自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统与方法与流程

1.本发明属于生物医学工程领域，涉及一种自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统与方法。


背景技术：

2.由于胞内电信号可以提供高信噪比动作电位信号，为获取高质量的动作电位信号，通常基于平面电极的电穿孔技术，在电极上施加脉冲使细胞膜表面出现破裂，从而使电极能记录到胞内电信号。当前通常采用信号发生器作为电穿孔设备，其通道数有限，无法发挥使用微电极阵列中两个或几个微电极就可产生电场的优势，还有现有仪器所有通道同时进行电穿孔，两个通道之间会造成串扰，电穿孔效率较低。且在检测胞内电信号实验中，实验人员需要测试不同电穿孔条件，工作量大，操作复杂，成为深入研究心肌细胞电生理现象的障碍。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统与方法，包括微电极阵列传感器、胞内外电信号调理电路、电穿孔控制电路、数据采集卡、金属屏蔽盒、上位机和电源模块。通过该系统可以在一台仪器上实现细胞电穿孔和心肌细胞胞内外电信号记录的功能，能控制各通道逐一产生不同频率、幅值、脉宽的脉冲信号施加到细胞上，可实现在一次实验内不同条件电穿孔结果的对比，又能检测细胞电生理现象的变化，实现高时空分辨率的细胞电信号记录。同时，通过上位机能实现高效自动化分析，通过遍历不同的电穿孔条件，结合数据分析筛选出电穿孔的最优条件，以最优条件进行细胞电穿孔，从而实现高质量地对心肌细胞的胞内电信号进行记录。
4.本发明是通过以下技术方案来实现的：
5.一种自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统，包括：
6.微电极阵列传感器，包括基底、位于基底上的细胞培养腔、形成于基底上的微电极阵列，所述微电极阵列包括多个微电极，且位于所述细胞培养腔内；电极引出端，包括与所述多个微电极中的每个微电极对应的工作电极引出端和共用的参考电极引出端。
7.胞内外电信号调理模块，包括与微电极数目相同的多路胞内外电信号调理电路，每路输入端分别与每个工作电极引出端相连，用于滤除噪声和放大采集的胞内外电信号。所述胞内外电信号调理模块的地线与参考电极引出端相连。
8.电穿孔控制模块，包括与微电极数目相同的多路电穿孔控制电路，每路输出端分别与每个工作电极引出端相连，用于控制每个微电极电穿孔信号的通断。
9.数据采集卡，所述数据采集卡的模拟输入端与胞内外电信号调理模块的输出端相连，所述数据采集卡的模拟输出端与电穿孔控制模块的输入端相连，分别产生对应微电极的电穿孔信号。
10.上位机，与数据采集卡相连，用于控制数据采集卡。
11.电源模块，与胞内外电信号调理模块、电穿孔控制模块、数据采集卡连接，用于为胞内外电信号调理模块、电穿孔控制模块、数据采集卡提供稳定的电源。
12.进一步地，每路胞内外电信号调理电路均由依次连接的高通滤波电路、第一级放大电路、带通滤波器电路和第二级放大电路组成，其中，所述带通滤波器电路包括rc高通滤波电路和巴特沃斯低通滤波电路。
13.进一步地，每路电穿孔控制电路均由电源控制电路、放大电路、通道控制电路组成，电源控制电路由nmos管和pmos管组成，用于根据数据采集卡的数字输出端输出的控制信号控制放大电路、通道控制电路的电源通断；放大电路为同相比例放大器，用于放大数据采集卡的模拟输出端输出的电穿孔信号；通道控制电路包括电压跟随器和控制开关，其中电压跟随器的输入端与放大电路的输出端连接，输出端与控制开关的一端连接，控制开关的另一端与微电极阵列传感器的一微电极引出端连接。所述控制开关的控制端与数据采集卡的数字输出端连接。
14.进一步地，所述电源控制电路由电阻r13和电阻r15、电容c8、电感l2、nmos管q5、pmos管q4组成，nmos管q5的栅极与数据采集卡的数字输出端相连，同时与电阻r15相连到地，nmos管q5的源极接地，漏极与pmos管q4的栅极相连，同时与电阻r13相连至电源模块的输出端，pmos管q4的源极与电源模块的输出端相连，漏极与电感l2相连，电感l2另一端接电容c8，形成lc滤波电路，滤波后为电源输出vcc，为放大电路和通道控制电路供电。
15.进一步地，还包括用于屏蔽外界的工频干扰、高频干扰的金属屏蔽盒。
16.进一步地，所述金属屏蔽盒还设有可开合的金属屏蔽盖。
17.本发明还提供了一种高效自动化电穿孔调控条件筛选测量方法，具体为：
18.采用微电极阵列传感器进行电穿孔测试，根据微电极阵列传感器中微电极数量设置同等数量的电穿孔条件，根据电穿孔条件控制每个微电极逐一产生不同条件下的电穿孔信号，同时采集对应微电极的心肌细胞胞内电信号。
19.对所有微电极的心肌细胞胞内电信号进行分析，获得最优的电穿孔条件。
20.进一步地，所述电穿孔条件包括电穿孔信号幅值、频率和脉宽范围，以及电穿孔持续时间等。
21.进一步地，电穿孔信号幅值大小为0～20v、频率范围为5hz～100khz、脉宽范围为10μs～0.2s的脉冲。
22.与现有技术相比，本发明的优点如下：
23.1、在一台仪器上实现细胞电穿孔和细胞胞内外电信号记录的功能，避免了现有仪器不能整合，需要在两种仪器上分别进行细胞刺激控制，细胞胞内外信号检测记录的弊端；
24.2、能控制各通道产生频率、幅值、脉宽可调的脉冲信号且产生电穿孔的通道可选，通过遍历每个通道实现遍历不同的电穿孔条件，从而在一次实验中完成最优条件筛选，同时通过上位机能实现高效自动化分析，结合数据分析筛选出电穿孔的最优条件，以最优条件进行细胞电穿孔，从而实现高质量地对心肌细胞的胞内电信号进行记录，有利于对细胞电生理现象进行更深入的研究。
附图说明
25.图1是微电极阵列传感器示意图；
26.图2是胞内外电信号调理模块图；
27.图3是电穿孔控制模块图；
28.图4是高通量细胞刺激控制及胞内外电信号检测分析系统结构示意图；
29.图5是高通量细胞刺激控制及胞内外电信号检测分析系统框图；
30.图6是金属屏蔽盒结构图；
31.图7是胞内外电信号调理电路的原理图；
32.图8是电穿孔控制电路的原理图；
33.图9是上位机控制软件的程序流程图；
34.图10是高通量细胞刺激控制及胞内外电信号检测分析系统的上位机主界面；
35.图11是高通量细胞刺激控制及胞内外电信号检测分析系统的采集胞外电信号结果图；
36.图12是高通量细胞刺激控制及胞内外电信号检测分析系统的采集胞内电信号结果图；
37.图中，排针1、参考电极2、细胞培养腔3、玻璃衬底4、pcb板5、工作电极6、胞内外电信号调理模块输出接线端子7、胞内外电信号调理电路8、电极阵列传感器排针插槽9、电穿孔控制模块排针插槽10、微电极阵列传感器11、胞内外电信号调理模块pcb基底12、胞内外电信号调理模块输出接线端子13、胞内外电信号调理模块电源接口14、通道控制电路15、电穿孔控制模块排针16、放大电路17、电穿孔控制模块电源接口18、电穿孔控制模块信号输入端19、电穿孔控制模块电源控制端20、电穿孔控制模块电源控制电路21、电穿孔控制模块pcb基底22、电穿孔控制模块各通道控制端23、金属屏蔽盖24、数据采集卡25、电源模块26、金属机箱27、折页五金28。
具体实施方式
38.当金属电极浸入到电解液中时，金属电极上的自由电子与电解液之中的离子将会发生移动，从而在电极和电解液界面形成电性相反的双层电荷，功能类似一个电容器，这种结构被称为双电层结构。电穿孔电路产生电子并通过电路传导将电荷转移到浸入细胞培养液或缓冲液中的金属电极上，由于细胞培养于微电极阵列上方，与金属电极直接接触，形成紧密耦合，电穿孔使金属电极产生电场变化，进一步对细胞的行为和生理活动产生影响。而细胞产生动作电位，细胞外离子浓度发生变化，导致电场变化使金属电极表面产生极化，双层电容器充放电，检测金属电极电信号的变化即可得到细胞胞外电信号的变化。当电穿孔使细胞处于一个瞬时高电场环境，高电场的环境会使细胞膜表面出现很多小孔，从而使金属电极能记录到细胞胞内电信号。
39.本发明提出了一种自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统，下面结合实例和附图予以详细的说明：
40.本发明的自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统，包括微电极阵列传感器11、胞内外电信号调理模块、电穿孔控制模块、数据采集卡25、金属屏蔽盒、上位机和电源模块26。
41.其中，如图1所示，微电极阵列传感器11包括工作电极6、参考电极2、pcb板5和细胞培养腔3。工作电极6为微电极阵列，本实施例中，采用的微电极直径10μm，间距40μm，内部引
线线宽5μm，外部引线线宽0.3mm，但不限于此。每个微电极与胞内外电信号调理电路8的输入端和电穿孔控制模块的输出端相连。本实施例中参考电极2直径为0.5mm的pt丝电极，但不限于此，置于细胞培养腔3里，与地相连。其中，采用玻璃筒体密封粘接在微电极阵列顶部作为细胞培养腔3。
42.其中，如图2
‑
6所示，胞内外电信号调理模块包括与微电极数目相同的多路胞内外电信号调理电路8，电穿孔控制模块包括与微电极数目相同的多路电穿孔控制电路，微电极、胞内外电信号调理电路、电穿孔控制电路一一对应，组成多通道系统。
43.所述胞内外电信号调理电路8均由依次连接的高通滤波电路、第一级放大电路、带通滤波器电路和第二级放大电路组成，具体地，如图7所示，所述高通滤波电路由相互连接的电容c2和电阻r5组成，电容c2的另一端作为胞内外电信号调理电路8的输入端，接收对应微电极采集的胞内外电信号，滤除频率为1hz以下的噪声，同时滤除直流成分，电阻r5另一端接地；电容c2和电阻r5连接处作为高通滤波电路输出端与所述第一级放大电路输入端连接。所述第一级放大电路由三电阻r1、r6、r9，一反馈电容c5和精密运放u1b组成，电阻r6连接在精密运放u1b的反向输入端和输出端之间，反馈电容c5与电阻r6并联，电阻r9连接精密运放u1b的反向输入端和地，电阻r1连接高通滤波电路输出端和精密运放u1b的正向输入端，另一端作为第一级放大电路输入端。其中，反馈电容c5的作用是相位补偿，防止精密运放u1b产生自激振荡。所述带通滤波器电路包括由c3和r7组成的rc高通滤波电路和由电阻r2、r3、低噪声运放u2b、电容c1和c4组成的巴特沃斯低通滤波电路，其中，低噪声运放u2b的正向输入端接电容c4和电阻r3的一端，电容c4另一端接地，电阻r3另一端接电容c1和电阻r2，电容c1另一端接低噪声运放u2b的输出端，电阻r2另一端接rc高通滤波电路输出端，低噪声运放u2b的输出端和反向输入端相连。所述第二级放大电路由三电阻r4、r8、r10、一反馈电容c6和精密运放u3b组成，电阻r8连接在精密运放u3b的反向输入端和输出端之间，反馈电容c6与电阻r8并联，电阻r10连接精密运放u3b的反向输入端和地，电阻r4连接带通滤波器电路输出端和精密运放u3b的正向输入端，精密运放u3b的输出端与数据采集卡25的模拟输入端相连，胞内外电信号调理模块的其他通道与前面所述的电路相同。
44.将上述电路相关的电子元器件焊接在胞内外电信号调理模块上，如图2所示，该模块的胞内外电信号调理模块pcb基底12上还包括另外31路相同的胞内外电信号调理电路8,构成32通道胞内外电信号调理模块,与图1中32个微电极相对应，在胞内外电信号调理模块有两个接线端子7、13，用排线与数据采集卡25相连，胞内外电信号调理模块有电源接口14，接电源模块26给的
±
5v电压。
45.作为优选，微电极阵列传感器11设置有排针1，胞内外电信号调理模块设置有相对应的向上的电极阵列传感器排针插槽9，排针1与对应的微电极相连，电极阵列传感器排针插槽9与对应的胞内外电信号调理电路8相连。
46.所述电穿孔控制电路由电源控制电路21、放大电路17、通道控制电路15组成，如图3所示，所述电源控制电路21如图8a所示，由电阻r13和r15、电容c8、电感l2、nmos管q5、pmos管q4组成，nmos管q5的栅极与数据采集卡25的数字输出端相连，同时与电阻r15相连到地，源极接地，漏极与pmos管q4的栅极相连，同时与电阻r13相连到电源输入power即电源模块，pmos管q4的源极与电源输入power即电源模块相连，漏极与电感l2相连，电感l2另一端接电容c8，形成lc滤波电路，滤波后为电源输出vcc，为放大电路17和通道控制电路15供电。通过
控制电源关断可以减少运放发热，当电穿孔时再开启电源。
47.放大电路17用于放大电穿孔信号，如图8b所示，运放u4a的正向输入端接电穿孔信号输入signal，反向输入端与电阻r14相连到地，同时与电阻r16相连到运放u4a的输出端，输出端为放大后的电穿孔信号输出pulse_in，电穿孔信号输入signal通过电穿孔控制模块信号输入端19与数据采集卡25的模拟输出端相连。
48.其中，放大电路17可以采用一通道或多通道运放组成，例如，四通道运放u4等。
49.通道控制电路15为控制开关，可以采用单独的控制开关或多通道控制开关，本实施例采用1:1四通道多路复用器ic1，同时在各通道均放置电压跟随器，可以提高脉冲的驱动能力，即使某些微电极没有细胞贴附分电流大，也不会减弱其它路径上脉冲的穿孔电流，分离多路脉冲的电穿孔显著提高了细胞的穿孔效率，系统检测通量得到提升。
50.如图8c所示，所述通道控制电路15由四通道运放u5、1:1四通道多路复用器ic1、电阻r18、r19、r20、r21组成，以运放的一通道u5a和多路复用器的一通道为例子，运放u5a反向输入端和输出端相连构成电压跟随器，运放u5a正向输入端接电穿孔信号输出pulse_in,输出端与一电阻r18相连，电阻r18另一端与多路复用器的一通道输入端s1相连，多路复用器的一通道输出端d1与微电极阵列传感器11的一微电极引出端相连，控制端sel1与数据采集卡25的数字输出端相连。同理，其他3通道采用相同方式连接。
51.多路复用器的输出端通过电穿孔控制电路模块电源控制端20与微电极传感器11的每个微电极引出端连接。
52.由此，包括32路电源控制电路21、8组四通道运放u4、8组通道控制电路15，各通道一一对应连接，将上述电路相关的电子元器件焊接在pcb基底22上，最终构成32通道电穿孔控制电路模块，电穿孔控制模块上还有电穿孔控制模块电源接口18，接电源模块26给的20v电压。
53.作为优选，电穿孔控制模块设置有电穿孔控制模块排针16，胞内外电信号调理模块设置有相对应的向下的排针插槽10，排针16与对应的电穿孔控制电路相连，排针插槽10与对应的微电极相连。
54.所述电源模块26用于为胞内外电信号调理模块提供
±
5v电源、电穿孔控制模块提供20v电源和数据采集卡25提供12v电源；电源模块26的输入端与12v电源连接，通过dc/dc芯片产生
±
5v电源，并设有控制开关控制
±
5v电源的打开和关闭，控制开关与数据采集卡25的数字输出口相连；通过dc/dc芯片产生20v电源。
55.作为优选，还包括金属屏蔽盒，如图5所示，所述金属屏蔽盒由金属机箱27、折页五金28和金属屏蔽盖24组成，金属屏蔽盒与地线相连，用于屏蔽外界的工频干扰、高频干扰。
56.本发明的胞内外电信号调理电路和电穿孔控制电路工作过程如下：当采集电信号时，数据采集卡25的数字输出端输出高电平，控制电源模块26的
±
5v电源开启，为胞内外电信号调理模块供电，细胞培养腔3中的细胞产生动作电位引起细胞外离子浓度发生变化，导致电场变化，微电极将电场变化传输到胞内外电信号调理电路8的输入端，细胞电信号经过高通滤波电路、一级放大电路、带通滤波器电路和二级放大电路，保证细胞电信号幅值足够大，最后被数据采集卡25模拟输入端采集，传输到上位机进行显示和存储。当进行电穿孔时，数据采集卡25的模拟输出端产生电穿孔脉冲信号，数据采集卡25的数字输出端输出高电平，电穿孔控制电路的多路复用器导通，使得该通道能产生电穿孔信号，若数据采集卡25
的数字输出端输出低电平，电穿孔控制电路的多路复用器断开，该通道无法产生电穿孔信号。细胞经过电穿孔后，此时微电极记录的是胞内电信号，同样经过胞内外电信号调理电路8进行放大滤波被数据采集卡25采集。
57.自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统，其工作流程如图9所示，具体包括如下步骤：
58.步骤一、在微电极阵列传感器11内放入有心肌细胞及其培养液，将微电极阵列传感器11插到胞内外电信号调理模块上，用金属屏蔽盖24将微电极阵列传感器11罩住。
59.步骤二、启动上位机软件，设置好自动遍历的电穿孔信号幅值、频率和脉宽范围，以及电穿孔持续时间后，控制逐通道产生不同条件电穿孔信号，同时对心肌细胞胞内电信号进行记录，绘制并显示电信号图。
60.步骤三、对采集到的胞内电信号进行分析，得到最优的电穿孔条件。
61.步骤四、上位机重新控制所有通道产生最优条件电穿孔信号，对心肌细胞胞内电信号进行记录和存储，并实时显示采集到的胞内电信号图。
62.下面给出本发明的应用案例。
63.自动化电穿孔调控筛选的胞内外电生理记录系统与方法主要用于心肌细胞胞内电信号自动化的检测。首先将电穿孔控制模块安装到胞内外电信号调理模块底下，连接各模块之间的连线，将心肌细胞及其培养液加入细胞培养腔3中，将微电极阵列传感器11插入到插槽9中，用金属屏蔽盖24将微电极阵列传感器11罩住，打开上位机，进入主界面如图10所示，点击开始，上位机会先遍历不同频率、幅值和脉宽的电穿孔条件，如图11
‑
12所示，选出电穿孔的最优条件，再以电穿孔的最优条件进行电穿孔，进行心肌细胞胞内电信号采集。当完成细胞电信号采集时，打开金属屏蔽盖24，将微电极阵列传感器11取出，实验即结束。
64.本发明采用微电极阵列，研制高质量心肌胞内电生理记录的高效自动化电穿孔调控筛选系统与方法，能根据需求对不同的通道对细胞施加可控的电穿孔，也能检测细胞电生理现象的变化以及电信号的具体参数。通过控制各通道逐一产生电穿孔，提高了细胞电穿孔的效率，通过上位机能实现高效自动化分析，通过遍历不同的电穿孔条件，结合数据分析找出电穿孔的最优条件，从而实现高质量地对心肌细胞的胞内电信号进行记录。
65.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。