可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及人呼吸道病原体检测技术领域，具体来说，涉及一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒。
背景技术：
2.人腺病毒（human adenovirus，hadv）感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等，是人呼吸道感染常见的病原体之一。
3.人群普遍易感，主要表现为隐性感染、急性上呼吸道和下呼吸道感染，少数可发展为重症肺炎，甚至死亡。但免疫系统功能较弱或慢性呼吸系统疾病、心脏病等患者感染后引发严重疾病的风险较高，可出现重症和危重症，死亡风险较高。目前国内尚无针对人腺病毒感染的特异性抗病毒药物，临床上以对症支持、免疫调节治疗和针对并发症的治疗为主。
4.人腺病毒在全球普遍流行，其流行模式多变，常与人腺病毒型别、流行地区和易感人群的年龄等因素相关。人腺病毒感染一年四季均可发生，在我国北方以冬春季常见，南方以春夏季常见。
5.近年来，我国由人腺病毒引起的呼吸道感染暴发时有发生，个别地区出现了聚集性的重症病例。腺病毒引发的肺炎多见于6个月~５岁儿童，尤其是2岁以下儿童，自2019年以来我国部分地区儿童发生腺病毒肺炎较往年有不同程度增加，再次引起对该病的重视。
6.人腺病毒属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链dna病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径90~100 nm，可划分为a~g共7个亚属。由于不同人腺病毒对人体的组织嗜性不同，其中与呼吸道疾病相关的人腺病毒主要有 b 亚属（hadv
‑
3、7、11、14、16、21、55），c 亚属（hadv
‑
1、2、5、6）和 e 亚属（hadv
‑
4）。人腺病毒常与其他呼吸道病毒共同感染，也有不同型别人腺病毒共同感染的报道。
7.近年来快速病原学检测技术的推广应用，使得腺病毒的检出率提高，早期诊断成为可能，但在治疗方面仍有诸多问题亟待解决。就现阶段而言腺病毒引发的呼吸道疾病的早识别、早确诊对降低腺病毒感染重症率、致死率至关重要。
8.腺病毒的传统分型方法主要为血清学分型。受制于病毒分离的培养耗时长，对操作者的熟练度和判别经验要求高，一般实验室难以开展。随着分子生物学技术的发展，出现了通过pcr 扩增和基因测序等分子手段来进行鉴定的方法。然而受限于腺病毒的型别众多，致使原本以a地区流行的基因型设计的检测试剂，无法检出b地区流行的基因型。这在全球化趋势，病毒随人员流动广泛的当下，产生在a地区有效的试剂却无法在b地区适用，造成“假阴性”，导致误诊、漏诊。
技术实现要素：
9.针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
10.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，包括特异性引物、特异性探针、内参引物、内参探针、pcr扩增试剂、试剂盒阴性对照品、试剂盒阳性对照品和无核酶水，所述特异性引物及特异性探针的结合位点在感染人呼吸道的13种型别腺病毒的全基因组的高保守区段，所述13种型别腺病毒的型别为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、11型、14型、16型、21型、35型、55型；所述特异性引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：6所示；所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示；所述pcr扩增试剂包含热启动的dna聚合酶、dntps、高活性ung酶、dutp及pcr扩增缓冲液。
11.优选地，所述特异性引物及特异性探针的结合位点是在人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列内部。
12.优选地，所述内参引物的序列如seq id no：9
‑ꢀ
seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示，所述内参引物及内参探针检测和结合的区域是人核糖核酸酶p基因区段。
13.优选地，所述试剂盒阴性对照品为生理盐水。
14.优选地，所述试剂盒阳性对照品为克隆呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
15.优选地，所述特异性引物的上游引物序列如seq id no：1所示，所述特异性引物的下游引物序列如seq id no：4所示，所述特异性探针的序列如seq id no：8所示。
16.优选地，所述探针为taqman探针，所述探针上标有荧光基团。
17.优选地，所述荧光基团为fam、vic、cy5、tet、hex、joe中的一种或几种。
18.根据本发明的另一方面，提供了一种非诊断目的的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：（1）核酸提取：使用磁珠法或过柱法提取待检样本的核酸；（2）加样：对于待测样本检测管、阴性对照品检测管、阳性对照品检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的pcr反应液，4μl的引物探针组合，5μl待测dna，1μl的无核酶水；所述引物探针组合由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针构成，特异性正向引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3所示，所述特异性反向引物的序列如seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6所示，所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，所述内参的正向引物的序列如seq id no：9所示，所述内参的反向引物的序列如seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示；（3）上机扩增：检测仪器可使用abi公司的stepone plus或7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”；程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环；
（4）数据分析及结果判断：在检测仪器运行正常，且阴性质控、阳性质控的检测结果均在控的情况下：对于特异性引物检测管：当ct值≤39时，样本为腺病毒检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为腺病毒检测弱阳性；否则样本为腺病毒检测阴性；当ct值≥44时，样本为腺病毒检测阴性；对于内参引物检测管：当ct值≤39时，样本为内参基因检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为内参基因检测弱阳性；否则样本为内参基因检测阴性；当ct值≥44时，样本为内参基因检测阴性。
19.进一步地，所述样本为呼吸道感染患者的临床样本，所述样本包扩痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液。
20.本发明的有益效果：本发明的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒可精准覆盖高达13种型别的腺病毒，且不会受到其他非呼吸道腺病毒（特别是消化道腺病毒）以及其它微生物的序列影响，实现高覆盖度、高灵敏性、高特异性；通过对所述13种腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，对全基因组数十万碱基序列进行全面比对，找到十余个同源区域，并根据引物设计的多种原则（duplex formation hairpin、primer dimer、false priming、cross dimer），试验了多种设计软件，最终依靠在实验中经过多轮选择，找出了最佳检测引物和探针组合以及检测条件，实现了单管单重pcr即可覆盖感染人呼吸道的13种腺病毒，在扩增期间即可判别是否有腺病毒的存在，解决了目前检测环节为了覆盖多个型别而采用的多重荧光pcr、耗时的毛细管电泳检测或昂贵的高通量测序，造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性、时效性不能均优的难点问题。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒可以有效检出13种型别腺病毒的扩增图；图2为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒可以有效检出混合有13种型别腺病毒的扩增图；图3为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒检测已知阳性的临床样本的扩增曲线情况；图4为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒在待检目标低浓度下的灵敏度的情况；图5为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒在不同病原体检测中的
特异性。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明采用如下的技术方案：在国际权威数据库ncbi中下载人类腺病毒1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55型的历年来世界范围内主要流行的腺病毒全长序列(genbank: mh183293.1；mf044052.1； kf006344.1；kx868466.2；mh355567.1；mk886831.1；dq105654.4；fj597732.1；jx892927.2；kj364592.1；ay271307.1；fj349096.1；ay601636.1)，以此作为参照序列模板，由于腺病毒重组率很高，不同型别间保守区域过于狭窄，倘若按照传统方案采用一个型别使用一对引物及一条taqman探针，这就意味着为了覆盖13个型别，就需要在单管中实现13对引物及13条taqman探针的13重pcr，一方面造成对单一型别检测的灵敏度下降，另一方面也使得试剂成本提高13倍。
25.因此对上述13种腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，并进行了待检片段特异性和敏感性评估后，挑选了五联体(penton)蛋白所对应的基因序列作为引物及探针的结合区域，由于本检测所覆盖的型别广，不同型别间基因序列差异过大，引物探针有效的结合区域极其有限，遂在此基础上压缩引物以及探针的结合区，通过多轮实验筛选，最终从近五十对引物组合中挑选出最优的检测组合，该方案使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重的检测在效能上显著提高，也相较熔解曲线法有更高的灵敏度和时效性。
26.本发明所述的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，包括特异性引物、特异性探针、内参引物、内参探针、pcr扩增试剂、试剂盒阴性对照品、试剂盒阳性对照品和无核酶水，所述特异性引物及特异性探针的结合位点在感染人呼吸道的13种型别腺病毒的全基因组的高保守区段，所述13种型别腺病毒的型别为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、11型、14型、16型、21型、35型、55型；特异性引物为正反各一条引物构成；特异性探针为一条taqman探针，特异性引物及特异性探针组合用于检出样本中呼吸道腺病毒的有无。内参引物为正反各一条引物构成；内参探针为一条taqman探针，内参引物及内参探针组合用于检出样本中人源dna，防止样本采集错误或检测失败造成的“假阴性”。
27.利用上述两个引物及探针组合，即可在单管中实现同时检测13种人呼吸道腺病毒以及内参序列的核糖核酸酶 p，保证检测成功率的同时不会造成“假阴性”等漏检。
28.所述特异性引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：6所示；所述特异性引物及特异性探针的结合位点是在感染人呼吸道的13种型别腺病毒(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)的全基因组的五联体蛋白对应的基因区段，目的片段的特异性上游引物序列编号为seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3；目的片段的特异性下游引物序列编号为seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6，其中，上游引物优选为seq id no：1，下游引物优选为seq id no：4。上下游引物浓度的范围，筛选了每条8μm、10μm、12μm、15μm、18μm、20μm。上下游引物浓度优选为12μm。
29.所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，优选为seq id no：8；所用特异性探针浓度的范围，筛选了10μm、15μm、25μm、30μm、35μm。其中，特异性探针浓度优选为25μm。
30.所述内参引物的序列如seq id no：9
‑ꢀ
seq id no：10所示，其中，内参正向f引物序列如seq id no：9所示，内参反向r引物序列如seq id no：10所示，内参探针的序列如seq id no：11所示，所述内参引物及内参探针检测和结合的区域是人核糖核酸酶p(rnasep)基因区段。
31.所述pcr扩增试剂包含热启动的dna聚合酶、dntps、高活性ung酶、dutp及pcr扩增缓冲液。所述试剂盒阴性对照品为生理盐水。所述试剂盒阳性对照品为克隆呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。所述探针为taqman探针，所述探针上标有荧光基团，所述荧光基团为fam、vic、cy5、tet、hex、joe中的一种或几种，内参探针所用荧光基团应与腺病毒的特异性探针所用荧光基团的颜色不同，比如腺病毒用了fam，那么内参就用vic。
32.本发明的非诊断目的的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：（1）核酸提取：使用磁珠法或过柱法提取待检样本的核酸；（2）加样：对于待测样本检测管、阴性对照品检测管、阳性对照品检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的pcr反应液（含rox参比染料），4μl的引物探针组合（由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针构成），以下简称“引物组合mix”，5μl待测dna，1μl的无核酶水；所述特异性正向引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3所示，所述特异性反向引物的序列如seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6所示，所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，所述内参的正向引物的序列如seq id no：9所示，所述内参的正向引物的序列如 seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示；（3）上机扩增：检测仪器可使用abi公司的stepone plus或7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”；程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环；（4）数据分析及结果判断：在检测仪器运行正常，且阴性质控、阳性质控的检测结果均在控的情况下：对于特异性引物检测管：当ct值≤39时，样本为腺病毒检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为腺病毒检测弱阳性；否则样本为腺病毒检测阴性；当ct值≥44时，样本为腺病毒检测阴性；对于内参引物检测管：当ct值≤39时，样本为内参基因检测阳性；
当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为内参基因检测弱阳性；否则样本为内参基因检测阴性；当ct值≥44时，样本为内参基因检测阴性。
33.实施例1（1）核酸的提取：取外购自国际标准品及国内质控品的出厂已灭活的，感染人呼吸道腺病毒及假病毒等人工合成序列(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)，各一管。使用全自动核酸提取仪提取腺病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，按照每份10微升分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于
‑
80℃冰箱。
34.（2）核酸的稀释：吸取上一步的核酸原液，每个型别抽取5微升，先调整到相同浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释500倍，按照每份50微升分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于
‑
20℃冰箱。
35.（3）引物合成及稀释：外送英潍捷基合成特异性引物序列seq id no：1、seq id no：4，以及特异性探针seq id no：8，将引物用无核酶的超纯水配制成12μm浓度，将探针无核酶的超纯水稀释成25 μm浓度，然后分装成多个小份后，冻存于
‑
20℃冰箱。
36.（4）扩增体系的配制：每种型别分别配制一管特异性引物探针组合的检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix（由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针），5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
37.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl对照品提取的核酸，1μl的无核酶水。
38.（5）荧光定量检测的反应条件设置：使用abi公司的7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”。 程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环。
39.（6）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；13个型别的样本分别检测时，内参曲线无扩增；特异性引物曲线检测出的ct范围在22.1~24.5且具典型的“s”型扩增曲线，如图1所示，因此使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒可以有效检出13种型别腺病毒。
40.实施例2使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒同时检测13种型别腺病毒的混合物（1）核酸的提取
参见实施例1所述。
41.（2）核酸的稀释及混合抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，每个型别抽取10微升，先调整到相同浓度后，对这13种腺病毒dna，各抽取1微升进行混合，再使用87微升的无核酶的超纯水进行稀释(以下简称十三合一核酸稀释液)，冻存于
‑
20℃冰箱。
42.（3）引物合成及稀释参见实施例1所述。
43.（4）扩增体系的配制对于十三合一核酸稀释液的检测，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
44.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
45.（5）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
46.（6）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；十三合一核酸稀释液的检测，内参曲线无扩增；特异性引物检测出的ct值是18.2，且具典型的“s”型扩增曲线，如图2所示。
47.实施例3使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒检测临床阳性样本的情况（1）核酸的提取取临床已检测为腺病毒阳性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于
‑
20℃冰箱。
48.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
49.（3）扩增体系的配制：对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
50.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
51.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
52.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；已知阳性的临床样本的检测管中，特异性引物检测有扩增曲线；内参检测有扩增曲线，如图3所示。
53.实施例4使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒在待检
目标低浓度下的灵敏度的情况（1）核酸的提取与处理取外购已灭活的腺病毒7型，一管，使用全自动核酸提取仪提取腺病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，再进行5个梯度的稀释，然后分装成多个小份后，冻存于
‑
20℃冰箱。
54.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
55.（3）扩增体系的配制：对于5管不同浓度的待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
56.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
57.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
58.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；5个浓度梯度的样本检测结果显示，内参曲线无扩增；特异性引物曲线检测出的ct范围在27.7~39.5，且具典型的“s”型扩增曲线，且相互间的差值符合梯度稀释的情况，最低浓度下依旧可以检出ct值是39.5，如图4所示。
59.实施例5使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒在不同病原体检测中的特异性（1）核酸的提取取5支已检测为腺病毒阴性但其他病原体阳性的样本(eb病毒、合胞病毒a型、合胞病毒b型、肺炎支原体、柯萨奇病毒)，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于
‑
20℃冰箱。
60.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
61.（3）扩增体系的配制：对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
62.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
63.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
64.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；已检测为腺病毒阴性但其他病原体阳性的样本，特异性引物检测管无扩增曲线；内参引物检测管有扩增曲线，如图5所示。
65.综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过感染人呼吸道的13种型别腺病毒(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)的高保守区设计特异性引物，可实现单管单重pcr即可同时检测感染人呼吸道的13种腺病毒，实现高覆盖度。试剂含有高活性ung酶和dutp，在试剂配制时即可有效消除实验室残存气溶胶里的含有dutp的pcr污染片段，在消除假阳性的同时，还可保证高灵敏性和高特异性。解决了目前检测环节为了覆盖多个型别而采用的多重pcr，造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性、时效性不能均优的难点问题。
66.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明涉及人呼吸道病原体检测技术领域，具体来说，涉及一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒。
背景技术：
2.人腺病毒（human adenovirus，hadv）感染可引起多种疾病，包括肺炎、支气管炎、膀胱炎、眼结膜炎、胃肠道疾病及脑炎等，是人呼吸道感染常见的病原体之一。
3.人群普遍易感，主要表现为隐性感染、急性上呼吸道和下呼吸道感染，少数可发展为重症肺炎，甚至死亡。但免疫系统功能较弱或慢性呼吸系统疾病、心脏病等患者感染后引发严重疾病的风险较高，可出现重症和危重症，死亡风险较高。目前国内尚无针对人腺病毒感染的特异性抗病毒药物，临床上以对症支持、免疫调节治疗和针对并发症的治疗为主。
4.人腺病毒在全球普遍流行，其流行模式多变，常与人腺病毒型别、流行地区和易感人群的年龄等因素相关。人腺病毒感染一年四季均可发生，在我国北方以冬春季常见，南方以春夏季常见。
5.近年来，我国由人腺病毒引起的呼吸道感染暴发时有发生，个别地区出现了聚集性的重症病例。腺病毒引发的肺炎多见于6个月~５岁儿童，尤其是2岁以下儿童，自2019年以来我国部分地区儿童发生腺病毒肺炎较往年有不同程度增加，再次引起对该病的重视。
6.人腺病毒属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链dna病毒，病毒颗粒呈二十面体对称结构，直径90~100 nm，可划分为a~g共7个亚属。由于不同人腺病毒对人体的组织嗜性不同，其中与呼吸道疾病相关的人腺病毒主要有 b 亚属（hadv
‑
3、7、11、14、16、21、55），c 亚属（hadv
‑
1、2、5、6）和 e 亚属（hadv
‑
4）。人腺病毒常与其他呼吸道病毒共同感染，也有不同型别人腺病毒共同感染的报道。
7.近年来快速病原学检测技术的推广应用，使得腺病毒的检出率提高，早期诊断成为可能，但在治疗方面仍有诸多问题亟待解决。就现阶段而言腺病毒引发的呼吸道疾病的早识别、早确诊对降低腺病毒感染重症率、致死率至关重要。
8.腺病毒的传统分型方法主要为血清学分型。受制于病毒分离的培养耗时长，对操作者的熟练度和判别经验要求高，一般实验室难以开展。随着分子生物学技术的发展，出现了通过pcr 扩增和基因测序等分子手段来进行鉴定的方法。然而受限于腺病毒的型别众多，致使原本以a地区流行的基因型设计的检测试剂，无法检出b地区流行的基因型。这在全球化趋势，病毒随人员流动广泛的当下，产生在a地区有效的试剂却无法在b地区适用，造成“假阴性”，导致误诊、漏诊。
技术实现要素：
9.针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
10.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，包括特异性引物、特异性探针、内参引物、内参探针、pcr扩增试剂、试剂盒阴性对照品、试剂盒阳性对照品和无核酶水，所述特异性引物及特异性探针的结合位点在感染人呼吸道的13种型别腺病毒的全基因组的高保守区段，所述13种型别腺病毒的型别为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、11型、14型、16型、21型、35型、55型；所述特异性引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：6所示；所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示；所述pcr扩增试剂包含热启动的dna聚合酶、dntps、高活性ung酶、dutp及pcr扩增缓冲液。
11.优选地，所述特异性引物及特异性探针的结合位点是在人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列内部。
12.优选地，所述内参引物的序列如seq id no：9
‑ꢀ
seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示，所述内参引物及内参探针检测和结合的区域是人核糖核酸酶p基因区段。
13.优选地，所述试剂盒阴性对照品为生理盐水。
14.优选地，所述试剂盒阳性对照品为克隆呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
15.优选地，所述特异性引物的上游引物序列如seq id no：1所示，所述特异性引物的下游引物序列如seq id no：4所示，所述特异性探针的序列如seq id no：8所示。
16.优选地，所述探针为taqman探针，所述探针上标有荧光基团。
17.优选地，所述荧光基团为fam、vic、cy5、tet、hex、joe中的一种或几种。
18.根据本发明的另一方面，提供了一种非诊断目的的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：（1）核酸提取：使用磁珠法或过柱法提取待检样本的核酸；（2）加样：对于待测样本检测管、阴性对照品检测管、阳性对照品检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的pcr反应液，4μl的引物探针组合，5μl待测dna，1μl的无核酶水；所述引物探针组合由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针构成，特异性正向引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3所示，所述特异性反向引物的序列如seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6所示，所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，所述内参的正向引物的序列如seq id no：9所示，所述内参的反向引物的序列如seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示；（3）上机扩增：检测仪器可使用abi公司的stepone plus或7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”；程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环；
（4）数据分析及结果判断：在检测仪器运行正常，且阴性质控、阳性质控的检测结果均在控的情况下：对于特异性引物检测管：当ct值≤39时，样本为腺病毒检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为腺病毒检测弱阳性；否则样本为腺病毒检测阴性；当ct值≥44时，样本为腺病毒检测阴性；对于内参引物检测管：当ct值≤39时，样本为内参基因检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为内参基因检测弱阳性；否则样本为内参基因检测阴性；当ct值≥44时，样本为内参基因检测阴性。
19.进一步地，所述样本为呼吸道感染患者的临床样本，所述样本包扩痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液。
20.本发明的有益效果：本发明的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒可精准覆盖高达13种型别的腺病毒，且不会受到其他非呼吸道腺病毒（特别是消化道腺病毒）以及其它微生物的序列影响，实现高覆盖度、高灵敏性、高特异性；通过对所述13种腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，对全基因组数十万碱基序列进行全面比对，找到十余个同源区域，并根据引物设计的多种原则（duplex formation hairpin、primer dimer、false priming、cross dimer），试验了多种设计软件，最终依靠在实验中经过多轮选择，找出了最佳检测引物和探针组合以及检测条件，实现了单管单重pcr即可覆盖感染人呼吸道的13种腺病毒，在扩增期间即可判别是否有腺病毒的存在，解决了目前检测环节为了覆盖多个型别而采用的多重荧光pcr、耗时的毛细管电泳检测或昂贵的高通量测序，造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性、时效性不能均优的难点问题。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒可以有效检出13种型别腺病毒的扩增图；图2为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒可以有效检出混合有13种型别腺病毒的扩增图；图3为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒检测已知阳性的临床样本的扩增曲线情况；图4为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒在待检目标低浓度下的灵敏度的情况；图5为使用本发明实施例所述的荧光定量pcr检测试剂盒在不同病原体检测中的
特异性。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明采用如下的技术方案：在国际权威数据库ncbi中下载人类腺病毒1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55型的历年来世界范围内主要流行的腺病毒全长序列(genbank: mh183293.1；mf044052.1； kf006344.1；kx868466.2；mh355567.1；mk886831.1；dq105654.4；fj597732.1；jx892927.2；kj364592.1；ay271307.1；fj349096.1；ay601636.1)，以此作为参照序列模板，由于腺病毒重组率很高，不同型别间保守区域过于狭窄，倘若按照传统方案采用一个型别使用一对引物及一条taqman探针，这就意味着为了覆盖13个型别，就需要在单管中实现13对引物及13条taqman探针的13重pcr，一方面造成对单一型别检测的灵敏度下降，另一方面也使得试剂成本提高13倍。
25.因此对上述13种腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，并进行了待检片段特异性和敏感性评估后，挑选了五联体(penton)蛋白所对应的基因序列作为引物及探针的结合区域，由于本检测所覆盖的型别广，不同型别间基因序列差异过大，引物探针有效的结合区域极其有限，遂在此基础上压缩引物以及探针的结合区，通过多轮实验筛选，最终从近五十对引物组合中挑选出最优的检测组合，该方案使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重的检测在效能上显著提高，也相较熔解曲线法有更高的灵敏度和时效性。
26.本发明所述的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，包括特异性引物、特异性探针、内参引物、内参探针、pcr扩增试剂、试剂盒阴性对照品、试剂盒阳性对照品和无核酶水，所述特异性引物及特异性探针的结合位点在感染人呼吸道的13种型别腺病毒的全基因组的高保守区段，所述13种型别腺病毒的型别为1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、11型、14型、16型、21型、35型、55型；特异性引物为正反各一条引物构成；特异性探针为一条taqman探针，特异性引物及特异性探针组合用于检出样本中呼吸道腺病毒的有无。内参引物为正反各一条引物构成；内参探针为一条taqman探针，内参引物及内参探针组合用于检出样本中人源dna，防止样本采集错误或检测失败造成的“假阴性”。
27.利用上述两个引物及探针组合，即可在单管中实现同时检测13种人呼吸道腺病毒以及内参序列的核糖核酸酶 p，保证检测成功率的同时不会造成“假阴性”等漏检。
28.所述特异性引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：6所示；所述特异性引物及特异性探针的结合位点是在感染人呼吸道的13种型别腺病毒(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)的全基因组的五联体蛋白对应的基因区段，目的片段的特异性上游引物序列编号为seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3；目的片段的特异性下游引物序列编号为seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6，其中，上游引物优选为seq id no：1，下游引物优选为seq id no：4。上下游引物浓度的范围，筛选了每条8μm、10μm、12μm、15μm、18μm、20μm。上下游引物浓度优选为12μm。
29.所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，优选为seq id no：8；所用特异性探针浓度的范围，筛选了10μm、15μm、25μm、30μm、35μm。其中，特异性探针浓度优选为25μm。
30.所述内参引物的序列如seq id no：9
‑ꢀ
seq id no：10所示，其中，内参正向f引物序列如seq id no：9所示，内参反向r引物序列如seq id no：10所示，内参探针的序列如seq id no：11所示，所述内参引物及内参探针检测和结合的区域是人核糖核酸酶p(rnasep)基因区段。
31.所述pcr扩增试剂包含热启动的dna聚合酶、dntps、高活性ung酶、dutp及pcr扩增缓冲液。所述试剂盒阴性对照品为生理盐水。所述试剂盒阳性对照品为克隆呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。所述探针为taqman探针，所述探针上标有荧光基团，所述荧光基团为fam、vic、cy5、tet、hex、joe中的一种或几种，内参探针所用荧光基团应与腺病毒的特异性探针所用荧光基团的颜色不同，比如腺病毒用了fam，那么内参就用vic。
32.本发明的非诊断目的的可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：（1）核酸提取：使用磁珠法或过柱法提取待检样本的核酸；（2）加样：对于待测样本检测管、阴性对照品检测管、阳性对照品检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的pcr反应液（含rox参比染料），4μl的引物探针组合（由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针构成），以下简称“引物组合mix”，5μl待测dna，1μl的无核酶水；所述特异性正向引物的序列如seq id no：1
‑ꢀ
seq id no：3所示，所述特异性反向引物的序列如seq id no：4
‑ꢀ
seq id no：6所示，所述特异性探针的序列如seq id no：7
‑ꢀ
seq id no：8所示，所述内参的正向引物的序列如seq id no：9所示，所述内参的正向引物的序列如 seq id no：10所示，所述内参探针的序列如seq id no：11所示；（3）上机扩增：检测仪器可使用abi公司的stepone plus或7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”；程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环；（4）数据分析及结果判断：在检测仪器运行正常，且阴性质控、阳性质控的检测结果均在控的情况下：对于特异性引物检测管：当ct值≤39时，样本为腺病毒检测阳性；当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为腺病毒检测弱阳性；否则样本为腺病毒检测阴性；当ct值≥44时，样本为腺病毒检测阴性；对于内参引物检测管：当ct值≤39时，样本为内参基因检测阳性；
当40≤ct值≤43时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤43，则样本为内参基因检测弱阳性；否则样本为内参基因检测阴性；当ct值≥44时，样本为内参基因检测阴性。
33.实施例1（1）核酸的提取：取外购自国际标准品及国内质控品的出厂已灭活的，感染人呼吸道腺病毒及假病毒等人工合成序列(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)，各一管。使用全自动核酸提取仪提取腺病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，按照每份10微升分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于
‑
80℃冰箱。
34.（2）核酸的稀释：吸取上一步的核酸原液，每个型别抽取5微升，先调整到相同浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释500倍，按照每份50微升分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于
‑
20℃冰箱。
35.（3）引物合成及稀释：外送英潍捷基合成特异性引物序列seq id no：1、seq id no：4，以及特异性探针seq id no：8，将引物用无核酶的超纯水配制成12μm浓度，将探针无核酶的超纯水稀释成25 μm浓度，然后分装成多个小份后，冻存于
‑
20℃冰箱。
36.（4）扩增体系的配制：每种型别分别配制一管特异性引物探针组合的检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix（由0.8μl特异性正向引物、0.8μl特异性反向引物、0.4μl特异性探针、0.8μl内参的正向引物、0.8μl内参的反向引物、0.4μl内参探针），5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
37.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl对照品提取的核酸，1μl的无核酶水。
38.（5）荧光定量检测的反应条件设置：使用abi公司的7500型号的荧光定量pcr仪，检测模式选择为“quantitation”，“taqman reagents”。 程序设置：预变性：95℃ 5min，1个循环；变性：95℃ 20s，退火 延伸：60℃ 1min，信号采集，45个循环。
39.（6）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；13个型别的样本分别检测时，内参曲线无扩增；特异性引物曲线检测出的ct范围在22.1~24.5且具典型的“s”型扩增曲线，如图1所示，因此使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒可以有效检出13种型别腺病毒。
40.实施例2使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒同时检测13种型别腺病毒的混合物（1）核酸的提取
参见实施例1所述。
41.（2）核酸的稀释及混合抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，每个型别抽取10微升，先调整到相同浓度后，对这13种腺病毒dna，各抽取1微升进行混合，再使用87微升的无核酶的超纯水进行稀释(以下简称十三合一核酸稀释液)，冻存于
‑
20℃冰箱。
42.（3）引物合成及稀释参见实施例1所述。
43.（4）扩增体系的配制对于十三合一核酸稀释液的检测，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
44.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
45.（5）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
46.（6）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；十三合一核酸稀释液的检测，内参曲线无扩增；特异性引物检测出的ct值是18.2，且具典型的“s”型扩增曲线，如图2所示。
47.实施例3使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒检测临床阳性样本的情况（1）核酸的提取取临床已检测为腺病毒阳性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于
‑
20℃冰箱。
48.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
49.（3）扩增体系的配制：对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
50.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
51.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
52.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；已知阳性的临床样本的检测管中，特异性引物检测有扩增曲线；内参检测有扩增曲线，如图3所示。
53.实施例4使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒在待检
目标低浓度下的灵敏度的情况（1）核酸的提取与处理取外购已灭活的腺病毒7型，一管，使用全自动核酸提取仪提取腺病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，再进行5个梯度的稀释，然后分装成多个小份后，冻存于
‑
20℃冰箱。
54.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
55.（3）扩增体系的配制：对于5管不同浓度的待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
56.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
57.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
58.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；5个浓度梯度的样本检测结果显示，内参曲线无扩增；特异性引物曲线检测出的ct范围在27.7~39.5，且具典型的“s”型扩增曲线，且相互间的差值符合梯度稀释的情况，最低浓度下依旧可以检出ct值是39.5，如图4所示。
59.实施例5使用本发明所述可覆盖13种型别腺病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒在不同病原体检测中的特异性（1）核酸的提取取5支已检测为腺病毒阴性但其他病原体阳性的样本(eb病毒、合胞病毒a型、合胞病毒b型、肺炎支原体、柯萨奇病毒)，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于
‑
20℃冰箱。
60.（2）引物合成及稀释：参见实施例1所述。
61.（3）扩增体系的配制：对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的 taqman universal pcr master mix，4μl的引物组合mix，5μl待测稀释dna，1μl的无核酶水。
62.对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，参见实施例1所述。
63.（4）荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例1所述。
64.（5）结果判定：阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；已检测为腺病毒阴性但其他病原体阳性的样本，特异性引物检测管无扩增曲线；内参引物检测管有扩增曲线，如图5所示。
65.综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过感染人呼吸道的13种型别腺病毒(1、2、3、4、5、6、7、11、14、16、21、35、55)的高保守区设计特异性引物，可实现单管单重pcr即可同时检测感染人呼吸道的13种腺病毒，实现高覆盖度。试剂含有高活性ung酶和dutp，在试剂配制时即可有效消除实验室残存气溶胶里的含有dutp的pcr污染片段，在消除假阳性的同时，还可保证高灵敏性和高特异性。解决了目前检测环节为了覆盖多个型别而采用的多重pcr，造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性、时效性不能均优的难点问题。
66.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
