一种金/铜双金属纳米团簇荧光探针及其制备方法和组氨酸检测应用与流程

本发明属于纳米材料及生物分析技术领域，具体涉及一种金/铜双金属纳米团簇荧光探针及其制备方法和组氨酸检测应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

金属纳米簇是由几个到数百个贵金属原子构成，具有超小尺寸、低毒性、良好光电性能、优异的生物相容性等特性，被广泛应用于催化、光学成像、化学与生物传感等领域。近几年来，金属纳米材料，尤其小尺寸的金属纳米簇，因其具有以上特性与功能，一直备受广大科研工作者的青睐。

组氨酸在生物系统中起着至关重要的作用。例如，控制金属运输，由于组氨酸可以与一些金属离子如cu² 离子强烈结合。此外，它还可以作为哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质或神经调节剂。高水平的组氨酸可能会导致压力和心理障碍，如焦虑、精神分裂症和血栓性疾病，而组氨酸水平过低可能会引发一些疾病，如神经性耳聋、肝硬化和肺部疾病。特别是尿液中的组氨酸指标对监测人体健康，尤其是对代谢紊乱、“组氨酸血症”等严重疾病具有临床意义。

在过去的几十年中，各种分析技术被用于检测人体体液和尿液等代谢物中的组氨酸，通常采用高效液相色谱、比色法和电化学等方法。然而，发明人发现，目前这些方法存在灵敏度低和操作复杂等局限性。荧光检测由于其灵敏度高、稳定性好、操作简单而广受推崇，但是荧光检测一般是在溶液相中进行，因此猝灭型、比率型荧光检测方法背景干扰较大。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种金/铜双金属纳米团簇荧光探针及其制备方法和组氨酸检测应用，通过研究发现，本发明制得的金/铜双金属纳米团簇探针具有组氨酸诱导的“turn-on”型荧光功能，能够特异性识别与响应组氨酸，实现对体液(血清)和代谢物(尿液)中组氨酸的速测检测。本发明基于金/铜双金属纳米团簇探针对血清、尿液中的组氨酸进行检测具有快速、灵敏度高、背景干扰小等优点，因此具有良好的实用性。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种金/铜双金属纳米团簇探针的制备方法，所述制备方法包括：

将氯金酸溶液加入到牛血清白蛋白(bsa)水溶液中搅拌处理得混合溶液i；

将硫酸铜加入上述混合溶液i中搅拌得混合溶液ii；

将碱液加入混合溶液ii中搅拌即得。

优选的，将碱液加入混合溶液ii中搅拌后所得材料在黑暗条件下透析即得本发明的金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的第二个方面，提供上述制备方法得到的金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的第三个方面，提供一种荧光传感器，所述荧光传感器至少包括上述金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的第四个方面，提供上述金/铜双金属纳米团簇探针和/或荧光传感器在组氨酸检测中的应用。

所述应用包括对组氨酸的定性和定量分析，具体的，通过出现特征的荧光峰来实现对组氨酸的定性检测；通过检测双金属纳米团簇材料的在620nm峰处的荧光强度，通过待测溶液和空白的荧光强度的差值与组氨酸的定量关系，荧光强度越高说明组氨酸的含量越高，实现组氨酸的定量检测。

其中，组氨酸检测环境可以为外界自然环境、体液(如血清)或代谢物(如尿液)环境中。

本发明的第五个方面，提供一种检测体液和/或代谢物中组氨酸的方法，所述方法包括：将上述金/铜双金属纳米团簇探针和/或荧光传感器置于体液和/或代谢物中进行检测，所述检测方法采用荧光法。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

(1)采用上述技术方案的方法制备的无荧光双金属纳米团簇探针，可对待测物“turn-on”检测，降低了背景干扰，实现对待测物的精准检测；

(2)上述技术方案提供的检测方法，检测灵敏度较高，获得的检测结果与经典精密仪器法(离子色谱法)的定量结果基本一致，具有操作简便、特异、响应快、灵敏度高、可视化等优点，适于尿液样品中组氨酸含量的快速、特异、高灵敏、可视化速测，具有广泛的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1制备的金/铜纳米团簇材料形貌的透射电镜表征图；

图2为实施例2中的双金属纳米团簇材料与组氨酸的响应性能图；其中，a表明组氨酸a以及双金属纳米团簇材料b无明显的荧光发射峰，双金属纳米团簇材料与组氨酸的混合液c呈现明显的荧光发射峰；b表明a的吸收峰与c的吸收峰有显著的差距；

图3为实施例3中的双金属纳米团簇材料对组氨酸的特异性响应图；其中，a表明所有氨基酸中只有组氨酸能够诱发双金属纳米团簇材料的红色荧光开启；b表明其它氨基酸的存在对组氨酸的检测并没有影响；

图4为实施例4中的组氨酸检测条件的优化图；其中，a为双金属纳米团簇材料浓度的优化，b为ph的优化，c为温度的优化，d为离子强度的优化；

图5为实施例5中的双金属纳米团簇材料对组氨酸检测的定量检测标准工作曲线图；其中，a为不同浓度组氨酸条件下荧光强度曲线；b为制作的组氨酸的标准工作曲线。

图6为实施例6中金/铜纳米团簇材料稳定性图；其中，a中暴露时间为0-6小时，b中暴露时间为0-6月。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

如前所述，在过去的几十年中，各种分析技术被用于检测人体体液和代谢物中的组氨酸，通常采用高效液相色谱、比色法和电化学等方法。然而，目前这些方法存在灵敏度低和操作复杂等局限性。荧光检测由于其灵敏度高、稳定性好、操作简单而广受大家推崇，但是猝灭型、比率型荧光检测方法背景干扰大。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种金/铜双金属纳米团簇的制备方法，所述制备方法包括：

(1)将氯金酸溶液加入到牛血清白蛋白(bsa)水溶液中搅拌处理得混合溶液i；

(2)将硫酸铜加入上述混合溶液i中搅拌得混合溶液ii；

(3)将碱液加入混合溶液ii中搅拌即得。

进一步的，将步骤(3)所得材料在黑暗条件下透析即得本发明的金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中，

氯金酸溶液摩尔浓度为8.0-12.0mm(优选10.0mm)，bsa水溶液质量浓度为5.0-35mg/ml(优选为20mg/ml)；搅拌时间为3-10分钟(优选为5分钟)。

本发明的又一具体实施方式中，所述硫酸铜为五水硫酸铜，五水硫酸铜的摩尔浓度为0.5-12mm(优选浓度为9.0mm)；搅拌时间为3-10分钟(优选为5分钟)。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(3)中，所述碱液为氢氧化钠，所述氢氧化钠的摩尔浓度为0.5-1.5mm(优选浓度为1.0mm)，搅拌具体条件为：在30-40℃(优选为37℃)搅拌5-10小时(优选为8小时)。

本发明的又一具体实施方式中，透析时间控制为12-36小时，优选为24小时。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方得到的金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种荧光传感器，所述荧光传感器至少包括上述金/铜双金属纳米团簇探针。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述金/铜双金属纳米团簇探针和/或荧光传感器在组氨酸检测中的应用。

其中，组氨酸检测环境可以为外界自然环境、体液(如血清)或代谢物(如尿液)样品。

需要说明的是，所述应用包括对组氨酸的定性和定量分析，具体的，通过出现特征的荧光峰强度的变化来实现对组氨酸的定性检测；通过检测双金属纳米团簇材料的荧光强度，通过空白值与待测溶液的荧光强度的差值与组氨酸的定量关系，荧光强度越高说明组氨酸的含量越高，实现组氨酸的定量检测。

本发明的又一具体实施方式中，所述应用具体方法为：将待测组氨酸(优选为0.5μm)和双金属纳米团簇材料(优选为2.0mm)通过荧光法对组氨酸进行分析。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测血清或尿液中组氨酸的方法，所述方法包括：将上述金/铜双金属纳米团簇探针和/或荧光传感器置于血清或尿液中进行检测，所述检测方法采用荧光法。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

双金属纳米团簇材料的制备：

(1)将2.0ml浓度为10.0mm的氯金酸溶液加入到2.0ml浓度为20mg/mlbsa水溶液中，搅拌5.0分钟；

(2)将0.8ml浓度为9.0mm的五水硫酸铜加入到步骤(1)所获得的的混合溶液中，搅拌5.0分钟；

(3)将0.2ml浓度为1.0m的氢氧化钠水溶液加入到步骤(2)所获得的混合溶液中，在37℃条件下搅拌8.0小时。

(4)为进一步纯化步骤(3)所获得材料，在黑暗条件透析24小时，获得最终所需材料，形貌如图1所示。

实施例2

双金属纳米团簇材料对组氨酸响应性能的研究：

将200μl浓度为2.0mm双金属纳米团簇材料与100μl浓度为2.0mm双金属纳米团簇材料和100μl浓度为0.5μm的组氨酸的混合液，分别测定其荧光光谱和紫外吸收光谱。

如图2a所示，组氨酸a以及双金属纳米团簇材料b无明显的荧光发射峰，双金属纳米团簇材料与组氨酸混合溶液c则在620nm出现明显的荧光发射峰，说明组氨酸触发了双金属纳米团簇材料的荧光开启。图2b所示，a的紫外吸收峰与c的紫外吸收峰有较大的差距，说明双金属纳米团簇材料与组氨酸有较强的相互作用。

实施例3

双金属纳米团簇材料对组氨酸响应特异性研究：

将100μl浓度为2.0mm双金属纳米团簇材料与100μl浓度为0.5μm的组氨酸的混合溶液以及双金属纳米团簇材料分别与100μl浓度为0.5mm的其他氨基酸的混合溶液测定620nm峰处荧光强度。然后，50μl浓度为0.5μm的组氨酸与50μl浓度为0.5mm的其他氨基酸的进行混合，将100μl浓度为2.0mm双金属纳米团簇材料分别与上述混合溶液混合，检测其在620nm峰处荧光强度。

如图3a所示，在所有氨基酸中只有组氨酸能够诱发双金属纳米团簇材料的红色荧光开启。由图3b可知，其它氨基酸的存在对组氨酸的检测并没有影响。

实施例4

组氨酸检测条件的优化：

首先对双金属纳米团簇材料的浓度进行了优化，选取不同浓度的双金属纳米团簇材料与0.5μm的组氨酸混合，测其在620nm峰处荧光强度；然后对待测体系的ph进行了优化，配置不同浓度的缓冲溶液，将组氨酸置于缓冲溶液中孵育，双金属纳米团簇材料与其混合，测定其在620nm峰处荧光强度；紧接着对待测体系的离子强度进行优化，将不同浓度的氯化钠置于待测体系，与组氨酸混合，加入双金属纳米团簇材料后，检测其在620nm峰处荧光强度；最后对检测温度进行优化，将待测体系放置在不同的温度条件下，与双金属纳米团簇材料混合，测定其荧光强度。

如图4a、b、c，双金属纳米团簇材料的浓度在2.0mm、ph在7、检测温度为37℃时，荧光增强效率最大；图4d表明，离子强度对检测体系没有影响。

实施例5

组氨酸的定量检测：

反应体系包含不同浓度的组氨酸、双金属纳米团簇材料(2.0mm)和缓冲溶液。在37℃的水浴锅中反应，利用荧光光度计检测其荧光强度，并绘制出组氨酸的标准工作曲线。如图5所示，线性范围为，y＝15.214x 43.672(r²＝0.9962)。

实施例6

双金属纳米团簇材料稳定性考察：

将双金属纳米团簇材料置于氙灯下照射，每隔一小时取材料与0.5μm组氨酸作用，检测其荧光强度；将双金属纳米团簇材料置于4℃冰箱中储存，每隔一个月取材料与组氨酸作用，检测其荧光强度。其结果如图6所示，金属纳米团簇材料稳定性较好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。