一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在肿瘤中的应用的制作方法

1.本发明涉及发酵乳制品领域，特别是涉及一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途在肿瘤中的应用。


背景技术：

2.癌症，即恶性肿瘤，是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块，这种疾病破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者大多因器官功能的衰竭而死亡。以中国为例，2015年～2016年间每年估计有400多万例新发肿瘤病例和280多万例死亡病例，相当于平均每天12000人新患癌症、7500人死于癌症。癌症已成为世界范围公认的高致死率疾病之一，是危害人类生命健康的重要社会问题。
3.目前肿瘤(癌症)常用的治疗方式有：手术、化疗、放疗、生物免疫治疗、分子靶向治疗、中医中药治疗等几种方法，最主要治疗方法还是前3种：手术、化疗、放疗。
4.手术是癌症治疗优先考虑的手段，其弊端是有复发的风险、对晚期患者意义不大、部分重要器官周边的肿瘤难以切除，化疗的短板在于副作用大、药物拮抗、干扰其他药物的效果及失忆等，而放疗也有其不足之处。因此如何有效治疗肿瘤、研发抗肿瘤方法已成为亟待解决的临床难题及热点。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉) 及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用，用于解决现有技术中的问题。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为cgmcc no.20045，所述发酵乳制品为用于改善肿瘤进展的保健食品。
7.在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品为用于改善结肠癌进展的保健食品。
8.在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品选自发酵乳、乳粉中的一种或多种的组合。
9.在本发明一些实施方式中，所述发酵乳中的副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的活菌数＞8
×
108cfu/ml；
10.和/或，所述发酵乳粉中的副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的活菌数＞8
×
109cfu/g。
11.在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品的制备方法包括：
12.将接种有副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的脱脂乳进行发酵处理。
13.在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品的制备方法还包括：
14.将发酵所得发酵产物进行干燥处理。
15.在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为1
×
107～5
×
10
7 cfu/ml，优选为2
×
107～4
×
107cfu/ml，更优选为2.8
×
107cfu/ml～3.2
×
107cfu/ml。
16.在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比为3％～12％。
17.在本发明一些实施方式中，所述发酵处理中，发酵温度为26℃～42℃，优选为30℃～ 40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间为6h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h。
18.在本发明一些实施方式中，所述发酵处理为厌氧发酵处理。
附图说明
19.图1显示为本发明实施例7中小鼠结肠肿瘤的数量的统计结果示意图。
20.图2显示为本发明实施例7中小鼠结肠组织状态示意图。
21.图3显示为本发明实施例7中结肠细胞肿瘤相关基因表达热图示意图。
具体实施方式
22.为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本技术发明的其他优点及功效。
23.本发明第一方面提供一种副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途，所述副干酪乳杆菌的保藏号为cgmcc no.20045，所述发酵乳制品为用于改善肿瘤的保健食品。上述副干酪乳杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为cgmcc no. 20045。本技术发明人经过大量筛选研究，发现通过副干酪乳杆菌cgmcc no.20045制备的乳制品，可显著减少结肠肿瘤的形成数量、改善患肿瘤结肠的组织状态，逆转结肠癌组织的肿瘤相关基因的表达趋势(例如，可以是vegfa，ntrk1，braf，pikca，egfr，jun， kras，ezh2，以及notch1等基因，这些基因通常可以在肿瘤模型中高表达，而在实验组中其表达量通常显著下降，并且通过基因表达聚类分析可以发现，实验组肿瘤相关基因的表达模式整体上更偏向于正常组，而不是肿瘤组)，从而提供了副干酪乳杆菌cgmcc no.20045 在制备保健食品的用途。
24.上述用途中，如上所述，上述副干酪乳杆菌cgmcc no.20045可以被用于制备发酵乳制品，这些发酵乳制品可以为用于改善肿瘤的保健食品，尤其可以是用于改善结肠癌(例如，可以是可显著减少结肠肿瘤的形成数量、改善患肿瘤结肠的组织状态，逆转结肠癌组织的肿瘤相关基因的表达趋势等)的保健食品。这些发酵乳制品通常可以是发酵乳、乳粉等。
25.上述用途中，如上所述，发酵乳制品可以是发酵乳、发酵乳粉等。发酵乳制品中，通常需要具有一定量的活菌数。例如，在发酵乳中的副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的活菌数＞8
×
108cfu/ml。再例如，在发酵乳粉中的副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的活菌数＞ 8
×
109cfu/g。
26.上述用途中，发酵乳制品的制备方法可以包括：将接种有副干酪乳杆菌cgmcc no. 20045的脱脂乳进行发酵处理。本领域技术人员可选择合适的方法将接种有副干酪乳杆菌 cgmcc no.20045的脱脂乳进行发酵处理。
27.上述用途中，发酵乳制品的制备方法还可以包括：将发酵所得发酵产物进行干燥处理。发酵获得打得发酵产物或发酵乳制品通常可以是发酵乳，进一步进行干燥以后，即可
提供发酵乳粉。合适的对发酵产物进行干燥的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是冻干等。
28.上述用途中，发酵制备过程中的工艺参数会对发酵产物产生微妙的作用，合适的制备工艺可以使得制备获得的产品具有更佳的效果。例如，发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量可以为1
×
107～5
×
107cfu/ml、1
×
107～1.5
×
107cfu/ml、1.5
×
107～2
×
107cfu/ml、2
×
107～2.5
×
107cfu/ml、2.5
×
107～2.8
×
107cfu/ml、2.8
×
107～3
×
107cfu/ml、3
×
107～3.2
×
107cfu/ml、3.2
×
107～3.5
×
107cfu/ml、3.5
×
107～4
×
107cfu/ml、4
×
107～4.5
×
107cfu/ml、或4.5
×
107～5
×
107cfu/ml，优选为2
×
107～4
×
107cfu/ml，更优选为2.8
×
107cfu/ml～3.2
×
107cfu/ml；再例如，发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比可以为3％～12％、3％～4％、4％～5％、5％～6％、6％～7％、7％～8％、8％～9％、9％～10％、10％～11％、或11％～12％；再例如，发酵处理中，发酵温度可以为26℃～42℃、26℃～28℃、28℃～30℃、30℃～32℃、32℃～34℃、34℃～36℃、36℃～37℃、37℃～38℃、38℃～40℃、或40℃～42℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间可以为6h～18h、6h～7h、7h～8h、8h～9h、9h～10h、10h～11h、11h～12h、12h～13h、13h～14h、14h～15h、15h～16h、16h～17h、或17h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h；再例如，发酵处理可以为厌氧发酵处理。由本发明所提供的相关实施例可知，在优选发酵参数的范围之外时，副干酪乳杆菌cgmccno.20045在脱脂乳中的增殖效果明显下降，而在优选范围之内时，接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得副干酪乳杆菌cgmccno.20045发酵乳(粉)中活菌数量更高，从而使代谢产生的可协助改善高脂饮食引发的肠屏障受损的物质的合成量大幅增加。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的发酵乳(粉)中活菌数量低于优选的接种量范围。
29.本发明提供了副干酪乳杆菌cgmccno.20045、并进一步提供了通过其制备的发酵乳制品，所提供的发酵乳制品具有抗肿瘤的作用，其具体表现为显著减少结肠肿瘤的形成数量、改善患肿瘤结肠的组织状态，逆转结肠癌组织的肿瘤相关基因的表达趋势等，具有良好的产业化前景。
30.下面通过实施例对本技术予以进一步说明，但并不因此而限制本技术的范围。
31.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
32.实施例1
33.1、材料与方法
34.(a)种子(发酵菌种)的制备：
35.副干酪乳杆菌cgmcc no.20045：将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于mrs固体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mlmrs液体培养基(购买自merck co.，美国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v) 接种量接种于mrs液体培养基(购买自merck co.，美国)，37℃厌氧培养24h后，培养物 15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1
×
109cfu/ml。
36.(b)脱脂乳的制备：
37.将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需脱脂乳。
38.2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
39.将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045种子以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于8％(w/w，质量百分比，下同)脱脂乳，37℃厌氧培养12h得发酵乳a，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉a。
40.实施例2
41.1、材料与方法：
42.(a)种子(发酵菌种)的制备：
43.同实施例1。
44.(b)脱脂乳的制备：
45.将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得脱脂乳。
46.2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
47.将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045种子以接种量1％(v/v)无菌接种于12％(w/w)脱脂乳，42℃厌氧培养18h得发酵乳b，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉b。
48.实施例3
49.1、材料与方法：
50.(a)种子(发酵菌种)的制备：
51.同实施例1。
52.(b)脱脂乳的制备：
53.将质量百分比为3％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得脱脂乳。
54.2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：
55.将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045种子以接种量5％(v/v)无菌接种于3％(w/w)脱脂乳， 26℃厌氧培养6h得发酵乳c，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉c。
56.实施例4
57.1、材料与方法：
58.(a)种子(发酵菌种)的制备：
59.同实施例1。
60.(b)脱脂乳的制备：
61.将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得脱脂乳。
62.2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
63.将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含10％(w/w)脱脂乳，40℃厌氧培养15h得发酵乳d，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉d。
64.实施例5
65.1、材料与方法
66.(a)种子(发酵菌种)的制备：
67.同实施例1。
68.(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为5％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得脱脂乳。
69.2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：
70.将副干酪乳杆菌cgmcc no.20045种子以接种量2％(v/v)无菌接种于5％(w/w)脱脂乳， 30℃厌氧培养9h得发酵乳e，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉e。
71.实施例6
72.发酵乳(粉)活菌检测
73.对上述实施例1
‑
5所制备的副干酪乳杆菌发酵乳产品a、b、c、d和e、发酵乳粉产品a、 b、c、d和e进行活菌计数，结果如表1所示。
74.表1副干酪乳杆菌发酵乳(粉)活菌计数结果
[0075][0076]
如表所示，通过本发明技术方案中的方法所制得的副干酪乳杆菌发酵乳中活菌数量稳定保持在8
×
108cfu/ml以上，所制得的副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数量稳定保持在8
×
10
9 cfu/g以上。
[0077]
实施例7
[0078]
副干酪乳杆菌cgmcc no.20045发酵乳粉抗肿瘤作用的测定：
[0079]
建立动物模型：购买spf级4周龄的雌性成年c57bl/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，在建模实验开始的第1天对小鼠进行腹腔注射aom(10mg/kg，a5486，购买自sigma，美国)，从第5天开始将饮用水换为含1.5％dds(mw036000
‑
50000,0216011080,购买自mpbiomedicals，美国)的饮用水，确保每天向每只小鼠提供5ml含1.5％dds的饮用水，直到第10天将饮用水换回正常饮用水至实验结束。另取10只同龄的雌性成年c57bl/6 小鼠正常饲养备用(正常对照组)。
[0080]
动物实验：选取达到建模标准的小鼠20只，每组10只随机分为2组(模型对照组、发
酵乳粉干预组)。从第15天开始根据表2所示方法，向各组饲喂对应饲料，并用发酵乳粉复原液(由实施例4中方法制备的发酵乳粉按配制而成)或空白样品(实施例4中配制的10％脱脂乳)灌胃(0.375g/kg
·
d)。从建模开始，实验期间定期监测小鼠的体重变化。直到第60 天，对荷瘤小鼠实施安乐死，取出结肠组织，观察结肠肿瘤的数量和形态，并作单细胞测序。正常对照组小鼠也于同一天实施安乐死，取出结肠组织进行单细胞测序，并与上述模型对照组、发酵乳粉干预组小鼠的单细胞测序数据综合分析，将结肠癌相关基因构建热图进行基因表达差异的比较。
[0081]
表2实验动物分组与灌胃方法
[0082][0083][0084]
小鼠结肠肿瘤的数量的统计结果如图1所示。模型对照组小鼠的结肠中肿瘤数量为2～8 个，而发酵乳粉干预组小鼠的结肠肿瘤数为0～4个，说明发酵乳粉的干预有效减少了结肠肿瘤的形成数量。
[0085]
小鼠结肠组织状态如图2所示。受到形成的肿瘤影响，模型对照组小鼠的结肠组织凹凸不平，而经副干酪乳杆菌发酵乳粉干预后的小鼠结肠光滑平整，上述实验结果表明副干酪乳杆菌发酵乳粉对患肿瘤结肠的组织状态有一定改善作用。
[0086]
结肠细胞肿瘤相关基因表达热图如图3所示。经副干酪乳杆菌发酵乳粉干预后，小鼠结肠细胞中与结肠癌相关的基因表达趋势与模型对照组完全不同，相反地，其表达趋势与正常对照组更为接近，上述实验结果表明副干酪乳杆菌发酵乳粉对患肿瘤的结肠组织的基因表达趋势有一定的逆转作用，使其表达更正常化。
[0087]
实施例8
[0088]
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的副干酪乳杆菌发酵乳粉，各组所得发酵乳粉中活菌数如表3所示。
[0089]
表3不同方法制备所得副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数
[0090][0091]
从表3所示的结果中可以得出，将所述发酵乳粉的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，副干酪乳杆菌cgmcc no.20045依然可以在脱脂乳中得到部分增殖生长，但是其增殖效果明显下降，因此所制备得到的发酵乳粉中活菌数量远远低于优选范围内制备的发酵乳粉，从而影响其积极调控高脂饮食引起的肠屏障受损的物质的大量合成。
[0092]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0093]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
[0094]
分类命名：副干酪乳杆菌lactobacillusparacasei
[0095]
保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)
[0096]
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0097]
保藏日期：2020年06月08日
[0098]
保藏编号：cgmcc no.20045。