一种提高红曲红色素热稳定性的方法和应用与流程

1.本发明属于红曲色素生产和应用技术领域，具体涉及一种提高红曲红色素热稳定性的方法和应用。


背景技术：

2.红曲红色素是红曲菌次生代谢产生的一种安全无毒的天然色素，也是目前中国国家标准中认可的三种红曲来源的食品色素添加剂(红曲米、红曲红和红曲黄色素)中的一种，已经广泛应用于人们的日常生活。一般来说，红曲红色素易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，而难溶于水，并且红曲红色素仅在中性和碱性环境(ph6～11)时比较稳定，当ph呈酸性时，会引起色价降低。有研究表明，ph2.5～4.5时，红曲红色素色价会降低20％(廖远东，2种天然红色色素的稳定性及其在果汁饮料中的应用效果探析，2019)。红曲红色素的这些特性限制了其在酸性食品如饮料中的推广应用。
3.目前绝大多数饮料均属于低ph产品，比如：碳酸饮料ph2.2～4.9，果汁饮料ph3.0左右，酸奶ph＜4.6。一般来说，饮料的热处理加工过程包括巴氏杀菌和热灌装，饮料生产常用的巴氏杀菌温度在63～95℃，而灌装工艺要求85℃(热灌装)或68℃(中温灌装)。因此，饮料中应用的色素添加剂必须具备在低ph环境中热稳定好的特性。有研究将红曲红色素直接应用于碳酸饮料生产中，发现经高温处理后避光静置放置10天后，色素保存率仅为46％，表明红曲红色素在碳酸饮料中存在热稳定性差的问题，这极大限制了红曲红色素的应用。专利cn201811011840.2中公开了“一种水溶性红曲红色素及其制备方法”，从水溶性角度对红曲色素进行改性，制备得到了水溶性好的红曲红色素，但并未提及如何提高红曲红色素的热稳定性。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的空白，从提高红曲红色素水溶性和低ph环境下的热稳定性角度出发，提供了一种提高红曲红色素热稳定性的方法和应用，通过在红曲橙色素提取液中加入氨基酸溶液，并对氨基酸种类进行优选，利用红曲橙色素与氨基酸之间的亲氨基反应来制备红曲红色素，从而显著提高了红曲红色素的水溶性及在酸性条件下的热稳定性，可将其应用于酸性食品，如酸性饮料的加工生产中，避免高温杀菌及灌装过程中红曲红色素不稳定导致的失色等问题，具有广泛的应用前景和市场应用价值。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.本发明提供了一种提高红曲红色素热稳定性的方法，所述方法包括：
7.步骤1、将纯化的红曲橙色素溶解于甲醇中，制得红曲橙色素溶液，同时将氨基酸溶解于缓冲液中，制得氨基酸溶液；
8.步骤2、将所述红曲橙色素溶液与所述氨基酸溶液混合，使红曲橙色素与氨基酸的比例为1mg：0.002～0.1mmol，加入甲醇定容，于4～40℃条件下摇床孵育5min～3h，得到由氨基酸衍生化而来的红曲红色素，即为热稳定性提高的红曲红色素；
9.其中所述氨基酸选自：组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
10.进一步地，所述方法用于提高酸性条件下红曲红色素的热稳定性。
11.进一步地，所述酸性条件为大于ph 3，小于ph 7，所述热稳定性的温度为60～95℃。
12.进一步地，步骤1中将所述红曲橙色素溶解于包含体积分数0.1％甲酸的甲醇溶液中。
13.进一步地，步骤1中所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、pipes缓冲液中的任意一种或多种。
14.进一步地，步骤1中所述缓冲液为ph 7.0的磷酸盐缓冲液。
15.进一步地，步骤2中所述红曲橙色素与氨基酸的比例为1mg：0.08mmol。
16.进一步地，步骤2中将1ml浓度为1mg/ml的红曲橙色素溶液与5ml浓度为16mmol/l的氨基酸溶液混合，加入甲醇定容至10ml，于30℃条件下摇床孵育2h。
17.进一步地，步骤2中还包括：孵育结束后，向反应体系中加入去离子水，调整甲醇含量并过萃取柱，用水冲洗除去反应体系中的盐离子，除盐后用甲醇洗脱，得到由氨基酸衍生化而来的红曲红色素。
18.进一步的，加入去离子水调整甲醇浓度为20％后过萃取柱，用水冲洗反应体系中的盐离子，除盐后用浓度90％的甲醇溶液洗脱，得到由氨基酸衍生化而来的红曲红色素。
19.本发明还提供了一种采用上述方法制备得到的耐酸耐热的红曲红色素。
20.本发明还提供了所述耐酸耐热的红曲红色素在酸性食品生产中的应用。
21.进一步的，所述酸性食品为酸性饮料，其ph值大于3，小于7。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从提高红曲红色素水溶性和低ph环境下的热稳定性角度出发，在红曲橙色素(成分为红斑红曲素和红曲玉红素)提取液中加入氨基酸溶液来制备红曲红色素，并对氨基酸进行优选，优选为组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的任意一种，从而显著提高了红曲红曲红色素水溶性，且在低ph值环境中热稳定性，即本发明提供了一种可有效提高红曲红色素热稳定性方法，采用该方法制备得到的红曲红色素水溶性好，颜色稳定，可将其应用于酸性食品如酸性饮料的加工生产中，从而拓宽了红曲红色素的添加剂的应用领域，促进相关产业的发展，具有极高的市场应用前景和价值。
附图说明
23.图1为本发明实施例2中四种氨基酸衍生而来的红曲红色素和葡萄皮红色素制备的饮料的感官颜色；
24.图2为本发明实施例2中四种氨基酸衍生而来的红曲红色素和葡萄皮红色素制备的饮料经65℃处理后的色素残留率；
25.图3为本发明实施例2中四种氨基酸衍生而来的红曲红色素和葡萄皮红色素制备的饮料经75℃处理后的色素残留率；
26.图4为本发明实施例2中四种氨基酸衍生而来的红曲红色素和葡萄皮红色素制备的饮料经85℃处理后的色素残留率；
27.图5为本发明实施例2中四种氨基酸衍生而来的红曲红色素和葡萄皮红色素制备
的饮料经95℃处理后的色素残留率；
28.图6为本发明实施例2中组氨酸衍生化的红曲红色素的色谱图和结构表征。
具体实施方式
29.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1红曲红色素的制备
31.1、红曲橙色素的制备
32.采用本领域常规方法进行红曲橙色素的发酵和提取，包括以下步骤：
33.(1)孢子的制备：将红色红曲菌m
‑
7(来源于cctcc hf 2008638，中国典型培养物保藏中心)接种到察氏酵母膏琼脂培养基，28℃培养5d～15d。用适量无菌水洗下孢子，经两层无菌擦镜纸过滤除去菌丝，得到的孢子悬液用血球计数板计数，并将浓度调整为105个/ml。其中，察氏酵母膏琼脂培养基具体为：nano
3 3.0g/l，k2hpo
4 1.0g/l，kcl 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，蔗糖30.0g/l，酵母膏5.0g/l。
34.(2)红曲橙色素的液态发酵：采用低ph(ph＝3)条件下的两步发酵过程。按1％的接种量将孢子悬浮液(105个/ml)接种于50ml马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)中，于28℃，200rpm恒温震荡条件培养40h，加入50ml灭菌的柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液(0.2mol/l，ph＝3)，于28℃，200rpm恒温震荡条件继续培养5d。
35.(3)红曲橙色素的提取：发酵完毕后，发酵液经滤布抽真空过滤，收集菌丝体。用2倍发酵液体积的ph＝2的酸性溶液冲洗菌丝，洗去其表面残留的水溶性色素和培养基。将菌丝表面水分用吸水纸压干，转移至发酵液体积2倍的70％的乙醇溶液中，其中乙醇溶液已事先用甲酸调至ph＝2，可避免橙色素转变为红色素。然后10000rpm高速均质1min后，用300目滤布过滤除去菌丝得到橙色素原液。
36.(4)红曲橙色素的纯化：向上述橙色素原液中加入0.5倍体积的甲酸溶液(ph＝2)，2800rpm涡旋5min，待充分混合后置于
‑
20℃静置2h，取出后10000rpm离心20min，弃去上清得到橙色素晶体，即为纯化的红曲橙色素(主要成分为红斑红曲素和红曲玉红素)。
37.2、氨基酸衍生化红曲红色素的制备
38.将纯化的红曲橙色素溶解在甲醇(含0.1％甲酸)中，配制成1mg/ml的红曲橙色素溶液。分别将14种天然氨基酸溶解在200mmol/l，ph7.0的磷酸盐缓冲液中，配制成16mmol/l的氨基酸溶液。然后将红曲橙色素溶液和氨基酸溶液混合，每10ml反应体系中含上述氨基酸溶液5ml，红曲橙色素溶液1ml，甲醇4ml。在30℃，250rpm/min摇床中孵育2h。待反应完成后向反应体系加入去离子水，将体系中甲醇含量调至20％，然后将反应液缓慢过c
18
固相萃取柱，加水将缓冲盐洗脱除去，再用90％的甲醇溶液洗脱，将收集到的红曲红色素溶液旋转蒸发干燥，即得到除盐后的氨基酸衍生化的红曲红色素。同时利用氨水与红曲橙色素之间的亲氨基反应制备得到传统的红曲红色素(主要成分红斑玉红胺和红斑红曲胺)作为对照组，其中氨水的浓度为1mol/l，其余的反应条件与氨基酸和橙色素的反应条件相同。
39.分别测定14种氨基酸衍生化的红曲红色素和传统红曲红色素的水溶性，包括溶解
度(g/l)和色价(au
500nm
)数据，测定方法为：称取25.0mg红曲红色素，加入1ml去离子水充分溶解。若红曲红色素完全溶解，则其在水中的溶解度记为>25g/l，稀释合适倍数后在波长500nm处测吸光值，根据公式：色价(au
500nm
)＝吸光值
×
稀释倍数，计算此时红曲红色素溶液的色价(au
500nm
)，其饱和溶液的色价记为大于该色价值；若红曲红色素未完全溶解，10000r/min离心5min，取出上清后，将沉淀烘干并称重，根据减少的质量计算其在水中的溶解度(g/l)，离心上清稀释合适倍数后在波长500nm处测吸光值，根据公式：色价(au
500nm
)＝吸光值
×
稀释倍数，计算红曲红色素的饱和水溶液色价(au
500nm
)。测定结果如表1所示。
40.表1氨基酸衍生化红曲红色素和传统红曲红色素(对照)的溶解度和色价
[0041][0042]
结果显示，传统红曲红色素(对照)的溶解度仅为3.9g/l，饱和溶液的色价为52.0。除了精氨酸，其他氨基酸衍生化红曲红色素与对照相比，水溶性都有不同程度提高。并且除了精氨酸和赖氨酸衍生化红曲红色素外，其余的共12种氨基酸衍生化红曲红色素的溶解度均＞25g/l，溶解度至少是传统红曲红色素(对照)的6.4倍，同时色价值均＞600，相比于对照有显著提高。
[0043]
3、耐酸耐热性红曲红色素的初筛
[0044]
对上述14种氨基酸衍生化红曲红色素和传统红曲红色素在酸性条件下的热稳定性进行评价和筛选，具体为：向上述14种氨基酸衍生化红曲红色素和传统红曲红色素中分别加入到不同ph(ph 3,5,7)的缓冲液，然后置于80℃加热6h，测定色素的残留率(％)：
[0045]
色素残留率(％)＝(处理后的色价/处理前的色价)
×
100％。
[0046]
测定方法具体为：配制0.2mol/l的柠檬酸
‑
磷酸盐缓冲液(ph 3、ph 5、ph 7)。将氨基酸衍生化红曲红色素和传统红曲红色素用40％的甲醇水溶液溶解，使其在500nm处的吸光值为(2.0
±
0.2)，再与不同ph(ph 3、5、7)的柠檬酸
‑
磷酸盐缓冲液1:1混合，得到不同ph值的红曲红色素溶液。取10ml不同ph值的红曲红色素溶液置于密封玻璃瓶中，在80℃下避光加热6h，紫外可见分光光度计测定样品的色价(au
500nm
)并计算色素的残留率，测定结果如表2所示。
[0047]
表2不同ph条件下氨基酸衍生化红曲红色素和传统红曲红色素(对照)的热稳定性
[0048][0049][0050]
结果显示，酸性条件下，不同氨基酸衍生化红曲红色素的热稳定性存在差异，但均显著高于传统红曲红色素(对照)，其中组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等4种氨基酸衍生化红曲红色素的热稳定性优于其它红曲红色素。经80℃加热6h后，组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸衍生化的红曲红色素在ph为3时的色素残留率分别为54.95％、45.07％、47.23％和45.42％；在ph为5时的色素残留率分别为49.30％、45.08％、43.20％和37.82％，显著高于传统红曲红色素(对照)及其它10种氨基酸衍生化的红曲红色素的残留率。即本实施提供筛选，共得到了4种耐酸性、热稳定的红曲红色素，分别为：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和组氨酸衍生化的红曲红色素。
[0051]
实施例2红曲红色素的应用和性能测定
[0052]
在实施例1筛选得到了4种水溶性好、且耐酸耐热的红曲红色素的基础上，本实施例分别将其应用于食品，具体为酸性饮料中，并对其性能进行测定。
[0053]
1、酸性饮料的制备
[0054]
酸性饮料的制备根据amruta et al.,evaluating the effect of additives on stability of betacyanin pigments from basella rubra in a model beverage system during storage，journal of food science and technology中公开的配方进行调配。向0.1mol/l，ph5.0的柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液中加入13％白砂糖，0.05％苯甲酸钠和对应的色素，混合均匀后得到酸性饮料。
[0055]
分别选取酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和组氨酸衍生化的红曲红色素应用于酸性饮料中。由于传统红曲红色素在该饮料体系中溶解性差，容易产生沉淀，所以实施例采用本领域常规色素
‑
葡萄皮红色素作为对照。其中葡萄皮红的添加量参照文献：“4种水溶性天然红色素在碳酸饮料中应用稳定性分析”中公开的用量加入。其余4种氨基酸衍生红色素的用量根据配置的葡萄皮红饮料的感官颜色添加，调配成与其感官颜色一致，调配后的颜色如图1所示，其中a为葡萄皮红色素(对照)，b、c、d、e分别为为苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸衍生化的红曲红色素。
[0056]
2、热稳定性表征
[0057]
分别对这5种包含不同红色素的饮料的热稳定性进行表征，具体为：
[0058]
(1)将5种包含不同红色素的饮料置于65℃热处理温度下，每10min取样检测色素残留率，检测结果如图2所示；
[0059]
(2)将5种包含不同红色素的饮料置于75℃热处理温度下，每5min取样检测色素残留率，检测结果如图3所示；
[0060]
(3)将5种包含不同红色素的饮料置于85℃热处理温度下，每5min取样检测色素残留率，检测结果如图4所示；
[0061]
(4)将5种包含不同红色素的饮料置于95℃热处理温度下，每30s取样检测色素残留率，检测结果如图5所示。
[0062]
结果显示，酸性饮料经过65℃处理50min后，葡萄皮红色素(对照)残留率仅为68.37％，其余4种氨基酸衍生化的红曲红色素的色素残留率均高于对照，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸衍生化的红曲红色素残留率分别为79.88％、82.53％和85.45％，而组氨酸衍生化的红曲红色素残留率最高，高达96.56％。
[0063]
酸性饮料经过75℃处理40min后，葡萄皮红色素(对照)残留率为55.78％，其余4种氨基酸衍生化的红曲红色素的色素残留率均高于对照，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸衍生化的红曲红色素残留率分别为73.64％、81.59％和74.05％，组氨酸衍生化的红曲红色素残留率最高，为87.55％。
[0064]
酸性饮料经过85℃处理40min后，葡萄皮红色素(对照)残留率仅为32.87％，其余4种氨基酸衍生化的红曲红色素的色素残留率均高于对照，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸衍生化的红曲红色素残留率分别为56.19％、61.53％和58.10％，而组氨酸衍生化的红曲红色素残留率最高，仍高达87.53％。
[0065]
酸性饮料经过95℃处理660s后，葡萄皮红色素(对照)残留率为38.73％，其余4种氨基酸衍生化的红曲红色素的色素残留率均高于对照，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸衍生化的红曲红色素残留率分别为74.50％、82.18％和77.80％，而组氨酸衍生化的红曲红色素残留率仍维持较高，高达94.36％。
[0066]
上述结果说明，无论是经过巴氏杀菌(63～95℃)，还是灌装(68℃和85℃)，上述4种氨基酸衍生化的红曲红色素的色素残留率均显著高于对照葡萄皮红色素，进一步的，其中组氨酸衍生化的红曲红色素的色素残留率最高，均在87％～98％之间，并且随着处理时间的延长，色素残留率一直保持稳定，没有出现明显的下降，即说明组氨酸衍生化的红曲红色素的热稳定性最好。经过验证，采用高温短时的巴氏杀菌(95℃)对色素的影响最小，加热30～660s后色素残留率均＞92％。其中经95℃杀菌60s后，采用gb 4789
‑
2015《食品卫生微生物学检验》检测方法对饮料中微生物指标进行检测，菌落总数、霉菌、酵母菌均未检出，即符合饮料的食品安全国家标准(gb7101
‑
2015)。
[0067]
3、组氨酸衍生化的红曲红色素结构表征
[0068]
将筛选得到的组氨酸衍生化的红曲红色素分别进行高效液相色谱(hplc)、紫外可见光谱(uv
‑
vis)和高效液相色谱质谱联用(lc
‑
ms)分析，然后根据质谱检测得到的准分子离子[m h] 峰确定各衍生化的红曲红色素的分子量，并与目前报道的100多种红曲色素的分子量进行比对，进行定性分析。再根据红曲橙色素(红斑红曲素和红曲玉红素)与氨基酸的亲氨基反应原理，推测得到了组氨酸衍生化的红曲红色素的化学结构，具体如图6所示。
[0069]
由图6a可以看出，液相色谱图中在保留时间5.728和6.293min各出现一个色谱峰，表明组氨酸衍生化的红曲红色素中存在两种色素组分。由图6b可以看出，紫外可见光谱中5.728min、6.293min对应的色素组分最大吸收峰分别为526nm和528nm，符合红曲红色素的紫外可见吸收光谱特征，说明这两种色素组分的颜色均为红色。由图6c可以看出，在质谱的正离子模式下，5.728min和6.293min对应的一级母离子碎片质荷比分别为492.2130和520.2435，推断的分子式分别为c
27
h
29
n3o6(分子量491.54)和c
29
h
33
n3o6(分子量519.60)，分别与两种红曲橙色素(红斑红曲素和红曲玉红素)同组氨酸发生亲氨基反应所生成产物相符合。
[0070]
综上所述，本发明提供了一种可显著提高红曲红色素稳定性的方法，即在红曲橙色素溶液中加入组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸溶液，制备得到氨基酸衍生化的红曲红色素，结果证明这四种氨基酸衍生化的红曲红色素在低ph值环境下仍保持稳定，其中组氨酸衍生化的红曲红色素经65～95℃热处理后色素残留率保持在87％～96％，可将其应用于酸性食品如酸性饮料的加工生产中，在高温杀菌及灌装的同时维持色素稳定，具有极高的应用价值。
[0071]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。