本发明属于化学及材料技术领域，更具体地，涉及一种高灵敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒及制备与应用，尤其涉及一种tta/phen增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒及制备方法与应用。
背景技术：
时间分辨荧光免疫分析技术(trfia)依赖于稀土元素荧光寿命长、stokes位移大、发射光谱信号峰尖锐等独特的荧光性质，通过结合免疫分析方法，广泛应用于免疫诊断、食品检测、环境监测等各领域。然而传统的以稀土螯合物作为trfia的荧光探针，存在光稳定性弱、荧光量子产率低等不足，并由此导致了检测结果的低灵敏度。近些年发展起来的稀土掺杂纳米晶体虽然荧光性能优越、荧光寿命长，但其在紫外区域没有允许的吸收，在实际应用方面受到一定的限制。因此，探索和开发一种高灵敏、可吸收紫外光的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒显得尤为重要。
公开号为cn108134101a的发明专利中，以lacl3·7h2o、eucl3·6h2o和nh4f为原料，通过简单的反应制备得到eu3 掺杂的laf3荧光纳米粒；以2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)和1,10-邻菲啰啉(phen)为增敏剂，实现稀土掺杂荧光纳米粒的敏化发光。但是该种方法制备得到的稀土离子掺杂的氟化物本身存在一定的局限性，其荧光量子产率较低并且在紫外区域没有允许的吸收，因而在实际应用方面有所限制。
技术实现要素：
针对现有技术中的时间分辨荧光探针光稳定性弱、荧光量子产率低等不足，检测结果灵敏度低的技术问题，本发明提供了一种高灵敏、可吸收紫外光的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒及制备方法与应用。该荧光纳米粒以laf3作为六方相的基质材料，eu3 作为发光中心掺杂到六方相的laf3基质中，增敏剂2-噻吩甲酰三氟丙酮和1,10-邻菲啰啉与eu3 发生配位作用，用于敏化eu3 发光。
根据本发明的第一方面，提供了一种增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒，该荧光纳米粒以laf3作为六方相基质材料，eu3 作为发光中心掺杂到六方相laf3基质中，增敏剂2-噻吩甲酰三氟丙酮和1,10-邻菲啰啉与eu3 发生配位作用，用于敏化eu3 发光。
优选地，所述eu3 的物质的量占稀土元素物质的量之和为40％-60％。
优选地，所述荧光纳米粒的粒径为30nm-50nm。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将nh4f水溶液滴加到lacl3和eucl3的混合水溶液中，得到eu3 掺杂的laf3荧光纳米粒子；
(2)将2-噻吩甲酰三氟丙酮的醇溶液和1,10-邻菲啰啉的醇溶液分别加入到步骤(1)得到的eu3 掺杂的laf3荧光纳米粒子中，使2-噻吩甲酰三氟丙酮和1,10-邻菲啰啉与eu3 发生配位作用，从而敏化eu3 发光，离心洗涤后得到增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒。
优选地，所述lacl3和eucl3物质的量之比为6：(4-9)。
优选地，所述2-噻吩甲酰三氟丙酮物质的量比上lacl3与eucl3物质的量之和为(0.1-0.3)：1；所述1,10-邻菲啰啉物质的量比上lacl3与eucl3物质的量之和为(0.1-0.3)：1。
优选地，所述nh4f物质的量至少为lacl3与eucl3物质的量之和的30％。
优选地，所述离心转速至少为12000rpm，离心时间至少10min。
优选地，步骤(1)中nh4f水溶液滴加的速率小于等于1ml/min。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒用于制备测定新冠中和抗体免疫试纸的应用，所述增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒作为标记物用于时间分辨荧光免疫分析，从而检测新冠中和抗体。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明采用tta作为敏化剂，phen作为非水辅助配体，两种配体与eu3 离子发生强配位作用，使纳米粒的荧光得到有效增强。其中，tta是一种具有β-二酮官能团的敏化剂，其吸收紫外光后，电子以π-π’跃迁的方式从基态s0跃迁至激发态s1或s2，然后又以非辐射跃迁的方式窜越至三线态t1，最后通过键的振动耦合向eu3 的振动态能级进行能量转移，实现eu3 的敏化发光；phen则主要是作为非水辅助配体来取代-oh的位置，水或者其它含有高频振动能量分子易与仅含β-二酮配合物的中心离子配位而发生淬灭，通过引入phen配体，填充剩余的配位点可以消除这一光淬灭的因素，从而提升敏化效果。制备得到的tta/phen增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒在液相体系中表现出优良的光物理性质，适合用于分析检测、生物医学和材料科学等领域。
(2)本发明方法通过调节la3 和eu3 的比例，得到荧光寿命在0.63-4.14ms之间的稀土掺杂荧光纳米粒，利用其长荧光寿命，通过时间分辨检测技术，极大地降低了背景荧光的干扰，实现对新冠中和抗体的高灵敏检测。
(3)本发明方法通过调节tta、phen和稀土元素的比例，使得稀土掺杂荧光纳米粒的荧光强度提高了1-5倍，平均粒径为30nm-50nm，粒径分布均一，荧光性能优越。
(4)现有技术中直接在稀土发光中心离子表面螯合敏化剂，合成稀土螯合物材料，该材料光稳定性弱，荧光性能低。而本发明首次基于稀土掺杂荧光纳米粒材料，在其表面连接配体tta和phen，作为敏化剂，敏化发光中心eu3 发光，该种材料荧光性能优越且稳定性较好，适合用于时间分辨荧光免疫分析领域。
(5)本发明方法直接在水溶液中制备得到tta/phen增敏的稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒，制备过程简单、原料易得、所用试剂环境友好、反应条件温和、可控性强。
附图说明
图1为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒透射电子显微镜照片。
图2为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒x-射线衍射图谱。
图3为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒红外图谱。
图4为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒荧光激发图谱。
图5为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒荧光发射图谱。
图6为本发明所制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒荧光寿命图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了实现稀土掺杂时间分辨荧光纳米粒的敏化，本发明采用稀土铕离子(eu3 )作为发光中心，2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)作为敏化剂，1,10-邻菲啰啉(phen)作为非水辅助配体。tta具有较高的紫外吸收系数，与稀土离子的配位能力很强，且与发光中心eu3 离子之间能进行有效的能量传递；phen可以取代荧光淬灭基团-oh，提升敏化效果。制备得到的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒荧光性质稳定、荧光强度高、荧光寿命长。具体包括如下步骤：
(1)配制lacl3·7h2o和eucl3·6h2o的混合水溶液；
(2)配制nh4f水溶液，搅拌下滴加到稀土盐酸盐溶液中；
(3)配制2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)的乙醇溶液和1,10-邻菲啰啉(phen)的乙醇溶液，搅拌下滴加到nh4f与稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温搅拌过夜，反应体系呈乳白色悬浊液，离心洗涤得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒。
本发明中lacl3·7h2o和eucl3·6h2o摩尔比可任意调节，摩尔比不同时产物的荧光量子产率不同，当eu3 离子的掺杂度在40％时，制备得到的荧光纳米粒荧光量子产率最高。
其中，步骤(2)中nh4f水溶液应匀速缓慢地滴加，可使用蠕动泵将nh4f溶液以1ml/min的速率匀速泵入稀土盐酸盐溶液中。
其中，步骤(4)中离心转速12000rpm，离心时间10min，重复洗涤4次，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒。
实施例1tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取29.71mg(0.8mmol)lacl3·7h2o和7.33mg(0.2mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取22.22mg(0.1mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、19.82mg(0.1mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
图1为实施例1所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的透射电子显微镜图，纳米粒为六边形结构，平均粒径为30nm-50nm，分散性较好。图2为实施例1所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的x-射线衍射图谱，样品的衍射峰位置和相对强度均与laf3标准卡片pdf#32-0483很好地匹配，无杂质峰出现，结晶度较好，为六方晶相。
实施例2tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取22.28mg(0.6mmol)lacl3·7h2o和14.66mg(0.4mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取22.22mg(0.1mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、19.82mg(0.1mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
图3为实施例2所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的红外吸收图谱，图中出现的几个特征峰表明tta、phen成功吸附到纳米表面。图4为实施例2所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的激发光谱，其在紫外区有较宽的激发峰，最佳激发波长为370nm。图5为实施例2所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的发射光谱，tta、phen吸收紫外光，将能量传递给发光中心eu3 ，有效增强了稀土掺杂荧光纳米粒的荧光强度。
实施例3tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取14.85mg(0.4mmol)lacl3·7h2o和21.98mg(0.6mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取22.22mg(0.1mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、19.82mg(0.1mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
图6为实施例3所制备的稀土掺杂荧光纳米粒的荧光寿命图谱，其荧光寿命能够达到毫秒级别，显著优于其它常用的生物荧光材料，适合用于时间分辨荧光免疫分析技术。
实施例4tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取7.43mg(0.2mmol)lacl3·7h2o和29.31mg(0.8mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取22.22mg(0.1mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、19.82mg(0.1mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
发光中心eu3 的过量掺杂，在一定程度上引起内部浓度淬灭效应，降低发光强度，但另一方面过量的eu3 ，能够吸附更多的tta、phen，从而提高能量转移效率。
实施例5tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取22.28mg(0.6mmol)lacl3·7h2o和14.66mg(0.4mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取44.44mg(0.2mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、39.64mg(0.2mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
适量增加tta、phen的用量，使得稀土掺杂荧光纳米粒的荧光强度提高了3倍左右。
实施例6tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒
(1)称取22.28mg(0.6mmol)lacl3·7h2o和14.66mg(0.4mmol)eucl3·6h2o，溶于25ml超纯水中，搅拌混匀；
(2)称取11.11mg(3mmol)nh4f，溶于6ml超纯水中，搅拌下逐滴加入到稀土盐酸盐溶液中，控制蠕动泵的转速，调节滴加速度为1ml/min，滴加过程中反应溶液的颜色由原始的无色透明逐渐变成略带轻微淡蓝色的乳光；
(3)称取66.66mg(0.3mmol)2-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、59.46mg(0.3mmol)1,10-邻菲啰啉(phen)，溶于1ml乙醇溶液中，依次缓慢滴加到nh4f、稀土盐酸盐混合溶液中；
(4)室温条件下搅拌反应过夜，将反应液取出，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
过量加入tta、phen，使得稀土掺杂荧光纳米粒的荧光强度提高了1倍左右。
实施例7稀土掺杂荧光纳米粒的免疫应用
(1)分别将实施例1～6制备的tta/phen增敏的稀土掺杂荧光纳米粒分散于一定体积的超纯水中，加入5ml聚丙烯酸(paa)的水溶液，室温反应5h后，取出反应液，12000rpm离心10min，重复洗涤4次，沉淀用5ml超纯水超声分散，得到paa修饰的稀土掺杂荧光纳米粒，4℃冰箱保存备用。
(2)取适量步骤(1)制备的paa修饰的稀土掺杂荧光纳米粒，采用浓度为10mg/ml的nhs溶液和edc溶液活化后，加入一定量的rbd抗原，置于血液混匀仪上室温反应2h，采用10％bsa溶液进行封闭1h。封闭结束，14000rpm离心15min去上清，沉淀用复溶液进行复溶，定容至250μl，超声混匀，4℃冰箱保存备用。
(3)将步骤(2)制备的荧光纳米粒免疫复合物喷在结合垫上，与pvc底板、样品垫、nc膜和吸水垫组装成免疫层析试纸条，用于血清样本中新冠中和抗体的测定。
使用稀土掺杂荧光纳米粒作为标记物，利用其荧光寿命长的特点，通过时间分辨荧光免疫分析技术，检测血清样本中的新冠中和抗体，检测结果灵敏度高、特异性强。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
