一株适于液化法酿造米酒的酿酒酵母及其应用的制作方法

1.本发明涉及一株适于液化法酿造米酒的酿酒酵母及其应用，属于生物工程发酵技术领域。


背景技术：

2.糯米属禾本科稻属植物糯稻的去壳种仁，在我国广泛种植。糯米不仅作为粽子、年糕等各式黏性食品的主要食材，因其高支链淀粉含量而具有的高出酒率，也是酿造米酒和黄酒的优质原料。糯米富含糖类、蛋白质和矿物质等，且具有补虚、补血、健脾暖胃等功效，是一种温和的滋补品。我国稻米加工总体尚处于一种满足口粮大米需求的初级加工阶段，有效利用率只达60％～65％，副产品深加工利用极少，资源综合利用水平低，有必要开展糯米深加工技术的研发，提升糯米产品的附加值和资源利用率。
3.米酒是以糯米为主要原料，经液化、糖化、发酵酿造而成。我国使用优质糯米酿酒已有上千年的历史。传统米酒多为固态发酵或半固态发酵，经浸米、蒸煮、发酵、压榨、澄清、煎酒、陈化、勾兑等步骤，该方法生产效率低，且很难确保米酒的批间风味稳定性。与用曲和酵母发酵的传统米酒相比，使用酶法液化制备糯米糖液，接种纯种酵母的清爽型液态米酒，可以使米酒产品风味品质更可控，提高劳动生产率和机械水平，有利于现代化工业生产的应用。
4.酵母的性能优劣不仅决定了米酒的酿造效率，还影响这米酒的风味品质。我国传统米酒酒曲中含有多种微生物，其中酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是酒曲中主要的产酒精功能菌，对米酒的质量和发酵效率有较大影响。但酒曲中的酵母并非纯种酵母，目前对适用于米酒发酵的酿酒酵母的研究较为缺乏。因此筛选出一株适用于米酒发酵的纯种酿酒酵母就显得尤为重要。


技术实现要素：

5.为了解决目前存在的问题，本发明从不同地区的米酒酒曲中筛选得到一株适于米酒发酵的酿酒酵母。
6.本发明提供了一株酿酒酵母，所述酿酒酵母已于2021年05月06日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22277，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的酿酒酵母。
8.本发明提供了一种酿造米酒的方法，所述方法是利用权利要求1所述酿酒酵母，或所述微生物菌剂，在含有糯米汁的体系中发酵制备得到米酒。
9.在一种实施方式中，以含有糯米汁的培养基为原料，控制培养基的初始含糖量为10％～16％，所述酿酒酵母在发酵体系中初始的细胞浓度为1.0
×
106～1.0
×
108cfu/ml。
10.在一种实施方式中，所述酿酒酵母在发酵体系中初始的细胞浓度为1.0
×
107cfu/
ml。
11.在一种实施方式中，在22～28℃发酵至24h内失重<0.2g/300ml。
12.在一种实施方式中，在25℃发酵。
13.在一种实施方式中，所述含有糯米汁的培养基的制备方法为：将粉碎糯米与水按照1：(5～7)的质量比，于45～55℃投料，并添加高温α
‑
淀粉酶，升温至90～100℃，保温25～35min，升温至100～105℃，煮沸5～15min；冷却至45～55℃，按150～250u/g糯米的量添加蛋白酶，保温25～35min；升温至60～65℃，按150～200u/g糯米的量添加糖化酶，保温110～130min；过滤后煮沸5～15min，将所得糯米糖液稀释成目标糖度，于高压蒸汽灭菌锅中105℃灭菌10min，即为糯米发酵培养基。
14.本发明提供了一种改善米酒风味的方法，所述方法是利用所述酿酒酵母，或权利要求2所述微生物菌剂，在含有糯米的体系中，发酵生产米酒。
15.本发明提供了一种食品，所述食品含有权利要求1所述酿酒酵母，或权利要求2所述微生物菌剂。
16.在一种实施方式中，以大米或糯米为原料的发酵食品，所述发酵食品是利用所述酿酒酵母，或所述微生物菌剂发酵得到。
17.本发明提供了所述酿酒酵母，或所述微生物菌剂在制备大米、糯米发酵食品中的应用。
18.在一种实施方式中，所述食品包括但不限于米酒、酒酿。
19.有益效果：本发明提供的酿酒酵母cgmcc no.22277用于液化法液态米酒的酿造，能够适应米汁的发酵环境、起酵速度快、发酵彻底，糖转化效率高，米酒米香馥郁，发酵后米酒口感柔和，香气浓郁，并有典型米酒香气。
20.生物材料保藏
21.本发明所提供的酿酒酵母rl
‑
01，分类学命名为酿酒酵母saccharomyces cerevisiae，已于2021年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22277，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
22.图1为菌株产气情况分类图；
23.图2为酵母18s rdna pcr产物电泳图；
24.图3为基于18s rdna测序结果构建酵母菌株系统发育树。
具体实施方式
25.本发明实施例中菌株筛选和性能测定中所用的培养基：
26.ypd培养基(g/l)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。
27.ypd培养基平板、斜面(g/l)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0，琼脂粉20.0。
28.商业biggy agar培养基：青岛海博生物技术有限公司。
29.ttc底层培养基(g/l)：葡萄糖50.5，蛋白胨10.0，酵母浸膏7.5，酸性磷酸钾5.0，硫酸镁2.0，柠檬酸1.35，氨苄青霉素1.0，调整ph在4.0以上，琼脂30.0。
30.ttc上层培养基(g/l)：葡萄糖0.5，琼脂15.0；灭菌后冷却后加入ttc 0.5。
31.糯米汁发酵培养基：粉碎糯米按照料水比1：6的质量，于50℃投料。添加高温α
‑
淀粉酶，升温至95℃，保温30min，升温至100℃，煮沸10min；冷却至50℃，蛋白酶按200u/g糯米的量添加，保温30min；升温至62℃，糖化酶按180u/g糯米的量添加，保温120min；过滤后煮沸10min。所得糯米糖液根据需要稀释成目标糖度，于高压蒸汽灭菌锅中105℃灭菌10min，即为糯米发酵培养基。
32.实施例1：酿酒酵母的筛选及鉴定
33.本实例中菌株筛选，具体步骤如下：
34.1、菌株分离
35.购买来自四川、湖北、江西、广西、云南、江苏六个地区的12种米酒酒曲。分别取2g酒曲样品值添加至含玻璃珠的、50ml无菌生理盐水中，25℃、180rpm培养20min后，将菌液稀释涂布至添加含有1g/l丙酸钠、25mg/l氨苄的抗菌ypd固体平板中，28℃培养48h，并观察菌落生长情况。将培养后具有形态圆形、表明光滑、边缘整齐的菌落挑出，在ypd平板中进行二次划线分离，纯化的分离物接入ypd液体甘油管中在
‑
80℃保存，并编号。
36.2、菌株一级筛选
37.将甘油管保藏的菌株接种于ypd液体试管中28℃、180rpm培养活化18
‑
24h后，转接至ypd液体试管28℃、180rpm培养活化18
‑
24h。活化后菌株接种于糖度为11％的含杜氏小管的糯米汁中，25℃静置培养48h，保留起酵速度快的菌株进行下一级筛选(表1)。
38.表1菌株杜氏小管产气结果
[0039][0040][0041]
3、菌株的二级筛选
[0042]
在ypd液体试管中活化起酵能力较好和好的菌株，在biggy agar平板上点样5μl过夜培养物，28℃静置培养48h，根据菌落颜色选择低产或者不产硫化氢的菌株进行下一级筛选(菌落颜色越浅，硫化氢生产能力低)。
[0043]
表2菌株的biggy agar显色程度结果
[0044]
[0045]
4、菌株的三级筛选
[0046]
将以上筛选得到的酵母菌株在ypd液体试管中活化，在ttc平板上点样5μl并倒入ttc上层培养基，28℃避光培养24～48h，挑选菌落颜色较深，产酒精能力强菌株。
[0047]
表3菌株的ttc显色程度结果
[0048][0049]
5、菌株的四级筛选
[0050]
在糯米汁发酵培养基中接种酿酒酵母菌株，以已报道的米酒酵母yshj为对照，根据发酵速度与酒精度得到7株酒精度>4％vol菌株，并进一步通过gc
‑
ms风味物质分析。
[0051]
具体发酵方法为：糯米汁发酵培养基糖度12％，发酵规模500ml，装液量60％，酵母接种量为发酵体系中细胞浓度107cfu/ml，25℃发酵，并监测其失重，直至24h内失重<0.2g/300ml，发酵结束。
[0052]
发现构成米酒主要香气成分物质有醇类、酯类、酸类、酮醛类化合物。其中β
‑
苯乙醇作为一种芳香醇类，是米酒特征香气性物质具有花香、玫瑰、蜂蜜的香气贡献。酯类物质对米酒香气起着积极作用，7株菌中酯类含量较高的为21、26、30、127号，其中30和127号菌株酸类含量过高，导致米酒口感粗糙、有腐败的不不愉悦香气。21号菌株酯类化合物占比低于26号，且含有乙酸、异丁酸、癸醇等具有腐臭、油腻气味的物质，也导致21号菌株发酵米酒香气不协调，而这些物质未在26号中检测得到。26号菌株高级醇、酸类含量适中，酒体更为协调，具有典型米酒香气特征，最终保留菌株26号。
[0053]
表4米酒酒精度及风味物质含量
[0054][0055]
表5风味化合物分析
[0056]
[0057][0058]
6、菌种鉴定
[0059]
在ypd液体试管中活化目的菌株。取2ml培养液10000rpm 1min离心弃上清，采用酵母dna提取试剂盒提取菌体dna，使用酵母18srdna通用引物扩增基因组dna，pcr产物使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。采用blast方式将测定的18srdna序列与genbank中的序列进行比对，结果如图所示，图2为pcr产物胶图，图3为进化树，确定该菌株为酿酒酵母并重新命名为酿酒酵母rl
‑
01。
[0060]
18srdna通用引物：
[0061]
f：5'
‑
tcctccgcttattgatatgc
‑
3'，
[0062]
r：5'
‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑
3'。
[0063]
实施例2：酿酒酵母rl
‑
01在液化法米酒发酵中的应用
[0064]
以糯米汁发酵培养基为原料，初始含糖量为16％，发酵规模500ml，装瓶量60％，于高压蒸汽灭菌锅中105℃灭菌10min，rl
‑
01接种量为发酵体系中细胞浓度为107cfu/ml，25℃发酵，并监测其失重，直至24h内失重<0.2g/300ml(发酵周期约10天)，发酵结束，发酵结束后测定其基础指标(表6)与感官品评，rl
‑
01菌株发酵糯米米酒具有更高的糖转化效率(对糖的利用更多，酒精度更高、残糖更少)，米酒色泽纯正，米香馥郁，口感清爽协调，具有典型的米酒特征，表7为感官品评标准。
[0065]
米酒酵母yshj按照上述同样的方法进行发酵，发酵周期约为10天，发酵结束后，测定其基础指标。
[0066]
表6糯米酒基本理化指标
[0067][0068]
表7感官品评标准
[0069][0070]
实施例3：酿酒酵母rl
‑
01微生物菌剂的制备
[0071]
取200～600μl的酿酒酵母rl
‑
01接种于10～30ml ypd液体培养基中，28℃下活化2至3代，待酿酒酵母rl
‑
01达到108cfu/ml以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液)
和冷冻保护剂(15％(w/v)的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
[0072]
实施例4：酿酒酵母rl
‑
01微生物菌剂在液化发酵米酒中的应用
[0073]
具体实施方式参见实施例2，将实施例3制备的微生物菌剂加水稀释后加入发酵体系中，25℃发酵，并监测其失重，直至24h内失重<0.2g/300ml，发酵完成。
[0074]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。