加微生物的来源不同，可将微生物修复分为自然衰减法、生物刺激修复技术和生物强化修复技术，其中生物强化修复技术具有菌剂浓度高、降解能力强、降解迅速等特点。在健康和环境影响最小化的前提下实现石油烃或多环芳烃污染土壤的减量化和无害化修复。
3.木质纤维基是农业废弃物的主要成分，其由纤维素、半纤维素和木质素构成，作为自然界最大量的可回收利用资源。木质纤维基是一种功能性纤维基，其表面蓬松具有微孔道结构，未经改性处理的木质纤维基对微生物吸附作用弱，且其微孔道不利于微生物获取营养物质、溶解氧及微生物代谢产物的排放。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种修复有机污染土壤的木质纤维基负载微生物材料的制备方法，本发明通过对木质纤维基进行化学
‑
物理改性，解决了传统的木质纤维基吸附作用弱，不利于微生物获取营养物质、溶解氧及微生物代谢产物排放的问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种修复有机污染土壤的木质纤维基负载微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)木质纤维基的提取及纯化：选取农业废弃物进行机械绞碎，过土壤筛筛分处理，筛分后的固体颗粒进行碱液浸泡，碱液浸泡后的固体颗粒在高温压力锅内蒸煮，蒸煮完成后冷却至室温，收集滤液滴加酸性溶液调节ph，待滤液中的固体完全析出后过滤，滤渣依次利用酸性溶液、蒸馏水洗涤多次，冷冻干燥24h至恒重，即得到木质纤维基材料。
8.(2)木质纤维基氨基酸改性：在烧杯中先加入木质纤维基和蒸馏水，搅拌均匀后滴加碱液调节溶液ph，将调节完ph的混合液移至三口瓶，在三口瓶中依次加入氨基酸和甲醛，搅拌反应，恒温酸析，酸析完成后将反应液冷却至室温，固液分离，滤渣先通过蒸馏水洗涤多次，再冷冻干燥24h至恒重，即得到氨基酸改性木质纤维基。
9.(3)水热法制备掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料：先在烧杯中依次加入磷酸铵盐和蒸馏水，搅拌均匀，然后加入氨基酸改性木质纤维基材料，搅拌均匀，将混合液移至高
温高压反应釜内反应一定时间，冷却至室温，进行酸析，酸析完成后固液分离，滤渣先通过蒸馏水洗涤多次，再冷冻干燥24h至恒重，即得到掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料。
10.(4)微生物菌种负载：取一定量菌种接种至活化的cpda培养基中，即得到菌种活化液，在一定温度下培养，然后将菌种活化液浸泡至掺杂n、p的氨基酸改性木质纤维基中，混合均匀，静置培养一段时间，离心倾倒上清液，冷冻干燥，即得到负载微生物的木质纤维基。
11.进一步地，在步骤(1)中，所述农业废弃物包括水稻秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、黄豆秸秆、稻壳、花生壳中的一种或几种。
12.进一步地，在步骤(1)中，所述土壤筛目数为6
‑
20目，所述高温压力锅蒸煮时间为1.5
‑
3.0h，蒸煮温度为160
‑
180℃，所述滤液ph值调节至3
‑
4。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺中的任一种。
14.进一步地，在步骤(2)中，所述溶液ph值调节至9
‑
11，所述木质纤维基、甲醛、氨基酸的质量比为3：(3.0
‑
6.0)：(2.0
‑
8.0)，所述木质纤维基与氨基酸反应时间为4
‑
6h。
15.进一步地，在步骤(3)中，所述磷酸铵盐为磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢铵、次磷酸铵中的任一种。
16.进一步地，在步骤(3)中，所述氨基酸改性木质纤维基、磷酸铵盐、蒸馏水的质量比为2.0：(0.5
‑
1.5)：(10
‑
20)，反应时间为2
‑
4h，反应温度为175℃
‑
260℃。
17.进一步地，在步骤(4)中，所述菌种为杆状革兰氏阴性菌体，所述菌种活化液培养温度为30℃，培养时间为24h。
18.进一步地，在步骤(4)中，所述菌种活化液与掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料的质量比为(2
‑
5)：(1
‑
2)，所述菌种在木质纤维基中静置培养时间为8
‑
12h。
19.综上所述，由于本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
20.1、本发明利用木质纤维基负载微生物降解有机污染物，木质纤维基由多个大分子结构交联组成，其表面疏松多孔，且分子结构上含有多种官能团易于改性，在本发明中木质纤维来自于农业废弃物，如水稻秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、黄豆秸秆、稻壳、花生壳等，提高了资源的利用率；
21.2、本发明通过氨基酸对木质纤维基改性，得到的氨基酸改性木质纤维基引入了微生物所需的氮源，提高了生物相容性，利于微生物的生长繁殖；
22.3、本发明通过对氨基酸改性木质纤维基进行进一步改性，利用水热法将n、p元素加入到氨基酸改性木质纤维基中得到掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料，进一步提高了材料表面蓬松度、增大了比表面积和孔径，利于微生物附着于材料内部，同时提供了微生物生存繁殖所需的n、p营养物，蓬松多孔结构起到吸水保湿和溶氧作用；
23.4、本发明中的改性木质纤维基利用其疏松多孔结构将土壤中的污染物吸附于其表面，提高了微生物与污染物接触面积，加速有机污染物的降解，从而实现土壤中有机污染物无害化降解。
附图说明
24.图1是本发明木质纤维基的扫描电镜图；
25.图2是本发明掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料的扫描电镜图。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
27.一种修复有机污染土壤的木质纤维基负载微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)木质纤维基的提取及纯化：选取农业废弃物进行机械绞碎，过土壤筛筛分处理，筛分后的固体颗粒进行碱液浸泡，碱液浸泡后的固体颗粒在高温压力锅内蒸煮，蒸煮完成后冷却至室温，收集滤液滴加酸性溶液调节ph，待滤液中的固体完全析出后过滤，滤渣依次利用酸性溶液、蒸馏水洗涤多次，冷冻干燥24h至恒重，即得到木质纤维基材料；
29.农业废弃物包括水稻秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆、黄豆秸秆、稻壳、花生壳中的一种或几种；土壤筛目数为6
‑
20目；高温压力锅蒸煮时间为1.5
‑
3.0h；蒸煮温度为160
‑
180℃；滤液ph值调节至3
‑
4。
30.(2)氨基酸改性木质纤维基：在烧杯中先加入木质纤维基和蒸馏水，搅拌均匀后滴加碱液调节溶液ph，将调节完ph的混合液移至三口瓶，在三口瓶中依次加入氨基酸和甲醛，搅拌反应，恒温酸析，酸析完成后将反应液冷却至室温，固液分离，滤渣先通过蒸馏水洗涤多次，再冷冻干燥24h至恒重，即得到氨基酸改性木质纤维基；
31.氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺中的任一种；溶液ph值调节至9
‑
11；木质纤维基、甲醛、氨基酸的质量比为3：(3.0
‑
6.0)：(2.0
‑
8.0)；木质纤维基与氨基酸反应时间为4
‑
6h。
32.(3)水热法制备掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料：先在烧杯中依次加入磷酸铵盐和蒸馏水，搅拌均匀，然后加入氨基酸改性木质纤维基材料，搅拌均匀，将混合液移至高温高压反应釜内反应一定时间，冷却至室温，进行酸析，酸析完成后固液分离，滤渣先通过蒸馏水洗涤多次，再冷冻干燥24h至恒重，即得到掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料。
33.磷酸铵盐为磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢铵、次磷酸铵中的任一种；氨基酸改性木质纤维基、磷酸铵盐、蒸馏水的质量比为2.0：(0.5
‑
1.5)：(10
‑
20)；反应时间为2
‑
4h；反应温度为175℃
‑
260℃。
34.(4)微生物菌种负载：取一定量菌种接种至活化的cpda培养基中，即得到菌种活化液，在一定温度下培养，然后将菌种活化液浸泡至掺杂n、p的氨基酸改性木质纤维基材料中，混合均匀，静置培养一段时间，离心倾倒上清液，冷冻干燥，即得到负载微生物的木质纤维基。
35.菌种为杆状革兰氏阴性菌体，杆状革兰氏阴性菌体是多环芳烃/石油烃降解菌，其体外具有菌毛，可粘附在比表面积大的改性木质纤维基表面，进入材料孔隙易与孔壁粘黏不易脱附下来，利于微生物的负载；菌种活化液培养温度为30℃，培养时间为24h；菌种活化液与掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料的质量比为(2
‑
5)：(1
‑
2)，菌种在木质纤维基中静置培养时间为8
‑
12h。
36.如图1和图2所示，电镜观察改性前的木质纤维基其表面光滑无孔道结构，不利于负载微生物，掺杂n、p的氨基酸改性木质纤维基表面蓬松多孔，利于微生物附着于表面及微
孔道内，同时掺杂n、p能提供微生物生存生长所需的营养源，更利于微生物的负载及生存。
37.实施例1
38.(1)木质纤维基的提取及纯化：首先选取玉米秸秆进行机械绞碎，然后过6目土壤筛筛分处理，筛分后的固体颗粒进行碱液浸泡24h，然后高温压力锅160℃蒸煮1.0h，冷却至室温，收集滤液滴加酸性溶液调节ph为3，待固体完全析出后过滤，滤渣酸性溶液洗涤后蒸馏水洗涤多次，烘干即得到木质纤维基材料。
39.(2)木质纤维基的赖氨酸改性：将木质纤维基、甲醛、赖氨酸按质量比为3:3.0:2.0的比例进行反应，在烧杯中先加入1.5g木质纤维基和15ml蒸馏水搅拌均匀后滴加碱液调节溶液ph为9，将混合液移至三口瓶，然后加入1.0g赖氨酸和1.5g甲醛，升温至60℃反应2.0h。恒温酸析，冷却至室温过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到赖氨酸改性的木质纤维基。
40.(3)水热法制备掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料：将赖氨酸改性木质纤维基、磷酸铵、蒸馏水按质量比为2.0：0.5：10的比例进行反应，先在烧杯中加入0.5g的磷酸铵和10ml蒸馏水搅拌均匀，然后加入2.0g赖氨酸改性木质纤维基搅拌混合均匀，再将混合液移至高温高压反应釜内，175℃反应2.0h，冷却至室温，依次进行酸析、过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到掺杂n、p的赖氨酸改性木质纤维基材料。
41.(4)微生物菌种负载：取一定量杆状革兰氏阴性菌体接种至活化的cpda培养基中，即得到革兰氏阴性菌体活化液，30℃下培养24h，然后取革兰氏阴性菌体活化液按质量比2：1浸泡至灭菌的掺杂n、p赖氨酸改性木质纤维基中，混合均匀，静置培养8h，离心倾倒上清液，冷冻干燥，即得到负载革兰氏阴性菌体木质纤维基材料。
42.实施例2
43.(1)木质纤维基的提取及纯化：首先选取黄豆秸秆进行机械绞碎，然后过10目土壤筛筛分处理，筛分后的固体颗粒进行碱液浸泡24h，然后高温压力锅175℃下蒸煮2h，冷却至室温，收集滤液滴加酸性溶液调节ph为3，待固体完全析出后过滤，滤渣酸性溶液洗涤后蒸馏水洗涤多次，烘干即得到木质纤维基材料。
44.(2)木质纤维基的赖氨酸改性：将木质纤维基、甲醛、精氨酸按质量比为3:6.0:8.0的比例进行反应，在烧杯中先加入1.5g木质纤维基和15ml蒸馏水搅拌均匀后滴加碱液调节溶液ph为10，将混合液移至三口瓶，然后加入4.0g精氨酸和3.0g甲醛，升温至80℃反应4h。恒温酸析，冷却至室温过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到精氨酸改性的木质纤维基。
45.(3)水热法制备掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料：将精氨酸改性木质纤维基、磷酸二氢铵、蒸馏水按质量比为2.0:1.0:15的比例进行反应，先在烧杯中加入1.0g的磷酸二氢铵和15ml蒸馏水搅拌均匀，然后加入2.0g精氨酸改性木质纤维基搅拌混合均匀，再将混合液移至高温高压反应釜内，200℃反应3h，冷却至室温，依次进行酸析、过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到掺杂n、p的精氨酸改性木质纤维基材料。
46.(4)微生物菌种负载：取一定量杆状革兰氏阴性菌体接种至活化的cpda培养基中，即得到革兰氏阴性菌体活化液，30℃下培养24h，然后取革兰氏阴性菌体活化液按质量比3：2浸泡至灭菌的掺杂n、p精氨酸改性木质纤维基中，混合均匀，静置培养10h，离心倾倒上清液，冷冻干燥，即得到负载革兰氏阴性菌体木质纤维基材料。
47.实施例3
48.(1)木质纤维基的提取及纯化：首先选取花生壳进行机械绞碎，然后过20目土壤筛
筛分处理，筛分后的固体颗粒进行碱液浸泡24h，然后高温压力锅180℃蒸煮3.0h，冷却至室温，收集滤液滴加酸性溶液调节ph为4，待固体完全析出后过滤，滤渣酸性溶液洗涤后蒸馏水洗涤多次，烘干即得到木质纤维基材料。
49.(2)木质纤维基的赖氨酸改性：将木质纤维基、甲醛、天冬酰胺按质量比为3:5.0:5.0的比例进行反应，在烧杯中先加入1.5g木质纤维基和15ml蒸馏水搅拌均匀后滴加碱液调节溶液ph为11，将混合液移至三口瓶，然后加入2.5g天冬酰胺和2.5g甲醛，升温至100℃反应6.0h。恒温酸析，冷却至室温过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到天冬酰胺改性的木质纤维基。
50.(3)水热法制备掺杂n、p氨基酸改性木质纤维基材料：将天冬酰胺改性木质纤维基、磷酸氢铵、蒸馏水按质量比为2.0:1.5:20的比例进行反应，先在烧杯中加入1.5g的磷酸氢铵和20ml蒸馏水搅拌均匀，然后加入2.0g天冬酰胺改性木质纤维基搅拌混合均匀，再将混合液移至高温高压反应釜内，240℃反应4.0h，冷却至室温，依次进行酸析、过滤、蒸馏水洗涤、干燥得到掺杂n、p的天冬酰胺改性木质纤维基材料。
51.(4)微生物菌种负载：取一定量杆状革兰氏阴性菌体接种至活化的cpda培养基中，即得到革兰氏阴性菌体活化液，30℃下培养24h，然后取革兰氏阴性菌体活化液按质量比5：1浸泡至灭菌的掺杂n、p天冬酰胺改性木质纤维基中，混合均匀，静置培养12h，离心倾倒上清液，冷冻干燥，即得到负载革兰氏阴性菌体木质纤维基材料。
52.实施例4
53.将实施例1
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3合成的负载革兰氏阴性菌体木质纤维基粉末分别溶于水中，形成混合均匀的三种菌液。250ml棕色广口瓶中加入100g有机污染土壤，然后分别移取30ml上述菌液搅拌均匀，保持土壤含水率在30％左右，每组实验设置两组平行，养护7d、14d、21d、30d，取样测定土壤中有机污染物残余量，有机污染物降解率如表1所示：
54.表1养护不同时间有机污染物降解率
[0055][0056]
从表中可以看出，添加了实施例1
‑
3合成材料的有机污染土壤中的有机污染物降解率远高于未添加合成材料的空白对照组，其中通过实施例2制备的木质纤维基微生物负载材料的降解性能优于其它实施例，在第30天时，降解率达到了63.25％，降解效果最好。
[0057]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其他形式的限定，任
何熟悉本专业的技术人员可能利用上述解释的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例用于其他领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案保护的范围。