松针中烯醇类物质调控三七根际微生物群落结构的应用的制作方法

1.本发明涉及三七种植技术领域，具体而言，本发明涉及松针中烯醇类物质在调控三七根际微生物群落结构中的应用。


背景技术：

2.三七(panax notoginseng(burk.)f.h.chen)又名田七、金不换，为五加科人参属多年生宿根草本植物。三七具有散瘀止血、消肿定痛的功效，自古以来就受到人们的青睐，迄今已有400余年的驯化栽培历史。目前，三七产区集中在云南省文山、砚山、马关、广南、邱北、泸西、弥勒、个旧、蒙自、建水、石屏、屏边、石林，以及广西壮族自治区靖西等县市，每年三七的产量超过5万吨，产值接近千亿元。
3.然而，三七在种植过程中存在严重的连作障碍。连作障碍(replant problems)是指同一物种连续种植在同一土地上，出现的长势变弱、品质降低或者植株死亡等现象(张重义、林文雄，药用植物的化感自毒作用与连作障碍[j].中国生态农业学报，2009,17(01):189
‑
196)。目前已有大量的研究人员证实，引起三七连作障碍的原因主要有：1)土壤理化性质的恶化；2)三七病原菌的积累；3)植物根系分泌自毒物质，影响自身和后代的生存(zhu s,fen l,guo c,et al.negative plant soil feedback driven by re assemblage of the rhizosphere microbiome with the growth of panax notoginseng[j].frontiers in microbiology,2019,10:1597；官会林、陈昱君、刘士清等，三七种植土壤微生物类群动态与根腐病的关系[j].西南农业大学学报(自然科学版)，2006,(05):706
‑
709；weiw,yang m,liu y,et al.fertilizer n application rate impacts plant soil feedback in a sanqi production system[j].science of the total environment,2018,633:796
‑
807；yang m,zhang x,xu y,et al.autotoxic ginsenosides in the rhizosphere contribute to the replant failure of panax notoginseng[j].plos one,2015a,10(2):e0118555)。
[0004]
根际微生物是指紧密附着于根际土壤颗粒中的微生物，以细菌为主，其中革兰氏阴性菌占优势，最常见的有假单胞菌属、黄色杆菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌属等。数量一般高于非根际土壤，不同植物的根际微生物组成和数量不同。植物生长过程中，凋亡的根系及其脱落物(根毛、表皮细胞、根冠等)、分泌物是根际微生物重要的营养和能量来源；并且由于根系的穿插作用，使根际的水分状况和通气条件优于非根际，从而形成有利于根际微生物生长繁殖的微环境。微生物群落结构是指在生物和非生物因素的综合调控作用下，一定面积或体积的土壤中的真菌、细菌、放线菌和病毒等构成的生物群体，其区系组成、种群数量、生物活性等与土壤类型、植物类型和代谢、气候等密切相关。
[0005]
不幸的是，在三七种植过程中导致三七连作障碍的几点原因都将引起土壤中微生物比例失衡，细菌和真菌是三七根区土壤微生物中的优势群体，连作对土壤微生物区系有明显影响。随着三七种植年限增加，细菌，数量下降，微生物多样性降低，土壤的微生物类群由“细菌型”逐渐转变为“真菌型”。而“真菌型”的根际微生物群落结构不利于三七的生长。
[0006]
长期以来，植物病害的防治主要依赖抗病品种的选育和化学农药的使用，但长期大量地施用化学合成肥料和农药已导致农业生态环境破坏、肥效药效降低及食品安全等诸多问题。因此，寻求一种三七增产和保护的新技术、新方法成为世界范围内农业科技工作者的重要研究方向。
[0007]
云南省作为三七中药材的主要产区，主要是因为三七喜阴暖、潮湿的生长环境，人们在数百年种植三七的过程中不断摸索经验方法，构建适宜三七种植的栽培模式，如在三七农田上搭建遮阴网，在种植或移栽三七后的土壤表面覆盖一层松针，从而提高三七产量、预防三七病害。选择松针覆盖在三七土壤上而不是选择稻草或其他树叶作为三七田的覆盖物，除了上述物理优点外，还因为松针本身含有烯萜类、醇类和挥发性油类物质等大量活性物质。本发明在研究的基础上，发现了来源于松针的α
‑
蒎烯、2,3
‑
丁二醇和d
‑
松醇在改善三七根际土壤微生物群体结构和修复三七连作土壤方面具有十分突出的作用，进而提出了本发明。


技术实现要素：

[0008]
为了解决三七连作障碍的问题，改善三七种植、生长环境，提高三七品质，本发明提供了一种松针中烯醇类物质在调控三七根际微生物群落结构和/或修复三七连作载体和/或改善三七种植方面中的应用。本发明还提供了使用三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂来调控三七根际微生物群落结构和/或修复三七连作载体和/或改善三七种植的方法。本发明中，所述松针中烯醇类物质包括α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种。
[0009]
松针的化学成分包括大量烯萜类、醇类和挥发性油类物质，例如α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇等。其中：
[0010]
α
‑
蒎烯(α
‑
pinene)是一种天然存在的双环单萜类化合物，分子式为c
10
h
16
，可从松树等多种植物中获得，其结构如下：
[0011][0012]
α
‑
蒎烯本身为无色透明液体，微溶于水，不溶于丙二醇、甘油，溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸等多数有机溶剂。α
‑
蒎烯具有碳碳双键和碳环结构，丰富的化学结构使α
‑
蒎烯能发生异构化、氧化、氢化、加成、酯化、聚合等一系列化学反应；并且其还具有松木、针叶及树脂样的气息，在化工、大气化学等领域是合成樟脑、冰片、松油醇、香料、树脂等化工产品的重要原料之一。此外，α
‑
蒎烯还具有镇咳、祛痰、抗过敏及改善溃疡、抗真菌等作用。
[0013]
2,3
‑
丁二醇是一种多元醇，分子式为c4h
10
o2，其结构式为：
[0014]
[0015]
2,3
‑
丁二醇可用做化妆品保湿剂，农药稳定剂，医药、农药和其它精细化学品的生产原料。本技术人在松针中发现了2,3
‑
丁二醇的存在。
[0016]
d
‑
松醇(d
‑
pinitol)是d
‑
手性肌醇甲基化的一种衍生物，分子式为c7h
14
o6，其结构式为：
[0017][0018]
d
‑
松醇为白色颗粒状的结晶，易溶于水，无臭味，味微甜，难溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、乙醚、丙酮等有机溶剂。d
‑
松醇具有广泛的植物来源，最先在松科植物中被发现，松醇的名字也由此而来，之后在豆科类植物中也发现了d
‑
松醇的存在，且其含量相当丰富，这大大扩大了d
‑
松醇的植物来源。此外，d
‑
松醇还广泛存在于叶子花属植物、紫花苜蓿及许多植物的花和叶中，在一些植物的汁液中也发现了该成分。近年来d
‑
松醇成为人们研究的热点，其越来越多的功能活性也不断被发现并研究，目前报道较多的主要集中在d
‑
松醇的降血糖、抗肿瘤、免疫调节作用以及其他活性，同时也是一类植物源杀菌剂，能够对植物病害起到治疗作用。
[0019]
本发明的一个目的，在于提供α
‑
蒎烯、丁二醇和/或d
‑
松醇在调控三七根际微生物群落结构和/或修复三七连作土壤和/或改善三七种植方面中的应用。
[0020]
本发明中，所述丁二醇包括1,2
‑
丁二醇、1,3
‑
丁二醇、1,4
‑
丁二醇、2,3
‑
丁二醇中的一种或更多种。优选的，所述丁二醇为2,3
‑
丁二醇。
[0021]
本发明发现，α
‑
蒎烯、丁二醇和/或d
‑
松醇能够使三七根际土壤或三七连作土壤真菌丰度降低，细菌丰度增加，使土壤微生物结构由不适于三七生长的“真菌型”土壤转变为适于三七生长的“细菌型”土壤，从而解决了三七连作障碍的问题。
[0022]
因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述调控三七根际微生物群落结构和修复三七连作载体，包括使得其中的真菌丰度降低和/或细菌丰度增加，并使得真菌/细菌比值降低。
[0023]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂，其包含α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种。
[0024]
优选的，所述三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂由α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种组成。
[0025]
优选的，本发明所述三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂还包括辅料，以便于制剂。进一步地，α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇可与辅料制成水剂、水溶剂、滴剂、乳油、微乳剂、水乳剂、微囊剂、气雾剂、喷雾剂等剂型。优选的，在使用时可以将所述三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂用水配制成合适的浓度。
[0026]
因此，在一个优选的实施方案中，本发明所述应用包括使用三七根际微生物群落结构调控剂或三七连作土壤修复剂来调控三七根际微生物群落结构和/或修复三七连作土壤和/或改善三七种植。
[0027]
在一个优选的实施方案中，所述应用包括对三七植株或三七种植环境使用三七根
际微生物群落结构调控剂进行熏蒸。优选的，本发明所述应用包括在密闭空间中对三七植株或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进熏蒸。
[0028]
本发明还提供了一种调控三七根际微生物群落结构的方法，所述方法包括对三七植株或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进行熏蒸。优选的，所述方法包括在密闭空间中对三七植株或三七种植环境使用本发明所述的三七根际微生物群落结构调控剂进行熏蒸。
[0029]
优选的，所述三七根际微生物群落结构调控剂包含α
‑
蒎烯；更优选的，本发明所述应用和方法中，使用α
‑
蒎烯进行熏蒸。
[0030]
在一个优选的实施方案中，熏蒸时α
‑
蒎烯的用量为1～20μl/l(α
‑
蒎烯体积/密闭空间体积)。
[0031]
优选的，所述用量为1μl/l、2μl/l、3μl/l、4μl/l、5μl/l、6μl/l、7μl/l、8μl/l、9μl/l、10μl/l、11μl/l、12μl/l、13μl/l、14μl/l、15μl/l、16μl/l、17μl/l、18μl/l、19μl/l、20μl/l。所述用量优选为1～15μl/l，进一步优选5～10μl/l。
[0032]
在一个优选的实施方案中，熏蒸的总时间为1d～50d。优选的，熏蒸的总时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、15d、20d、25d、30d、35d、40d、45d或50d。优选的，熏蒸的总时间为1～20d，进一步优选1～10d，更进一步优选1～5d。
[0033]
在一个优选的实施方案中，优选每1～10d补充添加一次三七根际微生物群落结构调控剂/α
‑
蒎烯，每次补充添加时α
‑
蒎烯的用量为1～20μl/l(α
‑
蒎烯体积/密闭空间体积)。优选的，所述用量为1μl/l、2μl/l、3μl/l、4μl/l、5μl/l、6μl/l、7μl/l、8μl/l、9μl/l、10μl/l、11μl/l、12μl/l、13μl/l、14μl/l、15μl/l、16μl/l、17μl/l、18μl/l、19μl/l、20μl/l。所述用量优选为1～15μl/l，进一步优选5～10μl/l。
[0034]
优选的，每次补充添加α
‑
蒎烯的用量可以与初始添加相同，也可以与初始添加的不同。
[0035]
在本发明中，优选每1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d或10d补充添加一次三七根际微生物群落结构调控剂/α
‑
蒎烯。
[0036]
在一个优选的实施方案中，所述应用包括对三七植株或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进行处理。优选的，所述应用包括对三七植株特别是三七叶片或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进行喷施。优选的，本发明所述应用包括将三七根际微生物群落结构调控剂喷施于三七植株特别是三七叶片上或三七种植环境中。
[0037]
本发明还提供了一种调控三七根际微生物群落结构的方法，所述方法包括对三七植株或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进行处理。优选的，所述方法包括对三七植株或三七种植环境使用三七根际微生物群落结构调控剂进行喷施。优选的，所述方法包括将三七根际微生物群落结构调控剂喷施于三七植株特别是三七叶片上或三七种植环境中。
[0038]
优选的，所述三七根际微生物群落结构调控剂包含α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种；更优选的，所述三七根际微生物群落结构调控剂包含丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种。
[0039]
在一个优选的实施方案中，在使用时可以将所述三七根际微生物群落结构调控剂
用水配制成α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇的浓度为0.1～50mg/l。
[0040]
优选的，所述浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l。所述浓度优选为0.5～30mg/l，进一步优选1～20mg/l。
[0041]
在一个优选的实施方案中，所述应用包括使用三七连作土壤修复剂处理三七连作载体。
[0042]
本发明还提供了一种修复三七连作载体的方法，所述方法包括使用三七连作土壤修复剂处理三七连作载体。
[0043]
优选的，所述三七连作土壤修复剂包含α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种；更优选的，所述三七连作土壤修复剂包含丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种；最优选的，所述三七连作土壤修复剂包含丁二醇。
[0044]
优选的，所述处理包括使用三七连作土壤修复剂浇灌三七连作载体；优选的，所述处理包括使用三七连作土壤修复剂浇灌三七连作载体并放置一段时间。优选地，所述处理在密封空间中进行。
[0045]
在一个优选的实施方案中，在使用时可以将所述三七连作土壤修复剂用水配制成α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇的浓度为至少0.1mg/l。
[0046]
优选的，所述浓度为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l、30mg/l、35mg/l、40mg/l、45mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、1000mg/l。所述浓度的下限优选为0.1mg/l、0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l、6mg/l、7mg/l、8mg/l、9mg/l、10mg/l；所述浓度的上限优选为50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、1000mg/l。所述浓度优选为0.5～100mg/l，进一步优选10～50mg/l。
[0047]
当所述三七连作土壤修复剂包含α
‑
蒎烯、丁二醇的一种或更多种时，也可将所述三七连作土壤修复剂用水配制成α
‑
蒎烯、丁二醇的浓度为至少0.1ml/l。
[0048]
优选的，所述浓度为0.1ml/l、0.5ml/l、1ml/l、2ml/l、3ml/l、4ml/l、5ml/l、6ml/l、7ml/l、8ml/l、9ml/l、10ml/l、15ml/l、20ml/l、25ml/l、30ml/l、35ml/l、40ml/l、45ml/l、50ml/l、100ml/l、200ml/l、300ml/l、400ml/l、500ml/l、1000ml/l。所述浓度的下限优选为0.1ml/l、0.5ml/l、1ml/l、2ml/l、3ml/l、4ml/l、5ml/l、6ml/l、7ml/l、8ml/l、9ml/l、10ml/l；所述浓度的上限优选为50ml/l、100ml/l、200ml/l、300ml/l、400ml/l、500ml/l、1000ml/l。所述浓度优选为0.5～100ml/l，进一步优选10～50ml/l。
[0049]
在一个优选的实施方案中，所述三七连作土壤修复剂或者稀释后的三七连作土壤修复剂的用量为每kg三七连作载体使用10～1000ml的三七连作土壤修复剂或者稀释后的三七连作土壤修复剂。优选的，每kg三七种植载体使用10ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml、1000ml的三七连作土壤修复剂或者稀释后的三七连作土壤修复剂。优选的，每kg三七种植载体使用10～500ml，更优选50～200ml的三七连作土壤修复剂或者稀释后的三七连作土壤修复剂。
[0050]
因此，在本发明的一个实施方案中，所述α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇的用量为每kg三七连作载体使用0.05～500mg，优选0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、300mg、350mg、400mg、
450mg、500mg的α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇。优选的，所述α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇的用量为每kg三七种植载体使用0.1～20mg，优选0.5～15mg，进一步优选1～10mg的α
‑
蒎烯、丁二醇或d
‑
松醇。
[0051]
当所述三七连作土壤修复剂包含α
‑
蒎烯、丁二醇的一种或更多种时，所述α
‑
蒎烯、丁二醇的用量也可表示为每kg三七连作载体使用0.05～500μl，优选0.05μl、0.1μl、0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、150μl、200μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl的α
‑
蒎烯或丁二醇。优选的，所述α
‑
蒎烯或丁二醇的用量为每kg三七种植载体使用0.1～20μl，优选0.5～15μl，进一步优选1～10μl的α
‑
蒎烯或丁二醇。
[0052]
优选的，本发明中所述处理的时间可以为1～100d，优选5～60d，更优选10～40d，进一步优选20～30d。
[0053]
本发明的三七根际微生物群落结构调控剂及三七连作土壤修复剂可应用于农田特别是三七连作农田以调控三七根际微生物群落结构和/或修复三七连作土壤和/或改善三七种植。优选的，可以以α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇的用量为5～300g/ha(克/公顷)，优选20～100g/ha、更优选40～70g/ha来施用三七根际微生物群落结构调控剂及三七连作土壤修复剂。
[0054]
在本发明中，所述三七连作载体包括三七连作土壤，尤其是三七根际微生物群落结构劣化的三七连作土壤，或者真菌/细菌比值较常规土壤升高的“真菌”型土壤。
[0055]
在本发明中，所述“α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种”包括α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种、两种或三种，优选的，“α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇中的一种或更多种”包括α
‑
蒎烯、丁二醇、d
‑
松醇、α
‑
蒎烯/丁二醇、α
‑
蒎烯/d
‑
松醇、丁二醇/d
‑
松醇、α
‑
蒎烯/丁二醇/d
‑
松醇中的任意一种。
[0056]
在本发明中，在没有特别说明的情况下，所述三七植株一般指种植期间的三七植株。
[0057]
有益效果：
[0058]
本发明通过使用松针中富含的物质成分α
‑
蒎烯、2,3
‑
丁二醇和d
‑
松醇以熏蒸、喷施或浇灌的方式处理盆栽三七和土壤，从土壤微生物角度剖析了松针在三七大田种植过程中发挥的功能。本发明发现，以α
‑
蒎烯熏蒸盆栽三七后，三七根际土壤微生物中真菌数量略微降低，细菌数量显著增加；以丁二醇和d
‑
松醇喷施三七叶片后，三七根际土壤中真菌数量有所降低，细菌数量显著增加，导致土壤中真菌/细菌比值显著降低；通过配制一定浓度的丁二醇浇灌三七连作土壤，可显著调控三七连作土壤的微生物群体结构，使连作土壤中真菌数量降低，细菌数量增加，且随着丁二醇处理浓度的增加，微生物变化趋势越明显。α
‑
蒎烯、丁二醇和d
‑
松醇均为来源于松针的天然植物来源调理剂，能够被自然界所降解，不会造成环境污染等问题，因此可广泛应用于三七的绿色种植中。
附图说明
[0059]
图1：α
‑
蒎烯对三七根际微生物的影响；
[0060]
图2：d
‑
松醇、2,3
‑
丁二醇对三七根际微生物的影响；
[0061]
图3：三七连作土壤浇灌2,3
‑
丁二醇试验。
具体实施方式
[0062]
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
[0063]
应当理解的是，在说明书和权利要求书中使用的术语或词语不应当理解为具有在字典中限定的含义，而应理解为在以下原则的基础上具有与其在本发明上下文中的含义一致的含义：术语的概念可以适当地由发明人为了对本发明的最佳说明而限定。
[0064]
实施例1：α
‑
蒎烯调控三七根际微生物群落结构试验
[0065]
本试验采用密闭空间熏蒸法：将移栽存活后的三七盆栽放置于透明塑料密封培养箱，每箱添加0和5μl/l的α
‑
蒎烯(α
‑
蒎烯体积/培养箱体积)，熏蒸时间为3d，之后收集盆栽三七的根际土壤，过60目筛后用涂平板法测定土壤微生物的变化情况，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养采用孟加拉红培养基。用电子天平准确称取过筛混匀后的土壤样品5g倒入装有45ml无菌水的50ml离心管中,置于摇床上(120r/min，常温)，振荡20min，使土壤充分分散成为土壤悬液，稀释度为10
‑1。用移液枪从10
‑1稀释度溶液中吸取1ml到装有9ml无菌水的试管中，稀释度为10
‑2，按此方法制成稀释度10
‑3、10
‑4、10
‑5和10
‑6。用移液枪吸取0.1ml各稀释度的土壤悬液，加到培养皿中，然后立即用玻璃刮刀涂皿，将悬液均匀的涂抹于琼脂表面。真菌涂10
‑1～10
‑3浓度的土悬液28℃放置5d，细菌涂10
‑4～10
‑6放置2d，选取菌落数在100～200之间的土悬液浓度进行计数。每克干土中菌数(
×
103cfu/g)＝(菌落平均数
×
稀释倍数
×
20)
÷
干土％。结果示于图1中，a表示α
‑
蒎烯熏蒸后三七根际土壤中真菌菌落数目；b表示α
‑
蒎烯熏蒸后三七根际土壤中细菌菌落数目；c表示α
‑
蒎烯熏蒸后三七根际土壤中真菌菌落数目与细菌菌落数目的比值；ck表示对照处理，即使用0μl/l的α
‑
蒎烯进行熏蒸。
[0066]
根据图1可以看出，使用浓度为5μl/l的α
‑
蒎烯熏蒸三七后，根际土壤中每克干土中真菌数由70437降低至66625，真菌丰度略有降低；但根际土壤中每克干土中细菌数由1.3
×
107增加至2.6
×
107，细菌丰度显著增加；最终根际土壤中真菌/细菌比也从0.0060降低至0.0027；说明经过α
‑
蒎烯处理后，能够显著改变三七根际微生物群落结构，使土壤中微生物丰度增加，由“真菌型”土壤转变为“细菌型”土壤。
[0067]
实施例2：d
‑
松醇和2,3
‑
丁二醇调控三七根际微生物群落结构试验
[0068]
本试验采用密闭空间喷施法：将移栽存活后的三七盆栽放置于透明塑料密封培养箱，每盆10株三七，每个培养箱装入6盆，设置三七叶部喷施100ml的无菌水、1mg/l的d
‑
松醇和1mg/l的2,3
‑
丁二醇三种不同处理，喷施无菌水作为对照处理，每天喷施一次，持续5d，之后收集盆栽三七的根际土壤，过60目筛后用涂平板法测定土壤微生物的变化情况，细菌培养采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养采用孟加拉红培养基。用电子天平准确称取过筛混匀后的土壤样品5g倒入装有45ml无菌水的50ml离心管中,置于摇床上(120r/min，常温)，振荡20min，使土壤充分分散成为土壤悬液，稀释度为10
‑1。用移液枪从10
‑1稀释度溶液中吸取1ml到装有9ml无菌水的试管中，稀释度为10
‑2，按此方法制成稀释度10
‑3、10
‑4、10
‑5和10
‑6。用移液枪吸取0.1ml各稀释度的土壤悬液，加到培养皿中，然后立即用玻璃刮刀涂皿，将悬液均匀的涂抹于琼脂表面。真菌涂10
‑1～10
‑3浓度的土悬液28℃放置5d，细菌涂10
‑4～10
‑6放置2d，选取菌落数在100～200之间的土悬液浓度进行计数。结果示于图2中，a表示d
‑
松醇/2,3
‑
丁二醇喷施后三七根际土壤中真菌、细菌菌落数目；b表示d
‑
松醇/2,3
‑
丁二醇喷施后三七根际土壤中真菌菌落数目与细菌菌落数目的比值。数据以均值
±
标准误的形式表示，
不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one
‑
way anova，duncan’s multiple range test，p<0.05)。
[0069]
根据图2可以看出，在喷施d
‑
松醇和2,3
‑
丁二醇5天后，三七根际土壤真菌数量略微降低，但细菌数量由对照处理的3.1
×
104显著增长到d
‑
松醇处理的6.1
×
104和2,3
‑
丁二醇处理的5.7
×
104；根际土壤真菌/细菌比在经过2,3
‑
丁二醇处理后显著降低至0.0044，在经过d
‑
松醇处理后显著降低至0.0053，说明盆栽三七根际微生物经过d
‑
松醇或2,3
‑
丁二醇喷施处理也会改变群落结构，土壤中细菌丰度显著增加，导致土壤中真菌/细菌比值降低。
[0070]
实施例3：2,3
‑
丁二醇调控连作土土壤微生物群落结构试验
[0071]
本试验采用盆装连作土长期浇灌的方法：三七连作土取自文山三七农田，将取回来的连作土进行阴干处理，然后过40目网筛，去除土壤中植物残体，称取4千克的连作土加入到整理箱(28
×
20
×
17cm)内备用；取1ml分析纯2,3
‑
丁二醇加入到1l无菌水中，配制成1000ppm母液，然后逐步稀释为1、10、50、100ppm的溶液，以无菌水作为对照处理；取上述溶液500ml加入到不同整理箱内，然后盖上整理箱盖子，并用封口膜进行密封，将整理箱放置在避光阴凉处，每个处理设置3个重复。处理1个月后，采用稀释涂布平板法对连作土壤微生物数量进行统计分析，取5g土样倒入装有45ml无菌水的50ml离心管中置于摇床上(120r/min，常温)，振荡20min，将土壤悬浊液用无菌水稀释到10
‑2、10
‑3、10
‑4浓度用移液枪取100μl分别加入到lb、na、pda和孟加拉红培养基中，然后用涂布器涂抹均匀至干燥，置于28℃恒温培养箱中培养，待菌落形成后对培养基中菌落数量进行统计。结果示于图3中；a表示2,3
‑
丁二醇处理后连作土中真菌菌落数目与细菌菌落数目的比值；b表示2,3
‑
丁二醇处理后连作土中细菌菌落数目；c表示2,3
‑
丁二醇处理后连作土中真菌菌落数目。数据以均值
±
标准误的形式表示，不同的小写字母代表处理间的差异显著性(one
‑
way anova，duncan’s multiple range test，p<0.05)。
[0072]
根据图3可以看出，不同浓度的2,3
‑
丁二醇在处理三七连作土1个月后，土壤中细菌数量呈增加趋势，真菌数量呈减少趋势；在1ppm浓度处理时，变化趋势不太明显，高于10ppm浓度时，可观察到明显的变化，同时真菌/细菌比也在10ppm浓度之后显著下调，而且随着浓度增加，变化趋势更明显。说明在较低浓度的2,3
‑
丁二醇处理三七连作土能够有效改善土壤中微生物群落结构，使不利于三七生长的“真菌型”土壤转变为有利于三七生长的“细菌型”土壤。
[0073]
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。